李永順，謝嘉嘉，周繼紅，張立，陳樹超，歐陽子琛

1. 廣州中醫(yī)藥大學第七臨床醫(yī)學院，廣東 深圳 518133

2. 深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院肺病科，廣東 深圳 518133

肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，在2021 年全球癌癥統(tǒng)計中，肺癌仍是死亡人數(shù)最多的癌癥，在所有惡性腫瘤死亡病例中，約1/4 是肺癌導致的[1]，而非小細胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌的75%[2]。雖然目前肺癌的治療手段日益增多，包括手術切除、靶向治療、免疫治療、化療等，但治療效果仍不盡人意，5 年生存率極低[3]。

肺癌歸屬于中醫(yī)肺積范疇，現(xiàn)代醫(yī)家多認為其病因病機與濕、毒、痰、瘀等相關[4]。桔梗為常見藥食兩用的藥材，味辛、苦，性平，歸肺經(jīng)，具有宣肺祛痰、利咽排膿的功效[5]，臨床多用于治療肺系疾病?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)桔梗相關成分可以有效抑制肺癌細胞的生長增殖并誘導其凋亡[6]。魚腥草味辛，微寒，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、消癰排膿的功效[5]，為治療肺系疾病的常用藥物之一?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，魚腥草及其活性成分對多種腫瘤細胞的生長增殖有抑制作用[7]，可以明顯降低苯并芘誘導的DNA損傷及炎癥反應，從而預防肺癌的發(fā)生發(fā)展，并且推斷魚腥草可能是預防及治療肺癌的有效候選藥劑[8]。臨床上使用桔梗-魚腥草配伍治療NSCLC 療效頗佳[9-10]。但目前尚無關于桔梗-魚腥草治療NSCLC的機制研究。本研究通過網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合GEO 數(shù)據(jù)挖掘以及分子對接技術探究桔梗-魚腥草藥對治療NSCLC 的抗腫瘤成分及作用機制，為后續(xù)的臨床應用和藥物研究提供思路。

1 方法

1.1 搜集桔梗-魚腥草活性成分與作用靶點在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）http：//tcmspw.com./tcmsp.php[11]以桔梗、魚腥草為關鍵詞檢索相關化學成分，以口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 作為活性成分的篩選標準[12-13]，提取篩選出的活性成分及活性成分對應的藥物作用靶點。最后使用Uniport 蛋白數(shù)據(jù)庫http：//www.uniprot.org/[14]將藥物作用靶點名稱統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因名。

1.2 NSCLC 數(shù)據(jù)集的獲取及差異分析在GEO 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nim.nih.gov/geo/）檢索NSCLC 相關數(shù)據(jù)集，以樣本量大于20，同時包含正常樣本和疾病樣本作為篩選條件，并對數(shù)據(jù)集進行質(zhì)量控制和主成分分析，保證得到的數(shù)據(jù)集可用于差異分析。隨后使用R 軟件對篩選得到的數(shù)據(jù)集進行歸一化處理及差異分析，以|log2FC|≥1，adj.P＜0.05 為篩選標準得到差異表達基因（DEGs）。

1.3 NSCLC 相關靶點和藥物-疾病共同靶點的獲取在GenCards 數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）[15]和OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）以“Non-Small Cell Lung Cancer”為檢索詞搜集NSCLC 已證實的靶點[16]，并與差異表達基因合并，得到盡可能多的疾病相關靶點。再利用韋恩圖工具對藥物作用靶點和疾病相關靶點取交集得到藥物-疾病共同靶點。

1.4 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡構建將桔梗-魚腥草、活性成分以及藥物-疾病共同靶點三者對應信息導入Cytoscape3.9.0 軟件進行網(wǎng)絡構建，并對網(wǎng)絡的拓撲屬性進行分析，利用網(wǎng)絡拓撲屬性篩選出“核心成分”，一般來說度值越大的節(jié)點在網(wǎng)絡中重要程度越大[17]。

1.5 靶點網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選將藥物-疾病共同靶點導入String 平臺（https：//cn.string-db.org/）進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析[18]，并將結(jié)果導入Cytoscape3.9.0 軟件進行可視化和網(wǎng)絡拓撲分析，通過度值大小篩選出“核心靶點”。

1.6 GO及KEGG富集分析將共同靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫（http：//metascape.org/），進行基因本體（GO）中的生物過程（BP）、細胞成分（CC）及分子功能（MF）3 類富集分析和KEGG 通路富集分析。然后使用微生信在線工具（http：//www.bioinformatics.com.cn）對結(jié)果進行可視化分析。

1.7 分子對接驗證將PPI 網(wǎng)絡和藥物-活性成分-疾病網(wǎng)絡選取出的核心靶點與核心成分進行分子對接。在PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）[19]下載核心靶點的3D 結(jié)構，并通過PyMol 軟件對其進行預處理。從PubChem 數(shù)據(jù)庫下載核心成分的SDF 格式文件并轉(zhuǎn)化為PDB 格式。最后使用AutoDock 軟件將核心成分和核心靶點蛋白進行分子對接，根據(jù)結(jié)合能大小判斷結(jié)合強度，小于-5.0 kcal/mol 表示配體和受體有較好的結(jié)合力，小于-8.0 kcal/mol 表示有強烈的結(jié)合力[20]。最后使用PyMol 軟件對結(jié)合能＜-8.0 kcal/mol的結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 桔梗-魚腥草化學成分及作用靶點見表1。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出藥物活性成分7 個，作用靶點176 個，其中桔?；钚猿煞? 個，魚腥草活性成分3 個，活性成分包括槲皮素、木犀草素、金合歡素、菠菜甾醇、異索馬酮、山奈酚和順式-二氫槲皮素。

表1 桔梗-魚腥草藥對活性成分

2.2 數(shù)據(jù)集差異分析見圖1。篩選得到GSE27262數(shù)據(jù)集，其包含25 例正常肺組織樣本和25 例NSCLC 肺組織樣本。運用R 語言對GSE27262 數(shù)據(jù)集進行質(zhì)量控制，選擇其中的RLE 箱線圖進行展示（圖1a），結(jié)果表明：GSE27262 數(shù)據(jù)集芯片間具有較好的一致性，可以用于進行差異基因分析。主成分分析顯示NSCLC 組和正常對照組，組內(nèi)距離較近，組間距離較遠，2 組樣本間無明顯交集，有較好的可比性（圖1b）。同時為去除各樣本間批次效應，進行差異分析前對數(shù)據(jù)集進行歸一化處理（圖1c 為歸一化前，圖1d 為歸一化后）。最終差異分析一共獲得1 860 個DEGs，其中744 個上調(diào)基因，1 116 個下調(diào)基因，并繪制火山圖（圖1e）和熱圖（圖1f）。

圖1 GSE27262 數(shù)據(jù)集差異分析

2.3 NSCLC 疾病相關靶點與藥物-疾病共同靶點見圖2。在GenCards 數(shù)據(jù)庫共收集到NSCLC 相關靶點5 803 個，通過“Reverance.score≥10”篩選有4 024 個。OMIM 數(shù)據(jù)庫獲得656 個靶點。二者與差異表達基因合并，刪除重復值，共得到疾病靶點4 783 個，再與藥物作用靶點取交集得到139 個桔梗-魚腥草治療NSCLC 的潛在靶點。

圖2 桔梗-魚腥草與NSCLC 共同靶點韋恩圖

2.4 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡分析見表2、圖3。運用Cytoscape3.9.0 軟件構建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖。網(wǎng)絡中度值越高則節(jié)點越大顏色越深。選取度值前3 的活性成分作為核心成分，分別為：槲皮素、木犀草素、山奈酚，其中槲皮素可作用于85 個靶點，網(wǎng)絡度最好。

表2 桔梗-魚腥草活性成分網(wǎng)絡度

2.5 PPI 網(wǎng)絡分析見圖4。通過String 平臺構建藥物-疾病共同靶點PPI 網(wǎng)絡，利用Cytoscape 3.9.0 軟件進行可視化和網(wǎng)絡拓撲分析。網(wǎng)絡中節(jié)點度值越大，其形狀越大顏色越藍，在網(wǎng)絡中的作用越重要，最為可能是桔梗-魚腥草治療NSCLC 的核心靶點。選取度值前5 的作為核心靶點，分別為：TP53、AKT1、JUN、TNF、EGFR，其中TP53 的度值最高。

圖4 桔梗-魚腥草與NSCLC 共同靶點PPI 網(wǎng)絡

2.6 GO 功能富集分析見圖5。將桔梗-魚腥草與NSCLC 的139 個共同靶點使用Metascape 進行GO 富集的BP、CC 和MF 3 種分析，共得到2 281 條相關條目，其中生物過程（BP）條目2 044 個，分子功能（MF）條目157 個，細胞組成（CC）條目80 個。根據(jù)P＜0.01，取排名前10 位的富集條目進行展示。分析發(fā)現(xiàn)其生物過程主要包括：細胞凋亡、細胞死亡正向調(diào)控、細胞群增殖負向調(diào)控、對創(chuàng)傷的反應、對脂多糖的反應等。分子功能主要包括：轉(zhuǎn)錄因子合成、蛋白激酶合成、蛋白同質(zhì)化活性、細胞因子受體結(jié)合、核受體活性、激酶調(diào)節(jié)器活性、蛋白激酶活性、絲氨酸水解酶活性等。細胞組成主要包括：膜筏、囊泡腔、細胞外基質(zhì)、細胞器外膜、受體復合物、蛋白激酶復合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復合體等。

圖5 GO 富集分析

2.7 KEGG 富集分析見表3、圖6。通過Metascape數(shù)據(jù)庫對藥物-疾病共同靶點進行KEGG 分析，以P＜0.05 作為篩選標準得到326 條信號通路。選取富集程度最高的10 條通路，進行氣泡圖展示。

圖6 KEGG 信號通路富集分析

表3 藥物-疾病靶點KEGG 信號通路富集分析

2.8 分子對接結(jié)果見表4、圖7。將選取的核心成分與核心靶點進行分子對接，結(jié)果顯示結(jié)合能均小于0。使用PyMol 軟件，選擇結(jié)合能＜-8.0 kcal/mol的結(jié)果進行可視化。

圖7 分子對接結(jié)果圖

表4 核心成分與核心靶點分子對接親和力kcal/mol

3 討論

本研究通過構建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖，得到桔梗-魚腥草核心成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠下調(diào)SRC 基因的表達，從而阻斷Fn4/NF-kappaB 信號通路，減少NSCLC 的增殖和轉(zhuǎn)移[21]。李華洋等[22]發(fā)現(xiàn)槲皮素可能通過抑制STAT3 信號通路，從而發(fā)揮抑制肺腺癌A549 細胞增殖、遷移和侵襲能力。木犀草素能夠誘導細胞凋亡，起到抑制NSCLC A549 細胞增殖、侵襲及遷移的作用[23]；并通過調(diào)節(jié)肌鈣蛋白表達，收縮細胞骨架逆轉(zhuǎn)EMT[24]。山奈酚又稱山奈素，具有抗癌、抗病毒、抗炎和抗氧化等多種藥理作用[25-26]。研究表明，山奈酚同樣有降低NSCLC 細胞增殖、侵襲及遷移的能力，可能與調(diào)控ERRα、miR21 等機制有關[27-28]。

通過桔梗-魚腥草與NSCLC 靶點互作網(wǎng)絡分析得知，桔梗-魚腥草治療NSCLC 的潛在核心靶點包括腫瘤壞死蛋白53（TP53）、蛋白激酶1（AKT1）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、腫瘤壞死因子（TNF）、表皮生長因子受體（EGFR）。TP53 是目前研究最為透徹的癌癥相關基因之一，以抑癌作用而聞名，具有誘導細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成和腫瘤細胞增殖的作用[29]。發(fā)現(xiàn)約50%的癌癥患者有TP53 突變，導致其功能從抑癌向促癌轉(zhuǎn)變，從而促進癌細胞的增殖和遷移[30-31]。另外突變的TP53 相關基因的表達與患者預后有關，基因表達水平越高，患者預后越差[32]。AKT 又稱蛋白激酶B，是PI3K-AKT 通路的下游靶蛋白，參與調(diào)控細胞的生長、代謝和凋亡，對腫瘤細胞的生長、增殖以及遷移至關重要[33]。約一半以上的NSCLC 患者存在激活狀態(tài)AKT 高表達，其表達程度越高，疾病預后越差[34]。AKT1 屬于AKT 激酶家族，相關研究表明AKT1 不僅能夠降低NSCLC 對化療藥物的敏感性，還能促進EGFR 和K-RAS 突變的NSCLC 細胞的侵襲及遷移[34]。

GO 富集分析顯示，桔梗-魚腥草治療NSCLC 的生物過程主要涉及細胞凋亡、細胞死亡正向調(diào)控、細胞群增殖負向調(diào)控等；分子功能包括轉(zhuǎn)錄因子合成、蛋白激酶合成、絲氨酸水解酶活性等；細胞組成主要包括：受體復合物、蛋白激酶復合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復合體等。KEGG 分析顯示，桔梗-魚腥草可能通過癌癥、MAPK 和PI3K-AKT 等信號通路發(fā)揮抗NSCLC 的作用。其中PI3K-AKT 信號通路是NSCLC最重要的調(diào)控途徑之一，其涉及癌細胞的生長、增殖、侵襲和遷移，能減緩癌癥細胞凋亡、促進血管生成以及增加化療耐藥等[35]。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合GEO 數(shù)據(jù)挖掘得到桔梗-魚腥草治療NSCLC 的潛在核心成分和核心靶點，并分析得到可能的作用途徑。表明桔梗-魚腥草治療NSCLC 是多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的復雜網(wǎng)絡機制。同時分子對接結(jié)果表明核心成分和核心靶點對接良好，進一步驗證推論的合理性。為NSCLC 的臨床治療和后續(xù)實驗研究提供一定參考。