王殷彤，王成功，賈思凝，俞文秀，王方巖，姜程曦*，程錦國

莪術油通過抑制鐵死亡減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的機制研究

王殷彤1, 2，王成功3，賈思凝3，俞文秀1，王方巖4，姜程曦3*，程錦國2*

1. 溫州醫(yī)科大學附屬第二學院，浙江 溫州 325000 2. 溫州醫(yī)科大學附屬第一學院，浙江 溫州 325000 3. 溫州醫(yī)科大學藥學院，浙江 溫州 325000 4. 溫州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，浙江 溫州 325000

探究莪術油是否通過抑制鐵死亡減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化及作用機制。40只雄性C57BL/6小鼠分為對照組、模型組和莪術油低、高劑量（3.25、13.00 mg/kg）組。小鼠氣管插管注射博來霉素（3 mg/kg）制備肺纖維化模型，造模7 d后開始給藥，給藥組連續(xù)14 d隔日ip莪術油。給藥結束后，通過各組小鼠體質(zhì)量和肺干濕質(zhì)量比評估小鼠一般情況；采用蘇木素-伊紅（HE）和Masson染色觀察肺組織病理變化；檢測血清中炎癥因子水平和肺組織中羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）、氧化應激水平；Western blotting檢測肺組織中肺纖維化和鐵死亡相關蛋白表達。與模型組比較，莪術油組小鼠體質(zhì)量增長（＜0.05），肺水腫程度減輕，肺組織損傷情況好轉(zhuǎn)，膠原纖維沉積減少；肺組織氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）及HYP水平減少（＜0.05、0.01），還原酶谷胱甘肽（glutathione，GSH）活性增加（＜0.05）；血清中炎癥因子水平明顯降低（＜0.01）；肺組織纖維化相關蛋白I型膠原蛋白（collagen I）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和波形蛋白（vimentin）表達下調(diào)（＜0.05、0.01），谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）蛋白表達上調(diào)（＜0.01），轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）和二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）蛋白表達下調(diào)（＜0.05、0.01）。莪術油能夠通過抑制鐵死亡，改善氧化應激，抑制炎癥水平，減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化。

肺纖維化；莪術油；鐵死亡；氧化應激；炎癥因子

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性、高死亡率的間質(zhì)性肺病，由于成纖維細胞過度積聚，細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）廣泛沉積，最終導致肺泡結構受損，肺功能逐漸下降。IPF的預后較差，患者的生活質(zhì)量受到嚴重的影響，并且由于繼發(fā)性呼吸衰竭通常在診斷后2～5年內(nèi)死亡[1-2]。吡非尼酮和尼達尼布在2014年被指南推薦用于IPF的臨床治療，但這2種藥物的價格高昂，且無法徹底逆轉(zhuǎn)纖維化[3-4]。因此探索經(jīng)濟并且可以有效延緩或治療肺纖維化的藥物尤為重要。

莪術油是莪術的提取物，價格經(jīng)濟實惠，其主要成分包括莪術醇、莪術二酮、莪術酮、欖香烯等，具有抗腫瘤、抗菌、抗血栓形成等多種藥理作用[5-7]。研究表明，莪術醇可下調(diào)肺纖維化大鼠肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和纖溶酶原激活劑抑制劑-1的表達，緩解博來霉素引起的大鼠肺纖維化[8]，但其具體作用機制尚不明晰。鐵死亡作為一種新的細胞死亡形式，與鐵代謝紊亂、脂質(zhì)過氧化積累、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）缺乏有關，參與了纖維化的形成[9-10]。研究表明，泛素樣含PHD和環(huán)指域1（ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，Uhrf1）可通過調(diào)節(jié)GPX4和鐵死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1）的水平，從而促進肺纖維化；通過使用鐵死亡抑制劑，抑制鐵的累積能夠緩解由博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，提示鐵死亡在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中可能扮演著重要的角色[11-12]。本研究擬采用莪術油對博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型進行干預治療，以明確莪術油對肺纖維化的療效，并通過檢測GPX4、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）、二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）等鐵死亡關鍵蛋白，進一步闡述其作用機制。

1 材料

1.1 動物

40只SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，6～8周齡，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SYXK（浙）2021-0020。動物飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，人工晝夜明暗交替12 h/ 12 h，自由進食飲水。動物實驗通過溫州醫(yī)科大學實驗動物倫理審查會審查（批準號wydw2022-0635）。

1.2 藥品與試劑

莪術油（批號5190513）受贈于合肥未來藥物開發(fā)有限公司，含牻牛兒酮（C15H22O）8.2%、呋喃二烯（C15H20O）10.5%，符合《中國藥典》2020年版規(guī)定；博來霉素（批號410730，進口藥品注冊證號H20171103）由日本化藥株式會社生產(chǎn)，購自溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號G1340）、Masson染色試劑盒（批號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜（批號IPVH00010、ISEQ00010）購自美國Millipore公司；兔抗β-actin抗體（批號ab8227）、兔抗Tubulin抗體（批號ab210797）、兔抗I型膠原蛋白（collagen I）抗體（批號ab260043）、兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（批號ab124964）、兔抗GPX4抗體（批號ab125066）、兔抗TFR1抗體（批號ab214039）、HRP標記的山羊抗兔二抗（批號ab205718）、Alexa Fluor?488標記的山羊抗兔IgG二抗（批號150077）、封固劑DAPI（批號ab104139）購自英國Abcam公司；兔抗波形蛋白（vimentin）抗體（批號5741）購自美國CST公司；兔抗DMT1（批號NBP1-91840）購自美國Novus公司；小鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號JL20268）、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號JL10484）、小鼠IL-1β ELISA試劑盒（批號JL18442）購自上海江萊生物科技有限公司；GSH測定試劑盒（批號A006-1-1）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（批號A003-1-2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（批號A001-3-2）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）測定試劑盒（批號A030-2-1）購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

165-8001型電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；JS-M6P型凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技生物公司）；TGL-16gR型低溫離心機（上海安亭科學儀器廠）；BSA224S型電子分析天平（賽多利斯公司）；SpectraMax 190型全波長酶標儀（美國Molecular Devices公司）；80i型正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；HistoCore Arcadia型石蠟包埋機、RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司）。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（10只）和造模組（30只）。小鼠ip 2%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉，固定后燈光下尋找氣管，插入留置針。造模組小鼠通過氣管插管注射博來霉素（3 mg/kg）[13]，對照組注射生理鹽水。造模完成后立即旋轉(zhuǎn)小鼠，使博來霉素或生理鹽水可以均勻分布肺中。待小鼠蘇醒后，觀察一般情況。根據(jù)課題組前期研究，以莪術油推薦成人每日最佳使用量換算作為低劑量，為了更好評估有效劑量的范圍，以4倍臨床劑量作為高劑量。將30只造模組小鼠隨機分為模型組和莪術油低、高劑量（3.25、13.00 mg/kg）組。造模7 d后開始給藥，給藥組連續(xù)14 d隔日ip莪術油，對照組和模型組ip等體積生理鹽水，第21天處死小鼠。

2.2 樣本收集

末次給藥2 h后，腹主動脈采血后處死小鼠，取血清用于ELISA檢測。小鼠乙醇局部消毒，沿前中線剪開胸腔，暴露氣管和心肺器官。用手術線結扎右肺，取右肺上葉保存，余下置于液氮中保存用于后續(xù)實驗。分離氣管后，用眼科剪在氣管上端剪一“Y”形小口，插入留置針，左肺中打入4%多聚甲醛固定液，直至左肺飽滿，結扎左肺剪下，固定后進行石蠟包埋。

2.3 小鼠體質(zhì)量及肺干濕質(zhì)量比測定

每天記錄小鼠體質(zhì)量，給藥結束后，取右肺上葉，稱定質(zhì)量后，80 ℃烘箱中烘烤72 h，直至質(zhì)量恒定，稱定質(zhì)量，計算肺干濕質(zhì)量比，用于反映肺組織含水量。

2.4 肺組織病理學觀察

取固定后的肺組織，梯度乙醇脫水、透明、浸蠟后進行石蠟包埋，切片（厚度4 μm），脫蠟至水，進行HE和Masson染色，脫水，中性膠封片，于顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

2.5 免疫熒光法檢測肺組織collagen I和GPX4蛋白表達

取固定后的肺組織，梯度乙醇脫水、透明、浸蠟后進行石蠟包埋，切片（厚4 μm），脫蠟至水，抗原修復后加入0.2%牛血清白蛋白，室溫封閉30 min，滴加collagen I（1∶500）、GPX4（1∶200）抗體，4 ℃過夜孵育。室溫復溫1 h后，加入熒光二抗避光孵育1 h。DAPI復染10 min后，滴加防熒光淬滅劑封片。正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。DAPI紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm，發(fā)藍光；FITC激發(fā)波長465～495 nm，發(fā)射波長515～555 nm，發(fā)綠光。

2.6 肺組織中氧化應激指標及HYP含量測定

按照試劑盒說明書檢測各組小鼠肺組織中GSH、MDA、SOD和HYP含量。

2.7 血清中炎癥因子水平檢測

按照試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

2.8 Western blotting檢測肺組織collagen Ⅰ、α-SMA、vimentin、GPX4、TFR1、DMT1蛋白表達

取各組小鼠肺組織，按照50∶1的比例加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，提取組織蛋白。BCA法進行蛋白定量測定蛋白濃度，變性后的蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h；分別加入collagen I抗體（1∶500）、α-SMA抗體（1∶10 000）、vimentin抗體（1∶1000）、GPX4抗體（1∶5000）、TFR1抗體（1∶5000）、DMT1抗體（1∶1000）、Tubulin抗體（1∶1000）和β-actin抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；洗膜后，加入HRP標記山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1 h，洗膜。滴加ECL曝光液，放入曝光機中成像，用Image J圖像軟件分析對條帶灰度。

2.9 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 莪術油緩解肺纖維化小鼠體質(zhì)量減輕及肺水腫

如圖1-A所示，造模7 d后，對照組小鼠體質(zhì)量增加，造模組小鼠體質(zhì)量均下降；給藥后，與模型組比較，莪術油低劑量組小鼠體質(zhì)量顯著增長（＜0.05）。如圖1-B所示，與對照組比較，模型組小鼠肺干濕質(zhì)量比顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，莪術油低劑量組小鼠肺干濕質(zhì)量比顯著降低（＜0.05）。

3.2 莪術油減少肺纖維化小鼠肺組織纖維化改變和膠原沉積

如圖2所示，HE染色結果表明，對照組小鼠肺組織結構清晰完整，肺泡和肺泡間隔正常，未見明顯的病理性改變，未見膠原沉積。模型組小鼠的肺組織結構排列紊亂，肺泡壁顯著增厚，肺泡不完整甚至不可見，肺泡腔內(nèi)有大量的纖維組織團聚集，間質(zhì)部分可見肌成纖維細胞增生，同時伴有炎性浸潤。與模型組相比，莪術油組肺泡結構更加完整，炎性細胞浸潤程度更輕，纖維化改變更少。Masson染色結果表明，與對照組相比，模型組小鼠肺組織中存在明顯的間質(zhì)內(nèi)藍色條索樣膠原纖維沉積，伴隨肺泡壁增厚和肺紋理紊亂。與模型組相比，莪術油組肺組織內(nèi)的膠原沉積有一定程度減少。

3.3 莪術油減少肺纖維化小鼠肺組織中纖維化相關蛋白表達

如圖3所示，Western blotting結果顯示，與對照組比較，模型組肺組織中collagen I、α-SMA、vimentin蛋白表達均明顯升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，莪術油各劑量組collagen I蛋白表達顯著降低，莪術油低劑量組vimentin蛋白表達顯著下調(diào)（＜0.05），莪術油高劑量組α-SMA蛋白表達顯著下調(diào)（＜0.01）。免疫熒光染色結果與Western blotting結果一致，與對照組比較，模型組collagen I陽性表達增加；與模型組比較，莪術油組collagen I陽性表達減少。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 莪術油對肺纖維化小鼠肺組織病理變化的影響(×400)

圖3 莪術油對肺纖維化小鼠肺組織中collagen I、α-SMA和vimentin蛋白表達的影響(, n = 3)

3.4 莪術油降低肺纖維化小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平

如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，莪術油低劑量組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著降低（＜0.01）。

3.5 莪術油改善肺纖維化小鼠氧化應激及減少HYP

如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠肺組織中MDA和HYP含量顯著升高（＜0.01），GSH含量顯著降低（＜0.01），SOD活性呈降低趨勢；與模型組比較，莪術油各劑量組GSH含量顯著升高（＜0.01），MDA含量顯著降低（＜0.01），SOD活性呈升高趨勢；莪術油低劑量組HYP含量顯著降低（＜0.05）。

圖4 莪術油對肺纖維化小鼠血清中炎癥因子水平的影響(, n = 7)

圖5 莪術油對肺纖維化小鼠肺組織中氧化應激指標和HYP含量的影響(, n = 6)

3.6 莪術油抑制肺纖維化小鼠肺組織中鐵死亡相關蛋白表達

如圖6所示，與對照組比較，模型組肺組織中GPX4蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），TFR1和DMT1蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，莪術油各劑量組GPX4蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），TFR1和DMT1蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）。免疫熒光染色結果與Western blotting結果一致，與對照組比較，模型組GPX4陽性表達減少；與模型組比較，莪術油組GPX4陽性表達增加。

圖6 莪術油對肺纖維化小鼠肺組織中GPX4、TFR1和DMT1蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

肺纖維化是一種慢性間質(zhì)性肺病，主要特征為ECM的過度表達和沉積、肌成纖維細胞形成的纖維灶累積以及肺重塑異常[14]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是間充質(zhì)細胞產(chǎn)生和ECM過度分泌的重要途徑之一，最終可能導致肺纖維化的發(fā)生[15]。EMT的過程主要表現(xiàn)為上皮黏附蛋白下調(diào)和間質(zhì)細胞標記物α-SMA上調(diào)，同時包括纖連蛋白、vimentin、collogen I、collogen III、collogenIV等的生成[16]。莪術為姜科姜黃屬植物，其性溫，味辛、苦，歸肝、脾經(jīng)，其功效為破血祛瘀行氣、消腫止痛。莪術油是從莪術中提取的揮發(fā)油，臨床常用于抗炎、抗腫瘤治療[17]。本課題組前期研究已證實莪術提取物對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的小鼠急性肺損傷有一定的改善作用[18]，但對博來霉素誘導的小鼠肺纖維化是否有改善作用及其作用機制尚未明確。

鐵死亡是一種新型程序性細胞死亡，其特征為細胞內(nèi)鐵過載和活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累[19]。鐵離子是脂質(zhì)過氧化物積累和鐵死亡過程所必需的。因此，參與鐵離子結合、轉(zhuǎn)運、解離和儲存的蛋白在鐵死亡的調(diào)節(jié)中起著重要作用。Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白結合后通過膜上的TFR進入細胞。隨后，細胞中的Fe3+被前列腺六跨膜上皮抗原3（six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3，STEAP3）還原為Fe2+，F(xiàn)e2+通過DMT1或鋅-鐵調(diào)節(jié)蛋白家族8/14（zinc-iron regulatory protein family 8/14，ZIP8/14）釋放到細胞質(zhì)中。這些相關蛋白的異常表達或功能障礙會使細胞內(nèi)鐵離子濃度失衡，導致鐵過載。GPX4可減弱脂質(zhì)過氧化物的毒性并維持雙層脂質(zhì)細胞膜穩(wěn)定性，表明它是鐵死亡的中樞調(diào)節(jié)因子[20]。GPX4表達降低導致細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物累積，最終引起鐵死亡[21]。研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化和肺損傷的誘導劑博來霉素和LPS可以誘導肺上皮細胞發(fā)生鐵死亡。鐵死亡抑制劑利普羅他汀-1（liproxstatin-1，Lip-1）可通過減少脂質(zhì)過氧化，抑制鐵死亡緩解博來霉素或LPS誘導的肺纖維化癥狀。TGF-β刺激上調(diào)人肺成纖維MRC-5細胞和小鼠原代肺成纖維細胞中TFR1的表達，導致細胞內(nèi)Fe2+增加，從而促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，一些化合物和傳統(tǒng)中藥證實了鐵死亡與纖維化之間存在聯(lián)系[22-23]。表明鐵死亡在肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。因此，通過抑制鐵死亡來緩解肺纖維化具有較高的創(chuàng)新性和實際應用價值。

本研究采用博來霉素誘導建立小鼠肺纖維化模型，造模7 d后隔日給予不同劑量莪術油治療，給藥14 d后，收集小鼠肺組織用于后續(xù)實驗。實驗結果表明，莪術油改善了博來霉素引起的小鼠體質(zhì)量減輕和肺干濕質(zhì)量比增加。進一步，HE染色結果表明，與模型組相比，莪術油治療組小鼠肺組織結構更加完整，炎性細胞浸潤程度更輕，肺臟纖維化改變減少；Masson染色結果表明，與模型組相比，莪術油治療組小鼠肺組織中膠原明顯減少。肺泡上皮細胞向成纖維細胞，以及成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化在肺纖維化的發(fā)病機制中起著至關重要的作用。本研究結果顯示，模型組小鼠肺組織collogen I、α-SMA、vimentin蛋白表達上調(diào)，且肺組織中collogen I沉積增多，表明博來霉素誘導的小鼠肺纖維化中有EMT發(fā)生；莪術油治療減少了肺泡上皮細胞向成纖維細胞，及成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，下調(diào)了這些相關蛋白的表達。表明莪術油可以通過調(diào)節(jié)EMT，抑制上皮細胞轉(zhuǎn)化或成纖維細胞轉(zhuǎn)化從而改善肺纖維化。HYP為膠原纖維所特有，因此可以通過檢測HYP的含量，從而評估纖維化程度。結果表明，莪術油治療組可以在一定程度上改善小鼠肺組織中的纖維化程度。

研究表明，肺纖維化的發(fā)展與多種炎癥因子相關，肺纖維化極易出現(xiàn)IL-1β、IL-6、TNF-α的過表達，高水平的TNF-α增加膠原沉積，導致肺損傷[24]；IL-1β和IL-6通過激活TGF-β信號通路誘導EMT發(fā)生[25-26]。結果顯示，博來霉素誘導的小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平提高，而經(jīng)過莪術油干預后肺纖維化小鼠血清中相關炎癥因子有所減少，其中莪術油低劑量組的下調(diào)作用明顯，說明低劑量莪術油可能通過降低與纖維化相關的炎癥因子水平，達到改善博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的目的。研究證實，氧化應激促進了肺纖維化的產(chǎn)生，在肺纖維化的過程中，氧化應激水平提高，大量ROS產(chǎn)生，肺泡上皮細胞發(fā)生鐵死亡，促進了成纖維細胞轉(zhuǎn)化和肌成纖維細胞分化，引起了ECM過表達和過量沉積，最終導致了纖維化的產(chǎn)生[27]。結果顯示，肺纖維化的產(chǎn)生會引起氧化應激相關產(chǎn)物（MDA）、還原酶（GSH、SOD）的活性改變，通過莪術油治療可以下調(diào)MDA表達、上調(diào)GSH表達。說明莪術油可以改善博來霉素誘導的小鼠肺纖維化組織中的氧化損傷程度。Western blotting法檢測鐵死亡相關蛋白表達，結果表明，與模型組相比，莪術油給藥治療后GPX4表達上調(diào)，TFR1和DMT1表達下調(diào)，免疫熒光染色結果與Western blotting一致。說明莪術油減輕肺纖維化小鼠纖維化程度可能是通過抑制鐵死亡實現(xiàn)的。莪術油作為一種中草藥，具有天然、經(jīng)濟、易獲取等優(yōu)勢，可以為肺纖維化患者提供有效的治療選擇。此外，最新的研究結果表明，雷公藤可以通過調(diào)節(jié)核因子E2相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）/血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）通路抑制鐵死亡，從而減輕百草枯所致的急性肺損傷和肺纖維化[28]，與本實驗結論相吻合。證明了中草藥的多成分、多靶點特性也為肺纖維化的個體化治療提供了新的思路和方法。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)博來霉素通過促進炎癥因子釋放，誘導氧化失衡，從而激活鐵死亡引起小鼠肺組織發(fā)生ECM沉積，纖維化形成。莪術油干預后改善肺組織的炎性狀態(tài)，重建氧化還原平衡狀態(tài)，上調(diào)肺組織中GPX4，下調(diào)TFR1和DMT1的表達從而抑制鐵死亡，減少膠原沉積，最終減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Zedoary Turmeric Oil on attenuating bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice through inhibition of ferroptosis

WANG Yin-tong1, 2, WANG Cheng-gong3, JIA Si-ning3, YU Wen-xiu1, WANG Fang-yan4, JIANG Cheng-xi3, CHENG Jin-guo2

1. The Second Affiliated College of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China 2. The First Affiliated College of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China 3. School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China 4. School of Basic Medicine, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China

To explore whether Zedoary Turmeric Oil (莪術油) can alleviate bleomycin induced pulmonary fibrosis in mice by inhibiting ferroptosis and the specific mechanism.A total of 40 C57BL/6 male mice were divided into control group, model group, and Zedoary Turmeric Oil low-and high-dose (3.25, 13.00 mg/kg) groups. The model of pulmonary fibrosis was established by injecting bleomycin (3 mg/kg) through tracheal intubation in mice. The drug was administered 7 d after the model was established. The drug group was given Zedoary Turmeric Oil every other day for 14 consecutive days. After administration, the general condition of mice was evaluated by comparing their body weight and lung dry wet weight ratio in each group; Pathological changes of lung tissue was observed by HE and Masson staining; Levels of inflammatory factors in serum and hydroxyproline (HYP) and oxidative stress levels in lung tissue were detected; Western blotting was used to detect the expressions of pulmonary fibrosis and ferroptosis related proteins in lung tissue.Compared with model group, the body weight of mice in Zedoary Turmeric Oil group was increased (< 0.05), the degree of pulmonary edema was reduced, the damage of lung tissue was improved, and the deposition of collagen fibers was reduced; The levels of oxidation products malondialdehyde (MDA) and HYP in lung tissue were decreased (< 0.05, 0.01), and the activity of glutathione (GSH) was increased (< 0.05); The levels of inflammatory factors in serum were significantly reduced (< 0.01); Expressions of protein associated with pulmonary fibrosis collagen I, α-smooth muscle actin (α-SMA) and vimentin in lung tissue were down-regulated (< 0.05, 0.01), glutathione peroxidase 4 (GPX4) protein expression was up-regulated (< 0.01), transferrin receptor 1 (TFR1) and divalent metal transporter 1 (DMT1) protein expressions were down-regulated (< 0.05, 0.01).Zedoary Turmeric Oil can alleviate bleomycin induced-pulmonary fibrosis in mice by inhibiting ferroptosis, improving oxidative stress and inhibiting inflammation.

pulmonary fibrosis; Zedoary Turmeric Oil; ferroptosis; oxidative stress; inflammatory factors

R285.5

A

0253 - 2670(2023)16 - 5274 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.016

2023-03-07

溫州市新型冠狀病毒肺炎疫情防控應急攻關項目（ZY202003）

王殷彤（1997—），女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥防治纖維化的基礎和臨床研究。

程錦國，男，主任醫(yī)師，博士生導師，主要從事中醫(yī)藥防治腎臟病的基礎和臨床研究。E-mail: wzwsjcjg@163.com

姜程曦，男，研究員，主要從事中藥質(zhì)量研究。E-mail: jiangchengxi@126.com

[責任編輯 李亞楠]