沈鑫婷，姜秀杰，許慶鵬，張東杰*

（1 黑龍江省農業(yè)科學院食品加工研究所 黑龍江省食品加工重點實驗室黑龍江省全谷物營養(yǎng)食品工程技術研究中心 哈爾濱 150086 2 黑龍江八一農墾大學 黑龍江大慶 163000）

2 型糖尿病通常被稱為非胰島素依賴型糖尿病，是一種以持續(xù)高血糖診斷為基礎的代謝性疾病[1]。對于糖尿病的治療可以防止一些破壞性的并發(fā)癥，然而，通常不能恢復到正常血糖或消除所帶來的不良后果[2]。其特點是由慢性高血糖驅動的胰島素抵抗，通常通過血糖診斷[3]。它與基因或一些生活方式相關，到目前為止肥胖是最常見的風險因素[4]。根據世界衛(wèi)生組織（WHO2016 年）的數據，2 型糖尿病占病例的90%～95%，而且?guī)资陙淼难杆僭鲩L一直是一個國際問題[5]。目前治療糖尿病的常用降糖藥物雖具有較好的效果，但大多具有副作用[6]。開發(fā)一種天然安全的藥物成為當前研究糖尿病的重點，而來源于食品或植物中的天然活性成分因安全、健康、作用效果溫和的特點而備受青睞。

豆科植物被認為是第二重要的人類糧食作物，僅次于谷物（禾本科豆科），因為與谷物相比，它們營養(yǎng)豐富、均衡，被稱為“窮人的肉”[7-8]。綠豆，又名青小豆、菉豆、植豆等，在所有類型的豆類植物中，綠豆的營養(yǎng)價值較高[9-10]。有研究表明綠豆及其提取物具有許多其它潛在的健康益處，如降血糖、降血脂作用以及抗高血壓、抗癌、抗黑素生成、保護肝臟和免疫調節(jié)特性[11-16]。本研究利用黑龍江省特色綠豆資源作為多酚富集原料。與綠豆[17-19]相比，萌發(fā)和發(fā)酵的綠豆及其提取物具有更好的肝保護作用，而且發(fā)芽后綠豆的抗氧化活性也有所提高。發(fā)芽處理作為加工手段之一，可有效提高谷物的營養(yǎng)價值和生物活性成分含量，相比之下，當綠豆經發(fā)芽處理后，許多的大分子物質會降解成為各種小分子物質，更加利于人體的吸收，發(fā)芽綠豆比未發(fā)芽的綠豆含有更多的功能性物質[20]，其中的酚酸和類黃酮（包括牡荊素和異牡荊素）的總含量顯著增加，分別是生綠豆種子的4.5倍和6.8 倍[21-22]。酚類物質是人類日常飲食中最重要的抗氧化劑[23]，具有降血糖、降血壓等作用。發(fā)芽綠豆多酚是以綠豆為原料，經發(fā)芽處理后，采用超聲輔助乙醇提取法得到的具有生物活性的物質，本試驗前期已證明發(fā)芽綠豆多酚提取物對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，并表現出較好的體外降糖效果。而發(fā)芽綠豆多酚在小鼠體內的降血糖效果以及對肝臟組織形態(tài)的影響未做深入研究。

本試驗建立2 型糖尿病小鼠模型，對造模成功小鼠灌胃不同濃度的發(fā)芽綠豆多酚提取物，觀察其調控血糖的效果，并通過與T2DM 模型組小鼠空腹血糖、血脂水平、葡萄糖耐受量以及肝臟組織切片情況的對比，探究發(fā)芽綠豆多酚提取物對T2DM 小鼠降血糖的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

C57BL/6 小鼠（18～20）g，SPF 級，雄性，購于遼寧長生生物技術股份有限公司（許可證號：SCXK（遼）2020-0001）本實驗動物處理遵循黑龍江八一農墾大學動物倫理委員會原則?；A飼料、高脂飼料，購于南通特洛菲飼料科技有限公司。

發(fā)芽綠豆多酚，黑龍江八一農墾大學食品學院實驗室制備；鏈脲佐菌素、鹽酸二甲雙胍，上海源葉生物科技有限公司；試劑盒，南京建成生物技術有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GA-3 血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司；TU-1810 紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；酶標儀，中國邁瑞醫(yī)療公司；RE-2000A 旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽綠豆多酚的制備流程 發(fā)芽綠豆多酚制備[24-27]：將綠豆進行發(fā)芽處理（采用響應面優(yōu)化法，確定綠豆的最優(yōu)發(fā)芽工藝為：綠豆的浸泡溫度25 ℃、浸泡時間11 h、發(fā)芽溫度28 ℃、發(fā)芽時間3 d、浸泡液CaCl2濃度2 mmol/L）→烘干→粉碎→過篩→醇提→發(fā)芽綠豆多酚粗提物→濃縮→冷凍干燥→AB-8 大孔樹脂純化→冷凍干燥→制得發(fā)芽綠豆多酚。

1.3.2 2 型糖尿病模型的建立 SPF 級C57BL/6雄性小鼠在12 h 明暗交替（8：00-20：00），室溫（23±2）℃，相對濕度40%左右且通風良好的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，試驗期間自由飲食飲水。適應性喂養(yǎng)1 周，根據體重隨機分為正常對照組（n=6）和造模組（n=30），正常組和造模組分別進食基礎飼料和高脂飼料，共4 周，禁食12 h，造模組小鼠腹腔注射30 mg/kg·BW STZ，正常組注射相同體積檸檬酸緩沖液（pH=4）[28-29]。3 d 后測定小鼠空腹血糖值，在造模后第7 天檢測空腹血糖水平超過11.1 mmol/L 且伴隨表現出“三多一少”特征的小鼠被視為造模成功。

1.3.3 動物分組及給藥方法 將造模成功的小鼠隨機分為5 組：模型組（DM）、陽性對照組（MET，二甲雙胍，150 mg/kg）、高劑量組（150 mg/kg）、中劑量組（100 mg/kg）、低劑量組（50 mg/kg）。陽性對照組以及低、中、高劑量治療組分別用二甲雙胍水溶液和發(fā)芽綠豆多酚水溶液進行灌胃，其它組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃5 周。試驗期間，每天觀察動物進食量、精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤等，每周按時稱量小鼠體重。

1.3.4 空腹血糖值測定及口服葡萄糖耐受試驗每周按時禁食12 h，測定空腹血糖值。在末次給藥后，小鼠禁食不禁水6 h，以2 g/kg bw 劑量灌胃25%的葡萄糖溶液，測定灌胃第0，30，60，90，120 min 的血糖值，根據公式（1）計算血糖曲線下面積（AUC），通過曲線下面積來表達葡萄糖耐受量（OGTT）的變化。

1.3.5 小鼠臟器指數的測定 解剖后，摘取小鼠肝臟、腎臟、胰腺等組織，用生理鹽水沖洗組織，用濾紙吸干水分，稱重，并根據公式（2）計算臟器指數。

1.3.6 血清指標測定 試驗結束時，小鼠禁食12 h，乙醚麻醉，摘眼球取血，室溫下靜置30 min，低溫3 500 r/min 離心10 min，取血清，備用。

1.3.7 肝臟組織病理學觀察 取部分固定于4%多聚甲醛溶液中的新鮮肝臟組織，將其石蠟包埋、切片、染色、封片處理，于電子顯微鏡下進行病理學形態(tài)觀察。

1.4 數據統(tǒng)計分析

用SPSS 進行數據處理，結果以平均值±標準差表示，用ANOVA 及多重比較進行顯著性差異分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。用Origin 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 小鼠一般狀況及體重變化

試驗期間，觀察發(fā)現正常組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光滑，試驗前后的進食量、飲水量比較穩(wěn)定，體重逐漸增長。糖尿病模型組小鼠精神比較萎靡，毛發(fā)暗淡無光澤，與試驗前對比出現了“三多一少”癥狀。陽性對照組和各劑量干預組的小鼠體重下降趨勢減緩，精神狀態(tài)也有所好轉。如表1 所示，造模成功后，模型組小鼠體重和正常組小鼠相比，出現極顯著下降（P＜0.01）；試驗結束時，與模型組對比，灌胃發(fā)芽綠豆多酚溶液中劑量組小鼠體重顯著增加（P＜0.05），高劑量組和灌胃二甲雙胍的陽性對照組小鼠體重極顯著增加（P＜0.01）。

表1 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠體重的影響（，n=6）Table 1 Effect of germinated mung bean polyphenols on body weight of mice（，n=6）

表1 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠體重的影響（，n=6）Table 1 Effect of germinated mung bean polyphenols on body weight of mice（，n=6）

注：## 表示模型組與正常組比較差異極顯著（P＜0.01）；* 表示各組與模型組比較差異顯著（P＜0.05）；** 表示各組與模型組比較差異極顯著（P＜0.01），下同。

2.2 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠臟器指數的影響

通過臟器指數可以看出實驗動物的狀態(tài)以及病變情況。由表2 顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠的肝臟指數顯著升高了49.26%（P＜0.01）；與模型組比較，中、高劑量組和陽性對照組的肝臟指數均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。表明糖尿病小鼠會出現明顯的肝臟、腎臟腫脹現象，而二甲雙胍陽性藥物和各劑量組治療后會在一定程度上減輕臟器腫脹；也表明發(fā)芽綠豆多酚具有改善Ⅱ型糖尿病小鼠臟器指數的作用。

表2 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠臟器指數的影響（n=6）Table 2 Effect of germinated mung bean polyphenols on organ index of mice（n=6）

2.3 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠空腹血糖及糖耐量的影響

由表3 可知，正常組小鼠空腹血糖濃度比較穩(wěn)定，模型組小鼠的空腹血糖濃度在造模成功后呈現逐漸上升趨勢；與模型組相比，在治療第4 周時，中、高劑量組空腹血糖均極顯著低于模型組；在試驗結束時，低、中、高劑量組的空腹血糖濃度表現出極顯著低于模型組（P＜0.01）。空腹血糖的測定結果表明發(fā)芽綠豆多酚溶液可以改善Ⅱ型糖尿病小鼠干預期間的血糖水平，治療組中以高劑量組的多酚溶液效果最佳。

表3 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠血糖的影響（，n=6）Table 3 Effect of germinated mung bean polyphenols on blood glucose in mice（，n=6）

表3 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠血糖的影響（，n=6）Table 3 Effect of germinated mung bean polyphenols on blood glucose in mice（，n=6）

糖耐量是指對葡萄糖的耐受能力，可以根據機體耐受葡萄糖的程度來判斷給藥后胰島β 細胞對血糖的調節(jié)能力。血糖曲線下面積可以用來表示人體利用和清除葡萄糖的程度，如果數值增大，說明機體糖耐量能力下降，反之則能力升高。如表4 所示，正常組小鼠的血糖濃度隨著時間變化趨勢平緩，而模型組小鼠血糖在前30 min 快速升高，并達到峰值后又呈現下降趨勢，但血糖值一直較高。各劑量治療組的血糖值在60 min 后緩慢下降，但均未恢復到初始血糖值。由表4 可知，模型組的AUC 顯著高于正常組（P＜0.01），各劑量治療組和陽性對照組與模型組比呈現顯著性降低（P＜0.01）。結果表明，發(fā)芽綠豆多酚溶液可以在一定程度上提高Ⅱ型糖尿病小鼠的糖耐量，且從恢復程度上看，高劑量效果較好。

表4 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠糖耐量的影響Table 4 Effects of germinated mung bean polyphenols on glucose tolerance in mice

2.4 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠血清含量的影響

糖尿病與血脂水平密切相關，降低血脂水平會有助于改善糖尿病。由圖1 可知，與正常組相比，模型組小鼠的TC、TG、LDL-C 濃度均極顯著升高，HDL-C 濃度下降，這表明糖尿病小鼠已經出現了脂代謝紊亂的情況。與模型組對比，陽性對照組和低、中、高劑量組的TC 濃度分別降低了36.07%，16.86%，24.31%，27.84%（P＜0.01），LDL-C濃度也呈現顯著的下降趨勢，陽性對照組和中劑量組的TG 濃度也分別降低了25.17%，20.49%（P＜0.05），說明發(fā)芽綠豆多酚提取物對T2DM 小鼠脂代謝紊亂有較好的調節(jié)作用。

圖1 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠血脂的影響Fig.1 Effect of germinated mung bean polyphenols on blood lipid in mice

2.5 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠肝損傷的影響

ALT 和AST 酶活力的高低，是反映肝臟組織功能的一項重要指標，而通過肝臟病理能夠更直觀的判斷組織的受損情況。由圖2 可知，模型組小鼠的ALT 活力與正常組比增加了86.40%，AST 活力增加了83.39%，而各劑量組小鼠的ALT、AST活力呈現顯著降低的趨勢，與模型組對比，高劑量組和陽性對照組的小鼠ALT 活力降低了19.54%，34.33%，AST 活力降低了30.58%，33.47%。說明發(fā)芽綠豆多酚溶液低、中、高劑量組與陽性對照組能很好的降低小鼠血清ALT、AST 的活力。

圖2 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠ALT 和AST 活力的影響Fig.2 Effect of germinated mung bean polyphenols on ALT and AST activity in mice

觀察灌胃發(fā)芽綠豆多酚的各組動物解剖組織切片結果，和模型組對比，動物內臟均未出現較為嚴重的損傷情況，說明發(fā)芽綠豆多酚灌胃的劑量對動物是安全的。如圖3 所示，正常組的肝組織結構基本正常，肝細胞結構飽滿。與正常組相比，模型組的小鼠肝組織可見部分肝細胞明顯壞死，細胞核固縮溶解消失，肝細胞出現腫脹現象。陽性對照組和各劑量組小鼠肝損傷情況與模型組比有明顯改善，低、中劑量組的肝組織可見部分肝細胞仍有輕微水腫，而高劑量組和陽性對照組小鼠的肝組織結構基本正常。

圖3 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠肝組織的影響Fig.3 Effect of germinated mung bean polyphenols on liver tissue of mice

3 討論

2 型糖尿病大多是由基因遺傳和環(huán)境因素共同引發(fā)的，其主要危險因素是家族史、不良生活習慣、肥胖、血脂異常、糖耐量異常等，其癥狀體現為血糖水平升高，并在一定程度上會導致機體糖代謝紊亂[30]。本研究采用高脂飼料聯合STZ 誘導2型糖尿病小鼠模型，在發(fā)芽綠豆多酚提取物干預第5 周后，試驗結果顯示，與模型組比較，高劑量組和陽性對照組的小鼠體重顯著升高；低、中、高劑量組的空腹血糖濃度顯著降低（P＜0.01），表明一定劑量的發(fā)芽綠豆多酚提取物可以改善T2DM小鼠的"三多一少"癥狀，降低糖尿病小鼠干預期間的血糖濃度并在一定程度上增強其糖耐受程度。本試驗抑制血糖水平結論與邢莎莎等[31]、劉芷君等[29]研究結果一致。T2DM 是以糖脂代謝紊亂為主的代謝性疾病，進而導致組織、器官以及消化系統(tǒng)等病變[32]。本試驗中，與模型組比較，發(fā)芽綠豆多酚提取物劑量組的TC、TG、HDL-C、LDL-C 的水平均有顯著變化，與馬永強等[33]的研究結果一致。表明發(fā)芽綠豆多酚提取物可以在一定程度上調節(jié)糖尿病小鼠的血脂水平，其調節(jié)機制還有待于進一步探究。

肝臟作為調節(jié)血糖濃度的主要器官，參與糖的代謝過程，器官損傷與糖尿病密切相關。本試驗中，陽性對照組和發(fā)芽綠豆多酚提取物劑量組干預后，顯著降低了臟器指數，推測可能具有改善2型糖尿病小鼠臟器功能的作用。研究表明，如果肝細胞出現損傷時，ALT 和AST 會被釋放到血液中，則血液中ALT 和AST 水平會出現升高，表明血液中ALT 和AST 水平與肝組織的損傷情況密切相關[34]。本試驗中，高劑量組小鼠ALT 和AST活力顯著降低了19.54%，30.58%，推測可能說明發(fā)芽綠豆多酚溶液一定劑量范圍內能很好的降低小鼠血清ALT、AST 的活力，同時能修復小鼠肝細胞溶解現象，使肝損傷情況得到改善，該機理還有待進一步研究。有研究證明全綠豆和發(fā)芽的綠豆是一種有效的肝保護劑，能夠以劑量依賴的方式降低肝酶活性和肝組織病理學[35]。

綜上所述，發(fā)芽綠豆多酚提取物可以顯著改善T2DM 小鼠的血糖、血脂水平，同時對肝損傷起到一定程度的修復作用。表明了發(fā)芽綠豆多酚是一種具有開發(fā)潛力和研究價值的天然降糖物質，在糖尿病治療中的應用具有廣闊的前景。