劉 佳，周亞梅，張瀟丹，李佩紋，徐冬梅

（重慶化工職業(yè)學(xué)院，重慶 401220）

中醫(yī)學(xué)包含著中華民族幾千年的康養(yǎng)理念和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，是中華文明的瑰寶，凝聚著中國(guó)人民和中華民族的博大智慧。習(xí)近平總書記強(qiáng)調(diào)，要遵循中醫(yī)藥發(fā)展規(guī)律、傳承精華、守正創(chuàng)新，加快推進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化，堅(jiān)持中西醫(yī)并重，推動(dòng)中醫(yī)藥和西醫(yī)藥相互補(bǔ)充、協(xié)調(diào)發(fā)展，推動(dòng)中醫(yī)藥事業(yè)和產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展，推動(dòng)中醫(yī)藥走向世界，充分發(fā)揮中醫(yī)藥防病治病的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和作用，為建設(shè)健康中國(guó)、實(shí)現(xiàn)中華民族偉大復(fù)興的中國(guó)夢(mèng)貢獻(xiàn)力量。從國(guó)家戰(zhàn)略角度說(shuō)明了中藥研究的重要性。

多糖為中藥有效成分之一，廣泛存在于各種動(dòng)、植物和微生物組織中[1]。研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有抗癌、抗腫瘤、抗衰老、抗艾滋病、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等作用[2]。以糖為研究重點(diǎn)的工程被認(rèn)為是繼基因工程、蛋白質(zhì)工程之后生物化學(xué)和分子生物學(xué)中最重要的研究領(lǐng)域。我國(guó)對(duì)中藥多糖的研究范圍涉及多糖的化學(xué)研究、藥理學(xué)研究、治療作用等，尤其在抗腫瘤方面成為一個(gè)新熱點(diǎn)，將多糖與核酸和蛋白質(zhì)并列為生命現(xiàn)象中三大重要的高分子化合物。牛膝（Achyranthes bidentata Blume） 為莧科多年生草本植物的干燥根，是中國(guó)藥典收錄的常用中藥，具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行等功效[3]，有懷牛膝和川牛膝之分。懷牛膝主要分布在河南、河北等地。川牛膝主要分布在四川、云南等地。懷牛膝是“四大懷藥”之一，含有多種化學(xué)成分，包括皂苷、甾酮類、多糖類和多種微量元素[4]。懷牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharides，ABP） 是其重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，在臨床應(yīng)用和保健品中具有很大的開(kāi)發(fā)潛力。

常見(jiàn)的中藥提取方法有傳統(tǒng)熱水浸提法、蒸汽爆破法、微波輔助提取法和超聲輔助提取法等[5]。傳統(tǒng)熱水浸提法存在有效成分損失大、工序復(fù)雜、提取周期長(zhǎng)、提取率低等缺點(diǎn)[6]。蒸汽爆破法需要高壓蒸汽，操作復(fù)雜。微波射線穿透性極好，能充分保護(hù)有效成分，對(duì)熱敏性成分的浸提極為有效[7]。相比超聲提取來(lái)說(shuō)，微波提取具有選擇性好、操作簡(jiǎn)便、提取周期短、能耗低、提取率高等特點(diǎn)，故微波提取在藥物成分提取中得到廣泛應(yīng)用。因此，采用微波提取法對(duì)ABP 進(jìn)行提取，有望減少ABP 破壞和損失，提高ABP 得率。響應(yīng)曲面法（Response surface methodology，RSM） 是通過(guò)多元二次回歸方程來(lái)擬合自變量因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，并利用軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)結(jié)果，從而優(yōu)化工藝參數(shù)的方法。目前已廣泛應(yīng)用于中藥組分提取過(guò)程的優(yōu)化中[1]。

為此，擬通過(guò)微波提取法提取ABP，并用相應(yīng)面法優(yōu)化微波提取工藝，確定各因素及其交互作用對(duì)ABP 得率的影響，找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和提取率的最優(yōu)值，得到最佳提取工藝條件，以提高ABP 得率。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

懷牛膝，產(chǎn)自河北安國(guó)市，祁澳中藥飲片有限公司提供；苯酚（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司提供；葡萄糖（分析純），天津市北辰方正試劑廠提供；濃硫酸（分析純），河北省保定化學(xué)試劑廠提供；其余試劑均為分析純。

722 型植物粉碎機(jī)、722 型分光光度計(jì)，上海青華科技儀器有限公司產(chǎn)品；AB204-N 型電子天平；SHZ-D 型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司產(chǎn)品；微波爐（LG）；水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 懷牛膝多糖的微波提取

懷牛膝，干燥粉碎，過(guò)60 目篩。分別稱取1 g牛膝干粉，按照不同的料液比加蒸餾水溶解，在不同的微波條件下進(jìn)行提取，然后將提取液真空抽濾、減壓濃縮并定容至100 mL。

采用傳統(tǒng)熱水浸提法和超聲輔助提取法做對(duì)比。稱取0.5 g 牛膝牛粉末于1 支試管中，加入15 mL 蒸餾水（即按照最佳微波提取條件的按料液比1∶30（g∶mL），在超聲功率為60 W，超聲溫度為40 ℃的條件下，超聲時(shí)間30 min，得到超聲提取液，定容后測(cè)其提取率。稱取10 g 牛膝粉末溶解在300 mL水中（按料液比1∶30 mL/g），在80 ℃的水浴鍋中浸提 8 h，得到懷牛膝的水煮提取液，測(cè)其得率。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定及得率的計(jì)算

采用硫酸- 苯酚法測(cè)定懷牛膝可溶性總糖含量[8-9]。吸取100 μg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL 各補(bǔ)水至2.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL 和濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻，在室溫下放置20 min，于波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度C（mg/mL） 為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用3,5 - 二硝基水楊酸比色法（DNS） 法測(cè)定多糖中還原糖的含量[8-9]。分別吸取10 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1，2，3，4，5，6，7 mL 于10 mL 的比色管中，補(bǔ)蒸餾水至10 mL，即得質(zhì)量濃度為1，2，3，4，5，6，7 mg/mL 的葡萄糖溶液。分別吸取上述葡萄糖溶液1 mL 于25 mL 的容量瓶中，加入3,5 -二硝基水楊酸溶液2 mL，置沸水浴中煮2 min 進(jìn)行顯色，然后用流水迅速冷卻，用水定容到25 mL，搖勻，以試劑空白作參比，在最大吸收波長(zhǎng)為540 nm處測(cè)其吸光度，并以質(zhì)量濃度C（mg/mL） 為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總糖及還原糖的含量計(jì)算方法如下公式計(jì)算：

含量（%）=

多糖含量=總糖含量- 還原糖含量[8-9].

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究微波提取功率、時(shí)間、料液比和提取次數(shù)等因素對(duì)ABP 提取的影響。通過(guò)因素分析，確定其條件范圍。

1.2.4 響應(yīng)面法分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取功率、提取時(shí)間、料液比及提取次數(shù)為自變量，以ABP 得率為響應(yīng)值，采用Design Expert 統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面法安排試驗(yàn)，根據(jù)中心組合（Box-behnken） 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，確定微波法提取ABP 的最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用硫酸- 苯酚法測(cè)定懷牛膝可溶性總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

采用3,5 - 二硝基水楊酸比色法（DNS） 法測(cè)定多糖中還原糖的含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波提取功率的影響

在料液比為1∶50，微波時(shí)間為2 min 條件下，提取1 次，比較不同微波功率ABP 得率的影響，選擇最佳功率。

不同提取參數(shù)對(duì)ABP 得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同提取參數(shù)對(duì)ABP 得率的影響

由圖2（a） 可知，隨微波功率的增加，ABP 得率迅速增大。但當(dāng)功率超過(guò)800 W 后，ABP 得率下降。這可能是因?yàn)殡S著提取功率的增加，提取率提高，但提取功率更大以后，產(chǎn)生的多糖會(huì)被降解和氧化。所以確定ABP 的最佳微波功率為800 W。微波提取功率對(duì)ABP 的提取率有顯著的影響。

2.1.2 微波提取時(shí)間的影響

固定料液比為1∶50，提取功率為800 W，提取1 次，比較不同微波提取時(shí)間對(duì)ABP 得率的影響，選擇最佳微波提取時(shí)間。由圖2（b） 可知，隨微波提取時(shí)間的增加，ABP 得率迅速增大。但超過(guò)2.5 min 后，ABP 得率下降。這可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加，細(xì)胞被均勻破壞，并加速了ABP 在水中的釋放和擴(kuò)散。但提取時(shí)間更長(zhǎng)以后，產(chǎn)生的ABP會(huì)被降解或氧化。所以確定ABP 的最佳提取時(shí)間為2.5 min。微波提取時(shí)間對(duì)ABP 的提取有顯著影響。

2.1.3 料液比的影響

固定提取時(shí)間2.5 min 及功率800 W 條件下，選擇料液比為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g∶mL） 各提取1 次，根據(jù)ABP 得率確定最佳料液比。由圖2（c） 可知，隨著料液比的增加，ABP 得率增大，但超過(guò)料液比超過(guò)1∶30（g∶mL） 之后，ABP 得率下降。這可能是因?yàn)檩^大的料液比中多糖從內(nèi)部細(xì)胞擴(kuò)散至外部溶劑的速率更快，料液比更大以后，附著在單位體積上的微波能量會(huì)降低，導(dǎo)致提取率降低。所以，確定提取ABP 的最佳料液比為1∶30（g∶mL）。

2.1.4 提取次數(shù)的影響

在固定上述各因素最佳條件下，測(cè)定提取1 次的ABP 得率，再將抽濾所得的沉淀全部轉(zhuǎn)移至1 個(gè)燒杯中，重復(fù)以上操作。依次測(cè)得提取2，3 次樣品中多糖含量，記錄結(jié)果，得出最佳提取次數(shù)。由圖2（d） 可知，隨著提取次數(shù)的增加，ABP 得率增大，但當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到2 次之后，ABP 得率增加的趨勢(shì)有所平緩?？紤]到節(jié)約資源和能源，選擇ABP 最佳提取次數(shù)為2 次。

2.2 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)

2.2.1 微波法提取牛膝多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

微波法提取懷牛膝多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 微波法提取懷牛膝多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

2.2.2 微波法提取牛膝多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

微波法提取懷牛膝多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 微波法提取懷牛膝多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2 可知，利用Minitab 軟件對(duì)表2 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，以A=(a-800)/200，B=(b-2.5)/0.5，C=(c-30)/10，D=(d-2)/1 為自變量，以多糖產(chǎn)率為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。得到牛膝多糖提取率對(duì)編碼自變量的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

Y=29.37-0.83A-0.18B+0.39C-0.31D-0.81AB+0.000AC+1.07AD+1.22BC-1.5BD-2.83CD-3.54A2-3.66B2-4.22C2-5.52D2.

對(duì)多元二次回歸方程取一階偏導(dǎo)得零，得到A=-0.127 8，B=0.013 1，C=0.068 1，D=-0.059 7 代入A=(a-800)/200，B=(b-2.5)/0.5，C=(c-30)/10，D=(d-2)/1，得a=774，b=2.5，c=31，d=2。為檢驗(yàn)Boxbehnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，將上述優(yōu)化出的工藝參數(shù)修正為微波功率800 W，提取時(shí)間2.5 min，料液比1∶30（g∶mL），提取次數(shù)2 次?；貧w方程的R2=0.869 3，相關(guān)系數(shù)R=0.932 3，說(shuō)明模型響應(yīng)值的變化93.23%來(lái)自所選參考變量。因此，回歸方程可較好地描述因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析

由表3 可知，試驗(yàn)因子與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。整體模型的p<0.01，表明該二次方程模型具有高度顯著性，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，能夠擬合真實(shí)的試驗(yàn)結(jié)果。各因素對(duì)多糖產(chǎn)率的影響是A>C>D>B，即功率影響最大，其次是料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間。

2.2.3 微波法提取牛膝糖響應(yīng)曲面直觀分析

微波功率、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對(duì)ABP 產(chǎn)率的交互影響曲面圖見(jiàn)圖3。

圖3 提取功率、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對(duì)ABP 產(chǎn)率的交互影響曲面圖

圖3 是通過(guò)多元回歸方程所做的響應(yīng)曲面圖及等高線圖，所擬合的響應(yīng)曲面及等高線圖能比較直觀地反映各因素和各因素間的交互作用。由圖3 可知，6 個(gè)響應(yīng)曲面均為開(kāi)口向下的凸型曲面，同時(shí)等高線最小橢圓的中心在所選的范圍內(nèi)，說(shuō)明響應(yīng)值（牛膝多糖提取率） 在4 個(gè)因子設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)存在最大值。比較幾個(gè)圖可以看出微波功率（A） 對(duì)響應(yīng)值的影響比較大，表現(xiàn)為Y 值的變化比較大。圖3（e） 表明B、D 的交互作用顯著，在所選范圍內(nèi)，B取不同的編碼值時(shí)D 對(duì)Y 的影響表現(xiàn)出不同的規(guī)律，同樣D 取不同的編碼值時(shí)B 對(duì)Y 的影響規(guī)律也呈一定的變化趨勢(shì)。從單個(gè)因素對(duì)Y 值的影響來(lái)看，D的影響顯著性要大于B。圖3（f） 表明C、D 的交互作用最顯著，在所選范圍內(nèi)，C 取不同的編碼值時(shí)D對(duì)Y 的影響表現(xiàn)出不同的規(guī)律，同樣D 取不同的編碼值時(shí)C 對(duì)Y 的影響規(guī)律也呈一定的變化趨勢(shì)。從單個(gè)因素對(duì)Y 值的影響來(lái)看，C 的影響顯著性要大于D。由圖3（a） 可以看出A 與B 的交互作用并不顯著，它們對(duì)Y 值的影響規(guī)律并不會(huì)隨著另一因素的改變而有明顯變化。同時(shí)也可以看出A 對(duì)Y 值影響的顯著性要大于B。圖3（b） ~ 3（d） 也表現(xiàn)出與圖3（a） 相似的規(guī)律。綜合各圖，4 個(gè)因素對(duì)Y值的影響，以及各因素之間的交互影響與回歸分析結(jié)果吻合。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

在響應(yīng)面方法優(yōu)化得到的最佳條件下對(duì)牛膝進(jìn)行3 次平行微波提取試驗(yàn)，平均產(chǎn)率為29.40%，與理論預(yù)測(cè)值29.38%相比，相對(duì)誤差為0.07%，驗(yàn)證值與回歸方程所預(yù)測(cè)值相吻合得很好，驗(yàn)證了此模型的可行性。

2.3 提取方法對(duì)牛膝多糖產(chǎn)率的影響

擬合模型獲得的試驗(yàn)結(jié)果與常規(guī)方法的試驗(yàn)結(jié)果比較見(jiàn)表4。

表4 擬合模型獲得的試驗(yàn)結(jié)果與常規(guī)方法的試驗(yàn)結(jié)果比較

由表4 可知，ABP 產(chǎn)率為微波提取> 超聲提取>熱水浸提法，微波輔助提取遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于常規(guī)熱水浸提法，也明顯優(yōu)于超聲輔助提取。這些結(jié)果表明微波提取懷牛膝多糖的優(yōu)越性。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平的Box-behnken 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用多元二次回歸模型對(duì)各項(xiàng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得最優(yōu)的條件為微波功率800 W，提取時(shí)間2.5 min，料液比為1∶30（g∶mL），提取次數(shù)為2 次，牛膝總多糖提取率的理論值為29.38%。按最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，牛膝多糖的產(chǎn)率為29.40%，與理論值的相對(duì)誤差為0.07%，對(duì)工業(yè)提取牛膝多糖有一定的指導(dǎo)意義。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用微波提取工藝提取牛膝中的多糖提取率優(yōu)于超聲提取法、常規(guī)熱水浸提工藝，微波輔助法適用于提取ABP。