亓偉杰，連子騰，代世成，廖培龍，鄭環(huán)宇，王 歡*

（1 東北農業(yè)大學食品學院 哈爾濱 150030 2 黑龍江省綠色食品科學研究院 哈爾濱 150030）

近年來，我國綠色科技迅速發(fā)展，環(huán)保成為發(fā)展主流。人們在追求簡便、高效的同時，更注重對環(huán)境的保護，對可再生、可降解包裝材料的興趣日益劇增[1]。傳統(tǒng)的食品包裝材料雖在保藏和運輸過程中起關鍵性作用，但其難降解，嚴重污染環(huán)境等缺陷與“綠色、健康、可持續(xù)”的發(fā)展理念相違背。可食膜主要是因生物聚合物之間的相互作用而形成，其可解決傳統(tǒng)包裝材料帶來的問題。

研究表明，大豆分離蛋白、殼聚糖以及納米纖維均是良好的成膜材料。殼聚糖具有天然、安全、無毒等特點，其分子之間存在大量氨基和羥基形成氫鍵作用力，易形成一層連續(xù)的薄膜結構，阻隔性能較好[2]。纖維素納米纖維的結構是單個或聚集的長鏈，它是通過交替連接結晶區(qū)和非結晶區(qū)而形成的，作為優(yōu)良的控釋劑和穩(wěn)定劑可以顯著提高可食用包裝膜的抗氧化和抗菌性能[3]。殼聚糖-纖維素納米纖維可食膜應用在高水分食品領域具有較大的防水和抑菌潛力，而在拉伸強度、斷裂伸長率等機械性能方面有所不足[4]。李帥等[5]成功制備的大豆蛋白殼聚糖可食膜表現(xiàn)出較好的伸展性，防水性能有所缺陷。Han 等[6]將納米纖維素加入大豆蛋白膜中，結果表明薄膜的可溶性物質和溶脹特性顯著降低，機械性能得到明顯改善，在阻隔性能不足。大豆分離蛋白與殼聚糖以及纖維素納米纖維雖都具有良好的相容性，但單一原料或兩者結合制成的包裝膜均無法滿足食品包裝要求[7]。將3 種成膜材料結合起來，利用其相互作用可提高可食膜的相關性能。

目前采用大豆分離蛋白、殼聚糖、纖維素納米纖維三者復合來制備可食性薄膜的研究還較少。本研究采用不同濃度的大豆分離蛋白與殼聚糖、纖維素納米纖維混合制備可食膜，利用FTIR（傅里葉紅外光譜）、XRD（X 射線衍射）、SEM（掃描電子顯微鏡）及DSC（差示掃描量熱）分析其結構變化；研究蛋白濃度對其拉伸強度和斷裂伸長率機械性能、膜的厚度、不透明度、水蒸氣透過率、氧氣透過率、親水性能、溶解性及接觸角等理化性質的變化，揭示大豆分離蛋白、殼聚糖和納米纖維素分子相互作用以及對可食膜的性能影響，為蛋白多糖膜的發(fā)展研究提供技術理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（純度≥90%），殼聚糖（脫乙酰度＞90%），上海源葉生物科技有限公司；纖維素納米纖維（水凝膠狀），廣東中山納纖絲新材料有限公司；甘油（食品級），上海源葉生物科技有限公司；無水氯化鈣，天津市致遠化學試劑有限公司；亞油酸，上海源葉生物科技有限公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AL204 型分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C 型實驗室pH 計，中國上海雷磁公司；測厚規(guī)（精度0.001 mm），日本島津公司；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，金壇市雙捷實驗儀器廠；磁力攪拌器，廣州儀科實驗儀器有限公司；質構儀，英國Stable Micro Systems 公司；TU-1800紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Empyrean X 射線衍射儀，馬爾文帕納科公司；S-3400N 掃描電子顯微鏡，日本日立公司；OCA20 視頻接觸角測定儀，德國Dataphysics 公司；Magna-4R 560 傅里葉變換紅外光譜，日本島津公司；DSC3 差示量熱掃描儀，瑞士梅特勒公司。

1.3 大豆分離蛋白-殼聚糖-纖維素納米纖維可食膜的制備

用100 mL 1%冰乙酸溶解3 g 殼聚糖，攪拌均勻；將大豆分離蛋白溶于100 mL 蒸餾水中制得質量分數(shù)為0%，1.5%，3%，4.5%，6%的大豆分離蛋白溶液，并于80 ℃水浴攪拌30 min，之后用2 mol/L 鹽酸溶液將殼聚糖及大豆分離蛋白溶液pH值調至3.0。精確稱量15.0 g 纖維素納米纖維溶于100 mL 蒸餾水，攪拌30 min 備用[8]。將不同濃度的大豆分離蛋白溶液與殼聚糖和纖維素納米纖維溶液按照1 ∶1 ∶1（體積比）的比例混合均勻，此時蛋白分別為0%，0.5%，1%，1.5%，2%，后加入2%甘油，混合攪拌1 h 后，靜置除去氣泡后流延成膜，最后經(jīng)60 ℃鼓風干燥5～6 h 成膜。以不加大豆分離蛋白的殼聚糖纖維素納米纖維可食膜作為對照[9]。

1.4 結構測定

1.4.1 傅里葉紅外光譜分析（FTIR）使用傅里葉紅外光譜儀對膜進行掃描。將膜剪切成1 cm×1 cm 規(guī)格大小，在400～4 000 cm-1范圍內測定，以4 cm-1的分辨率獲得32 次掃描的平均值[10]。

1.4.2 X 射線衍射分析（XRD）根據(jù)李彤等[11]的方法，干燥后的可食膜置于XRD 分析儀上進行分析，2θ 范圍為5°～40°，放射源為Cu-Kα 射線（λ=0.154 nm），掃描速率為3°/min。

1.4.3 差示掃描量熱分析（DCS）將可食膜放在經(jīng)25 ℃和50%相對濕度條件下處理2 d 過密封的約5 mg 標準鋁盤中，并用液氮快速冷卻至-10℃。DSC 曲線在0～300 ℃的溫度范圍內，在干燥氮氣流下，以20 ℃/min 的加熱速率測得[12]。

1.4.4 掃描電子顯微鏡觀察（SEM）采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察膜的橫截面形態(tài)，取2 mm×2 mm 膜樣品固定，噴金，掃描電鏡下觀察，加速電壓5 kV[10]。

1.5 性能測定

1.5.1 厚度的測定 根據(jù)陳姍姍[9]的方法，在可食膜的4 角及中央各取1 點，用測厚規(guī)測量每個點的厚度，單位為mm，用于膜機械性能計算。每個樣品測量不少于3 次。

1.5.2 不透明度的測定 參照羅愛國等[13]的方法，使用分光光度計測定膜的透光率。把可食膜制成10 mm×50 mm 的長條狀，放在比色皿的一側，并利用無膜的比色皿作為空白。在600 nm 處測吸光度（A），按照公式計算透光率。

式中：A600——600 nm 處測得的吸光值；d——膜的厚度，mm。

1.5.3 拉伸強度和斷裂伸長率的測定 將可食膜剪切成1 cm×5 cm 的長條狀，確保測試樣品完整無破損。將兩端用醫(yī)用膠帶粘住，將兩端夾在兩個探頭之間使其保持緊繃狀態(tài)，固定在質構儀器上。設定可食膜的初始夾距在3 cm，力臂為5 kg。記錄膜斷裂時的最大拉力F 數(shù)值以及斷裂伸長率。

式中：TS——膜的拉伸強度，MPa；F——膜斷裂時的最大作用力，N；d——膜的厚度，mm；l——膜的夾距，mm。

1.5.4 水蒸氣透過率的測定 根據(jù)GB-1037-70，采用擬杯子法[14]進行水蒸氣透過率測定。水蒸氣透過系數(shù)（WVP）計算公式為：

式中：WVP——水蒸氣透過系數(shù)，g·mm/（h·m2·kPa）；q/t——單位時間內錐形瓶增加質量的算術平均值，g/h；d——膜的厚度，mm；S——膜的試驗面積，m2；Δp——試樣兩側的蒸汽壓差，kPa。

1.5.5 氧氣透過率的測定 根據(jù)ASTMD3985-95[15]方法并稍作修改，在常壓室溫條件下往錐形瓶中加入1 mL 亞油酸，用可食膜包住瓶口并用石蠟密封。測量試驗膜的面積，每隔24 h 測量錐形瓶的質量，直至不再變化。氧氣透過率（OP）的計算方式為：

式中：OP——氧氣透過率，g/（m2·d）；Δm——亞油酸增加的質量，g；S——膜的面積，m2；t——試驗的時間，d。

1.5.6 接觸角的測定 根據(jù)支雅雯等[16]的方法稍加修改，將膜剪切成1 cm×2 cm 規(guī)格大小，使用兩個載玻片夾住。采用液滴法通過接觸角測量儀測定。測量范圍0～180°，滴水量為0.5 μL。

1.5.7 吸水能力的測定 將可食膜剪切成3 cm×3 cm 規(guī)格，吸干水分稱重W1，將其放置在盛有30 mL 蒸餾水的平皿中，2 h 后取出并用紙巾瀝干水分，稱重記為W2。吸水率計算公式為

1.5.8 溶解性的測定 根據(jù)王亞珍等[17]的方法，將可食膜剪切成3 cm×3 cm 規(guī)格，在干燥器中放至恒重稱重為W1，然后將其放入盛有30 mL 蒸餾水的平板中，在室溫下（25 ℃）溶解12 h 后，將膜取出吸干水分放入干燥器至恒重稱重W2。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗重復3 次，結果采用平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和分析由SPSS 軟件完成，并用Origin 8.0 作圖進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜的FTIR 影響

圖1 顯示了不同大豆分離蛋白濃度可食膜在4 000～500 cm-1范圍內的FTIR 圖?？瞻捉M分別在3 250 cm-1、1 600 cm-1（C=O 伸縮振動）、1 530 cm-1（N-H 彎曲振動）有特征振動吸收峰，3 250 cm-1處的峰是由于C-N 和O-H 的伸展彎曲[18]。當大豆分離蛋白為1%時，在3 250 cm-1的吸收峰紅移至3 290 cm-1，相對于其它3 組移動范圍最大，這是由于大豆蛋白和殼聚糖的氨基與纖維素納米纖維的羥基之間發(fā)生了分子鍵合[19]，宏觀表現(xiàn)為具有較好的拉伸強度以及斷裂伸長率。1 540 cm-1是殼聚糖氨基基團的振動引起的，結果表明殼聚糖與纖維素納米纖維之間有靜電作用[8]。FTIR 證實了大豆分離蛋白、殼聚糖、纖維素納米纖維通過氫鍵及靜電相互作用共同維持網(wǎng)狀結構且蛋白為1%時，三者更好的結合，結構更穩(wěn)定[20]。

2.2 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜的XRD 影響

XRD 一般用于晶體結構以及復合物成分之間的相容性分析，從圖2 可以看出隨著蛋白濃度的增大可食膜XRD 的變化規(guī)律。納米纖維素本身就是結晶和非結晶組合體[21]，對膜的結晶度也有著一定的影響。添加1%蛋白使得2θ 從22.45°移至22.25°，峰值強度達到最大，說明蛋白的加入增加了分子之間有序性，結晶度升高，膜的強度增大[22]，蛋白更好的與兩種多糖相結合。而隨著蛋白濃度的升高使得峰值降低，結晶度下降，破壞了分子有序性。以上說明1%的大豆分離蛋白可使可食膜結晶度提高，分子結構變得更為緊密，分子之間距離減小，可食膜中蛋白分子二級結構發(fā)生變化[11]，這也導致了可食膜機械性能和阻隔性能的變化。

圖2 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜的XRD 影響Fig.2 XRD effects of different concentrations of soybean protein isolate on edible film

2.3 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜的DSC 影響

DSC 評價了可食膜的熱性能，通過分析差示量熱掃描曲線得知其玻璃化轉變溫度以及聚合物相容性，玻璃化轉變溫度是指由高彈態(tài)轉變?yōu)椴ＡB(tài)或玻璃態(tài)轉變?yōu)楦邚棏B(tài)所對應的溫度[8]。圖3顯示了可食膜的差示掃描量熱曲線以及確定的玻璃化轉變溫度。從圖中可以看出，加入1%的大豆分離的可食膜相對于空白組來說變化不顯著，變性溫度為117 ℃時的玻璃化轉變溫度較高，這種現(xiàn)象的變化可能是3 種聚合物之間相互作用穩(wěn)定的結果，導致無定形聚合物鏈的自由旋轉減少[23]。添加2%蛋白的可食膜玻璃化轉變溫度變化最顯著（P＜0.05），可能是過量帶正電荷的蛋白分子削弱三者之間氫鍵作用，結構不穩(wěn)定，與Samir 等[24]研究結果相符。

圖3 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜的DSC 影響Fig.3 DSC effect of different concentration of soybean protein isolate on edible membrane

2.4 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜的SEM 影響

利用掃描電子顯微鏡對可食膜的微觀結構進行觀察，如圖4 所示，添加1%大豆分離蛋白的可食膜橫截面結構較均勻致密，孔洞較少，堆積緊密，表明1%的蛋白可食膜可能具有良好的的阻隔性能和機械性能。同時，圖中也顯示，當添加的蛋白濃度過高時，橫截面出現(xiàn)空隙，凹凸不平，這是由于未結合的游離蛋白發(fā)生聚集，網(wǎng)狀結構被破壞，加速了水分子以及其它分子的進入[23]，導致水蒸氣和氧氣等分子的進入。因此蛋白濃度為1%時有利于與殼聚糖以及纖維素納米纖維的相容。

圖4 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜的SEM 影響Fig.4 SEM effects of different concentrations of soybean protein isolate on edible membrane

2.5 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜厚度和不透明度的影響

厚度是影響可食膜品質的重要指標之一。厚度過大不但浪費原料，并且不宜包裝食品；厚度過小，影響膜的阻隔性能，不能更好阻擋水分子滲透[25]。因此，控制厚度大小是制備可食膜的關鍵所在[7]。由圖5 可以看出，隨著大豆分離蛋白濃度的增加，可食膜的厚度呈現(xiàn)上升趨勢，這是由于蛋白濃度越大，單位體積內的成膜液干物質含量越多，使得可食膜厚度越來越厚[7]?？墒衬さ慕M分對厚度有較大影響，蛋白基質中添加適量的納米纖維素使得可食膜厚度增大[8]。

圖5 不同含量的大豆分離蛋白對可食膜厚度和不透明度的影響Fig.5 Effects of different concents of soybean protein isolate on thickness and opacity of edible film

同樣，殼聚糖與納米纖維素的結合對可食膜厚度也有一定的作用[26]。對于不透明度而言，在食品中的應用同樣至關重要，其保護食品免受紫外線輻射引起的氧化，但是可食膜的高不透明度也會導致消費者對食物的視覺模糊[3]?？墒衬げ煌该鞫冉Y果如圖5 所示，隨著蛋白濃度的增大，不透明度呈快速上升趨勢，蛋白濃度為1%時達到3.59%，較對照組提高16.67%。隨后上升趨勢增長減緩，主要是因為隨著蛋白濃度的提高，蛋白與殼聚糖及纖維素納米纖維相互作用趨向飽和，過量的蛋白會導致可食膜網(wǎng)絡結構參差不齊（見圖4），影響可見光的透過，由于大豆分離蛋白帶入過多正電荷使納米纖維素團聚，引起光的散射，導致可食膜不透明度的升高[3]。結果顯示，1%的添加量不僅可以滿足食品的可見度，同時降低了光線對食品的透射氧化，對光敏食品也具有一定阻光性[13]。

2.6 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜拉伸強度和斷裂伸長率的影響

可食膜的機械性能決定了其在食品包裝實際應用范圍。通常，拉伸強度和斷裂伸長率用于表示它的最大應力強度和柔韌性，主要與基體內部結構與相互作用力有關[27]。不同濃度的大豆分離蛋白可食膜拉伸強度和斷裂伸長率如圖6 所示，蛋白質量分數(shù)為1%，1.5%，2%時，拉伸強度無顯著變化。蛋白添加量為1%的可食膜拉伸強度為6.42 MPa，比未添加提高44.45%，這是由于其內部分子相互作用，大豆蛋白與殼聚糖較容易形成分子間的網(wǎng)狀結構[28]，纖維素納米纖維與蛋白質可發(fā)生鍵合和交聯(lián)作用[29]，三者通過氫鍵以及靜電相互作用形成穩(wěn)定結構。但由于過量的蛋白加入，殼聚糖與納米纖維素結合位點趨于飽和狀態(tài)，氫鍵逐漸被較弱的靜電相互作用而取代。與空白組相比，1%蛋白的加入使得可食膜斷裂伸長率高達98.75%，提高25.68%，原因可能是由于膜的剛性結構受其柔韌性影響，而納米纖維素是否在基質內均勻分散又影響著膜的剛性和柔性，較多帶有正電荷蛋白的加入使得納米纖維素因靜電作用發(fā)生團聚，其小尺寸效應逐漸明顯，這些因素導致分子間距離變小，可食膜柔性降低，從而減小膜的斷裂伸長率[30]。

圖6 不同含量的大豆分離蛋白對可食膜拉伸強度和斷裂伸長率的影響Fig.6 Effects of different concents of soybean protein isolate on tensile strength and elongation at break of edible film

2.7 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜氧氣透過率和水蒸氣透過率的影響

不同大豆蛋白濃度制備可食膜的氧氣透過率和水蒸氣透過率的變化情況如圖7 所示?？瞻捉M水蒸氣透過率高達0.92 g·mm·m-2·h-1·kPa-1，當添加1%的大豆分離蛋白時可食膜的水蒸氣透過率達到最低，為0.86 g·mm·m-2·h-1·kPa-1，可能是由于蛋白均勻分散到基質里，蛋白與殼聚糖和納米纖維素充分結合，形成的可食膜結構比較致密，而且大豆分離蛋白的加入，讓水分子在擴散和溶解過程中路徑變得曲折，有效阻礙了水蒸氣在可食膜中的擴散[31]，水蒸氣透過率因此降低；當?shù)鞍诐舛雀哂?%時，水蒸氣透過率升高，這是由于蛋白與兩種多糖結合位點有限，隨著蛋白濃度的增加使得結合位點飽和，過量的蛋白分子游離在結構之外，可食膜結構松散，水分子更容易穿透可食膜[7]。1%蛋白添加量的可食膜氧氣透過率低至10.63 g·m-2·d-1，同樣是由于可食膜結構因蛋白濃度不同結構不一致，致密程度決定氧氣透過率的大小，變化規(guī)律與水蒸氣透過率形成一致。

圖7 不同含量的大豆分離蛋白對可食膜氧氣透過率和水蒸氣透過率的影響Fig.7 Effects of different concents of soybean protein isolate on oxygen and water vapor permeability of edible membrane

2.8 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜接觸角的影響

研究可食膜的接觸角大小也是研究其水分敏感性的重要方法之一，接觸角越大說明可食膜表面疏水能力越強，反之，接觸角越小說明可食膜親水性越好[32]。從表1 可以看出，在加入0.5%質量分數(shù)蛋白和1%質量分數(shù)蛋白都會顯著增強可食膜的疏水作用，其中蛋白質量分數(shù)為1%的可食膜接觸角最高達到88.32°，說明三者復合物表面親水基團減少，而過高濃度蛋白的加入使得接觸角變小，是因為出現(xiàn)大量游離氨基酸，減弱疏水性，現(xiàn)象原因與可食膜的吸水性能變化的原因一致。

表1 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜接觸角的影響Table 1 Effects of different concentrations of soybean protein isolate on contact angle of edible membrane

2.9 不同濃度大豆分離蛋白對可食膜吸水能力和溶解性的影響

食品中通常有一定量的水分，可食膜本身的結構受到水分子的影響，作為食品包裝材料若有較高的親水性最終可能會自行崩解[33-34]。不同大豆分離蛋白濃度對可食膜的吸水性能和溶解性變化規(guī)律如圖8 所示，隨著大豆分離蛋白濃度的增大，可食膜吸水率呈現(xiàn)先降低再增大的趨勢，其中1%大豆分離蛋白可食膜吸水率最低，為347.82%，這是由于大豆分離蛋白、殼聚糖與纖維素納米纖維發(fā)生靜電以及氫鍵相互作用使得納米纖維表面-OH 被結合[35]，可食膜表面親水基團減少，吸水性能降低。對于溶解性而言，由圖8 可以觀察到隨著蛋白濃度添加至1%溶解性低至51.26%，這可能是三者相互作用形成致密結構并減少親水基團，形成后的結構難溶于水，而低于或高于1%蛋白濃度均增大了可食膜的親水及溶解性，原因是形成的結構不緊密以及過高蛋白濃度對結構的破壞，對保證高水分含量食品安全、防止食品的污染起到了關鍵性作用[36-37]。

圖8 不同含量的大豆分離蛋白對可食膜的吸水性能和溶解性的影響Fig.8 Effects of different concents of soy protein isolate on water absorption and solubility of edible membrane

3 結論

本研究通過將不同濃度的大豆分離蛋白與殼聚糖、纖維素納米纖維混合制得可食膜，通過FTIR、XRD、DSC、SEM 探究其結構變化，研究蛋白濃度對可食膜的機械性能、不透明度、水蒸氣透過率、氧氣透過率及親水性的影響。FTIR 及XRD 顯示大豆蛋白添加量為1%時可食膜內部氫鍵與靜電相互作用更強，親水基團大幅度減少，分子間距離變小，形成的網(wǎng)絡結構更加致密。與其它樣品相比，蛋白質量分數(shù)為1%的可食膜在機械性能、阻隔性能等方面均有顯著（P＜0.05）提高，這些性能的提升增強了可食膜的包裝應用范圍，防止食物的氧化腐爛及水分流失，為食品貯藏運輸提供了保障。