寧禮信，周敏，黎子林，蘇水嬌，高志城，張任廣

1. 廣東省科學(xué)院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學(xué)測量與應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省原位電離質(zhì)譜分析工程技術(shù)研究中心（廣州 510070）；2. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院粵港澳大灣區(qū)研究院（中山 528437）

食品安全是一直以來備受關(guān)注的話題[3]，菌落總數(shù)又是評價食品衛(wèi)生狀況的一項重要指標(biāo)[4-5]，因此對食品中菌落總數(shù)進(jìn)行測量不確定度的評價[6-10]非常必要。國際上對各種食品中菌落總數(shù)不確定度的測量都有豐富經(jīng)驗(yàn)，但對生食水產(chǎn)品中菌落總數(shù)不確定度的評定研究較少，試驗(yàn)依據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[1]檢測三文魚刺身樣品的菌落總數(shù)，按照J(rèn)JF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[2]規(guī)范分析檢測結(jié)果不確定度的來源并建立數(shù)學(xué)模型，分別對引入的不確定度分量進(jìn)行評定，以合成計算的方法評定菌落總數(shù)的不確定度[11-13]，通過有效評定菌落總數(shù)測定結(jié)果的不確定度，進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)室檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和可靠性。

1 材料與檢測方法

1.1 測試樣品

研究測量不確定度評定實(shí)例為單一樣品的重復(fù)測量，測試樣品為三文魚刺身。即食生制動物性水產(chǎn)品的微生物限量應(yīng)符合GB 10136—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性水產(chǎn)制品》[14]，該標(biāo)準(zhǔn)采取的是三級采樣方案，其菌落總數(shù)的限值為n=5，c=2，m=5×104CFU/g，M=105CFU/g，即：在5個樣品中，允許全部樣品中相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值≤5×104CFU/g；允許有≤2個樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值在5×104CFU/g和5×105CFU/g之間；不允許有樣品相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值大于105CFU/g。根據(jù)已有檢測經(jīng)驗(yàn)，三文魚菌落總數(shù)的稀釋度確定為10-1，10-2和10-3這3個稀釋度。

1.2 材料與設(shè)備

平板計數(shù)瓊脂（250 g，北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；電子天平（T1000Y，常熟市雙杰測試儀器廠）；萬級潔凈實(shí)驗(yàn)室；高壓蒸汽滅菌器（HVA-110，日本Hirayama公司）；潔凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；生化培養(yǎng)箱（1400型，新西蘭 Contherm Scientific Ltd.）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 檢測依據(jù)

菌落總數(shù)測定根據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[1]。

1.3.2 檢測過程

以無菌操作將25 g檢樣生食水產(chǎn)品（三文魚刺身）放于盛有225 mL滅菌生理鹽水無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制成1∶10的均勻稀釋液。用1 mL無菌吸管吸取1 mL 的1∶10樣品勻液，沿管壁緩慢注入含有9 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管，混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。另取1 mL滅菌吸管，按上述操作方法，制備10倍遞增稀釋勻液，如此每遞增稀釋1次，即換用1支1 mL滅菌吸管。根據(jù)對樣品污染情況的估計，選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時，吸取1 mL樣品勻液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做2個平皿。同時，分別吸取1 mL空白稀釋液加入2個無菌平皿內(nèi)做空白對照。樣品勻液移入培養(yǎng)皿后，應(yīng)及時將冷卻至48 ℃平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿15～20 mL，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，置30±1 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72±3 h。記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。

1.3.3 菌落計數(shù)

選取菌落數(shù)在30～300 CFU、無蔓延菌落生長的平板作為菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用2個平板平均數(shù)。其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平板內(nèi)上出現(xiàn)菌落間無明顯界線鏈狀生長時，則應(yīng)將每條鏈作為1個菌落計數(shù)。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型

當(dāng)只有一個稀釋度平板上的菌落在計數(shù)范圍內(nèi)，按式（1）計算。當(dāng)有2個連續(xù)的稀釋度平板上的菌落在計數(shù)范圍內(nèi)，則按式（2）計算。

式中：N為檢測樣品中的菌落總數(shù)；∑C為平板菌落總數(shù)的和，CFU/g；n1為低稀釋倍數(shù)平板個數(shù)；n2為高稀釋倍數(shù)平板計數(shù)；d為稀釋因子（第一稀釋度）。

2 測量不確定度評定

菌落總數(shù)不確定度測量除各種系統(tǒng)因素的影響外，還包括隨機(jī)因素的影響[15]。主要對樣品制備過程中引入的不確定度及重復(fù)測量時引入的不確定度進(jìn)行分析。

2.1 樣品制備過程中引入的不確定度—

2.1.1 天平引入的不確定度

試驗(yàn)所使用的天平最大稱量為1 000 g，檢定分度值為1 g，實(shí)際分度值為0.1 g，根據(jù)JJG 1036—2008《中華人民共和國計量檢定規(guī)程：電子天平》[16]規(guī)定，此類天平在0～500 g稱量范圍時的允許誤差為±0.5 g，按矩形分布，，天平稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

2.1.2 量筒引入的不確定度

試驗(yàn)所使用量筒為250 mL，根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[17]規(guī)定250 mL量筒容量允許誤差為±2.0 mL，根據(jù)CNAS-GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[18]，按三角分布處理，即，量筒引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為Urel(量筒)=。

2.1.3 樣品稀釋過程引入的不確定度

樣品稀釋時使用1 mL和10 mL這2種移液槍，用1 mL移液槍吸取1 mL的不同稀釋度溶液，用9 mL移液槍吸取9mL無菌生理鹽水，按照J(rèn)JG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[19]，量取1 mL和9 mL液體時，容量允許誤差分別是±1.0%和±0.6%，取矩形分布，，移液槍引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。試驗(yàn)取3個連續(xù)稀釋度（10-1，10-2和10-3），樣品稀釋過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.012 1。

2.2 重復(fù)測量時引入的不確定度

同一樣品重復(fù)測量10次，取其平均值作為測量結(jié)果，見表1。

表1 10次重復(fù)測量的平皿計數(shù)結(jié)果

結(jié)果數(shù)據(jù)發(fā)散性大，用常規(guī)的直接根據(jù)平均值得到標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法顯得有些不合理。通常的做法是取對數(shù)以后再用常規(guī)的貝塞爾方法進(jìn)行計算。

表2 單一樣品重復(fù)測量的計算過程

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度

2.4 僅考慮重復(fù)測量引入的不確定度

平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為μc(lgx)=Urel(菌落)=0.134 6。95%置信概率下包含因子k取2，其擴(kuò)展不確定度為U=k×μc(lgx)=2×0.134 6=0.27。取反對數(shù)，由lgx坐標(biāo)回到x坐標(biāo)。由于lgx與x之間的非線性關(guān)系，不能直接求擴(kuò)展不確定度U的反對數(shù)，只能給出微生物含量的可能區(qū)間。因此確定lgx的取值范圍lgx=4.16±0.27，或?qū)懗?.89≤lgx≤4.43。取反對數(shù)后，仍可得7.8×103CFU/g≤x≤2.7×104CFU/g。

2.5 不確定度報告

按照GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[1]規(guī)定的檢測程序進(jìn)行，被測樣品微生物菌落總數(shù)（10次測量平均值）在7.8×103～2.7×104CFU/g之間。

3 結(jié)論

菌落總數(shù)是食品微生物檢驗(yàn)的常規(guī)項目之一，不同產(chǎn)品有不同的菌落總數(shù)限量標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)結(jié)果處于臨界值時，取值區(qū)間就顯得尤為重要[20]。由于菌落總數(shù)檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)發(fā)散性較大，不符合正態(tài)分布，不適用于直接計算其標(biāo)準(zhǔn)差，因此需取其對數(shù)后進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，利用貝塞爾公式計算標(biāo)準(zhǔn)不確定度，最終合成菌落總數(shù)測定的不確定度，以進(jìn)一步減少各方面引入的誤差，使檢測結(jié)果更加接近真值[21]。從研究結(jié)果看，重復(fù)測量結(jié)果中最大值和最小值相差約4倍，發(fā)散較大，與其相比，其他不確定因素都可以忽略，因此僅考慮由測量結(jié)果發(fā)散引入的不確定度即可。應(yīng)用不確定度分析和評定能夠更加了解動物性水產(chǎn)制品菌落總數(shù)測定過程中的誤差來源，減少測試人員在試驗(yàn)過程中由于操作不當(dāng)對檢測結(jié)果造成的影響，在結(jié)果處于超標(biāo)臨界值時發(fā)揮一定的判定作用，確保檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性、科學(xué)性和客觀性。