李 夏，陳杭君，夏 魏，鄭永華，金 鵬，牛 犇，房祥軍，吳偉杰，3*，郜海燕*

（1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310002 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 南京 210095 3 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310021）

核桃（Juglans regia L.）和扁桃、腰果、榛子三者合稱為“四大干果”[1]。核桃富含人體所需的脂肪酸、蛋白質(zhì)、多酚類(lèi)、糖類(lèi)、黃酮類(lèi)及多種微量元素與膳食纖維等[2-3]。核桃中油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52%～70%，且油脂以不飽和脂肪酸為主，約占82%～85%，蛋白占比24%左右，富含多種必需氨基酸[4]。核桃是人體優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源，具有健腦益智，延緩細(xì)胞衰老以及增強(qiáng)免疫力的功效，并對(duì)心血管疾病也有一定的輔助功效[5-6]。目前對(duì)核桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的開(kāi)發(fā)和功能活性的研究還不夠深入，對(duì)核桃的消化代謝及活性研究較少，導(dǎo)致其產(chǎn)品創(chuàng)新研發(fā)受阻[7]。在核桃產(chǎn)品的生產(chǎn)加工中，還存在未能充分利用的營(yíng)養(yǎng)成分，造成營(yíng)養(yǎng)浪費(fèi)的現(xiàn)象。如何全面開(kāi)發(fā)利用核桃的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也成為產(chǎn)業(yè)營(yíng)養(yǎng)健康發(fā)展的聚焦點(diǎn)[8]。

體外消化系統(tǒng)是在體外條件下模擬體內(nèi)消化吸收情況，以達(dá)到還原人體胃腸道生理過(guò)程的目的[9]。它可以完全或部分替代活體試驗(yàn)，具有成本較低、耗時(shí)短、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[10]。在研究膳食消化時(shí)，最常用的是多酶系多腔室靜態(tài)模型，其主要優(yōu)勢(shì)之一是固定模擬消化食物的條件，并盡量保證消化模型的統(tǒng)一[11]。此方法可用于分析消化產(chǎn)物和評(píng)估食物基質(zhì)中微量元素的釋放，以此來(lái)評(píng)估食物消化至終點(diǎn)或某時(shí)間點(diǎn)時(shí)的情況[12]。

食物消化過(guò)程中的pH 值及各種消化酶類(lèi)對(duì)食物的抗氧化特性有一定影響，營(yíng)養(yǎng)成分提取物的功能活性與消化后的實(shí)際利用情況存在差異。韓海濤等[13]發(fā)現(xiàn)在相同質(zhì)量濃度下，核桃蛋白中的清蛋白對(duì)DPPH 自由基清除能力最高，其次為醇溶蛋白，均高于二丁基羥基甲苯（Butylated Hydroxyl Toluene）。這與其氨基酸組成、分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此能有效抗衰老和防御多種心腦血管疾病[14]。核桃多肽也具有一定抗氧化能力，并具有一定的量效關(guān)系[15]。弘子姍等[16]用酶解法提取核桃多肽，當(dāng)多肽質(zhì)量濃度0.5 g/mL 時(shí)，其DPPH 清除率87%，ABTS+清除率84%，羥基自由基清除率82%，鐵離子還原能力達(dá)45%，說(shuō)明核桃多肽具有一定的抗氧化能力[17]。

由于核桃油中含有較多的多不飽和脂肪酸，因此易發(fā)生氧化變質(zhì)[18]，使核桃油產(chǎn)品貨架期縮短。核桃油的抗氧化能力還可用來(lái)評(píng)價(jià)油脂的品質(zhì)特性[19]。彭星星等[20]研究表明，核桃油含有多種生物活性物質(zhì)，如黃酮、生育酚、甾醇等，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，然而，核桃油中的天然活性物質(zhì)會(huì)隨時(shí)間呈現(xiàn)急劇減少的變化特征，對(duì)自由基的清除能力逐漸降低，抗氧化能力也降低。

本文以“新新2”核桃為研究對(duì)象，提取油脂和蛋白質(zhì)兩類(lèi)主成分進(jìn)行相關(guān)研究。采用GC-MS和HPLC-MS/MS 分析核桃消化過(guò)程中油脂和蛋白質(zhì)含量的變化，體外消化特性及消化產(chǎn)物的抗氧化活性，旨在為研發(fā)核桃油內(nèi)源性天然抗氧化劑，核桃產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃品種為 “新新2” 核桃（Juglans regia‘Xinxin 2’）（原產(chǎn)地新疆），購(gòu)于洽洽食品股份有限公司。胰脂肪酶、胰酶、胰蛋白酶、豬膽鹽，阿拉丁生化科技有限公司；三氯乙酸、過(guò)硫酸鉀、鐵氯化鉀、三氯化鐵、硫酸銅、酒石酸鉀，分析純，阿拉丁生化科技有限公司；福林酚，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；游離脂肪酸含量試劑盒，科銘生物技術(shù)有限公司；氨基酸含量測(cè)定試劑盒，侖昌碩生物有限公司；DPPH 自由基清除試劑盒，南京建成科技有限公司；甲醇、正己烷、異丙醇，色譜純，CNW Technologies GmbH；乙腈，色譜純，德國(guó)默克集團(tuán)；D35-氘代硬脂酸，純度為98%，德國(guó)默克集團(tuán)；三甲基硅烷基重氮甲烷，在正己烷中含量為2moL/L，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

LR56495 臺(tái)式離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；THZ-C-1 恒溫冷凍振蕩器，海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；DK-8D 電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LC20AD-API 3200MD TRAP HPLC-MS/MS，日本島津公司；7890B 氣相色譜，安捷倫科技有限公司；ReadMax1900 酶標(biāo)儀，上海閃普生物科技；UV-9000 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃油脂和蛋白的提取 參考閆圣坤等[21]的方法，采用冷榨法提取核桃油脂，設(shè)置溫度170℃榨取核桃油。參考劉猛等[22]的方法，采用酸沉堿提法分離純化核桃蛋白質(zhì)，將核桃粕與蒸餾水按質(zhì)量比1∶25 混合，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值為9，堿提；用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為5，酸沉。

1.3.2 模擬體外消化試驗(yàn)方法 試驗(yàn)分組：設(shè)置蛋白質(zhì)組即Pr 組（樣品只含核桃蛋白）、7∶3 組（樣品中核桃蛋白質(zhì)與油脂質(zhì)量比7∶3）、1∶1 組（樣品中核桃蛋白質(zhì)與油脂質(zhì)量比1∶1）、3∶7 組（樣品中核桃蛋白質(zhì)與油脂質(zhì)量比3∶7）、油脂組即Oil 組（樣品只含有核桃油）。

模擬胃消化階段：稱取3.10 g 氯化鈉、1.10 g氯化鉀、0.30 g 二水氯化鈣、0.60 g 碳酸氫鈉溶解在1 L 蒸餾水中，配成胃電解質(zhì)溶液。配制1 mol/L乙酸鈉溶液并調(diào)節(jié)pH=5。所有溶液預(yù)熱至37 ℃。取17 樣品、255 mL 胃電解質(zhì)、59.50 mg 胃蛋白酶、0.51 mL 乙酸鈉溶液于錐形瓶中，用1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2～3，37 ℃，80 r/min 搖床溫育2 h。分別于20，40，120，140，160，180 min 和240 min處取樣，90 ℃水浴滅酶30 min，10 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液，冷凍干燥，待測(cè)。

模擬腸消化階段：稱取5.40 g 氯化鈉、0.65 g氯化鉀、0.33 g 二水氯化鈣溶解在1 L 蒸餾水中，配成腸電解質(zhì)溶液，7%胰酶-PBS 溶液，4%膽鹽-PBS 溶液。量取50 mL 腸電解質(zhì)、50 mL 胰酶-PBS溶液、100 mL 膽鹽-PBS 溶液、59.50 mg 胰脂肪酶、0.013 g 胰蛋白酶，加入剩余胃消化液中，用0.10 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7，37 ℃，80 r/min 搖床溫育2 h。分別于20，40，120，140，160，180 min和240 min 取樣，90 ℃水浴滅酶30 min，10 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，冷凍干燥[23]，待測(cè)。

1.3.3 多肽含量的測(cè)定 參考高英等[24]方法，配制堿性銅A 試劑和酒石酸鉀B 試劑，3.42 mg/mL牛血清白蛋白對(duì)照品溶液，分別取樣品溶液加水稀釋30 倍待測(cè)。

根據(jù)對(duì)照品溶液含量及吸收值，計(jì)算可得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

其中相關(guān)系數(shù)R2=0.9909。

1.3.4 游離氨基酸含量的測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明，在570 nm 處測(cè)定吸光度A：

由此計(jì)算可得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

式中：x——標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y——ΔA。

游離氨基酸含量計(jì)算公式：

式中，D——稀釋倍數(shù)，未稀釋為1。

1.3.5 游離氨基酸種類(lèi)的測(cè)定 樣品預(yù)處理：稱取0.1 g 樣品加入2 mL 鹽酸，充氮?dú)獗Ｗo(hù)，密封110 ℃消化24 h。取100 μL 消化液，濃縮至20 μL，加980 μL 超純水。

衍生化過(guò)程：取混標(biāo)、待測(cè)樣本50 μL，加50 μL 蛋白沉淀劑，混勻后13 200 r/min 冷凍離心4 min。取8 μL 上清液，加42 μL 標(biāo)記緩沖液混勻瞬離。再加20 μL 衍生液混勻、瞬離后置55 ℃恒溫衍生15 min。衍生后樣本置冰箱，冷卻后混勻瞬離，取50 μL 于HPLC-MS/MS 檢測(cè)。

液相條件：色譜柱：MSLab45+AA-C18（150 mm×4.60 mm，5 μm）；柱溫：50 ℃，流速：1 mL/min；流動(dòng)相：A 為有機(jī)相：乙腈（A+B 調(diào)節(jié)劑）；B 為水相：超純水（A+B 調(diào)節(jié)劑）；進(jìn)樣量：3 μL。梯度見(jiàn)表1 所示。

表1 液相梯度洗脫設(shè)置Table 1 Liquid phase gradient meter

質(zhì)譜條件：離子源：+ESI 電噴霧離子源；IS：+5500 V（噴霧電壓）；GS1：0.38 MPa（霧化氣）；GS2：0.41 MPa（輔助氣）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；CAD：Medium（碰撞氣）；TEM：500 ℃（霧化溫度）；CUR：0.14 MPa（氣簾氣）；CXP：2.0 eV（碰撞室射出電壓）；EP：10 eV（射入電壓）。

1.3.6 游離脂肪酸含量的測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定吸光值，記為A。經(jīng)計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線：

由此可得游離脂肪酸含量計(jì)算公式：

式中，V1——加入樣本體積，1 mL；V2——提取液體積，1.2 mL；A——吸光度；M——樣品質(zhì)量，g。

1.3.7 游離脂肪酸種類(lèi)的測(cè)定 樣本預(yù)處理：取1 mL 樣品加入500 μL 提取液（異丙醇∶正己烷體積比2 ∶3，含內(nèi)標(biāo)0.20 mg/L），加入鋼珠渦旋混勻30 s，用研磨儀處理4 min（40 Hz），超聲5 min（冰水?。?，重復(fù)3 次。然后，將樣本于4 ℃12 000 r/min 離心15 min，取上清。剩余樣本中加入500 μL上述提取液，重復(fù)渦旋、研磨冰浴和離心步驟。取上清，混合渦旋10 s。將上述兩種提取液的上清液混合，取800 μL 于2 mL 試管中，氮?dú)獯蹈?。加?00 μL 甲醇-三甲基硅烷基重氮甲烷溶液（二者體積比1∶2），室溫靜置30 min 后氮?dú)獯蹈?。加?60 μL 正己烷復(fù)溶，12 000 r/min 離心1 min，取上清進(jìn)行GC-MS 檢測(cè)。

參數(shù)設(shè)置：進(jìn)樣量：1 μL；分流模式：Split Mode（5∶1）；隔墊吹掃流速：3 mL/min；載氣：氦氣；色譜柱：DB-FastFAME（90 m×250 μm×0.25 μm）；柱壓：0.32 MPa；柱箱升溫程序：1 min 升至50 ℃，15 min 升至200 ℃（50 ℃/min），1 min 升至210 ℃（2 ℃/min），15 min 升至230°C（10 ℃/min）；前進(jìn)樣口溫度：240 ℃；傳輸線溫度：240 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；電離電壓：-70 eV；質(zhì)量范圍m/z：33～400；掃描模式：Scan/SIM；溶劑延遲：7 min。

定量結(jié)果：計(jì)算公式：

式中，C（con）——樣本中游離脂肪酸的含量，μg/g；CS——復(fù)溶液游離脂肪酸的質(zhì)量濃度，ng/mL；V1——復(fù)溶體積，mL；V2——加入提取液的體積，μL；V3——取出提取液的體積，μL；M——稱重質(zhì)量，mg。

1.3.8 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 取消化終產(chǎn)物，設(shè)置10，20，30，40，50 mg/mL 5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，按照試劑盒說(shuō)明操作。

式中，A測(cè)定——測(cè)定管的吸光度；A對(duì)照——對(duì)照管的吸光度；A空白——空白管的吸光度。

1.3.9 清除ABTS+能力的測(cè)定 取消化終產(chǎn)物，設(shè)置10，20，30，40，50 mg/mL 5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，參考邵洋洋等[25]方法，在波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定吸光度。計(jì)算公式：

式中，A0——蒸餾水+ABTS 工作液的吸光度；A1——樣品+ABTS 工作液的吸光度。

1.3.10 三價(jià)鐵離子還原能力的測(cè)定 取消化終產(chǎn)物，設(shè)置10，20，30，40，50 mg/mL 5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，參考曲文娟等[26]方法，在700 nm 處測(cè)定反應(yīng)液的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2021 進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總處理，采用GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行方差分析并繪制統(tǒng)計(jì)圖。試驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用不同符號(hào)或字母表示具有顯著差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外消化過(guò)程中核桃游離脂肪酸含量的變化

脂肪的消化主要集中在小腸的上部，它被各種酶和膽汁酸鹽水解成甘油和脂肪酸[27]。核桃油在體外消化過(guò)程中游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）的變化如圖1 所示。隨著消化的進(jìn)行，F(xiàn)FA含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，從13.61 nmol/g 增到20.94 nmol/g。120～180 min 為腸消化階段，腸道中有胰脂肪酶，主要負(fù)責(zé)脂質(zhì)的消化，游離脂肪酸在此期間增加明顯，與脂肪相比，游離脂肪酸更易被人體吸收利用，是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有助于促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育。核桃油主要在腸消化階段被分解為游離脂肪酸并被人體吸收代謝。因僅測(cè)定游離脂肪酸的總含量無(wú)法明確核桃油消化產(chǎn)物的具體變化情況，故對(duì)5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的消化產(chǎn)物組分進(jìn)行GC-MS 檢測(cè)。

2.2 體外消化過(guò)程中核桃游離脂肪酸組分分析

采用GC-MS 定量檢出49 種游離脂肪酸，在體外消化試驗(yàn)所取樣品中共檢出22 種游離脂肪酸有含量變化，具體種類(lèi)及含量見(jiàn)表2 所示。亞油酸含量在消化過(guò)程中始終維持最高，在180～240 min 期間含量顯著增加（P＜0.05），亞油酸是ω-6型脂肪酸，有助于預(yù)防心腦血管疾病和降血脂等；游離脂肪酸總量呈上升趨勢(shì)，從1 080 μg/g 增到413 199.89 μg/g，與上述指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果保持一致，且在120～180 min 期間，游離脂肪酸總量顯著提高（P＜0.05），從27 451.01 μg/g 增至283 616.18 μg/g。其中有8 種脂肪酸是0 min 時(shí)未檢出，而后續(xù)消化分解產(chǎn)生的。順式-11-二十碳烯酸和反式-10-十九碳烯酸的變化最顯著（P＜0.05），此類(lèi)脂肪酸在人體中可起到滋潤(rùn)皮膚、潤(rùn)腸通便等作用。游離脂肪酸增量在0～120 min 時(shí)相對(duì)平緩，在120～240 min 時(shí)增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)消化產(chǎn)物的FFA 組分進(jìn)行聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，如圖2 所示，消化180 min 時(shí)的產(chǎn)物組分與消化240 min 時(shí)的產(chǎn)物組分相近，與前3 個(gè)時(shí)間段差異較大。0 min 即未消化和消化60 min 時(shí)與后續(xù)產(chǎn)物組分存在差異，其中消化120 min 時(shí)的產(chǎn)物組分與其它4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異明顯。綜上結(jié)果，初步判斷油脂的主要消化部位在腸道，是因?yàn)樵谀c消化階段游離脂肪酸含量明顯增加，與姚軼俊[28]的研究結(jié)果相近，腸道的胰脂肪酶是消化脂肪的主要酶類(lèi)，大部分油脂在腸消化階段才被分解為游離脂肪酸。

圖2 消化產(chǎn)物中FFA 聚類(lèi)分析圖Fig.2 Cluster analysis of FFA in digestive products

表2 不同消化時(shí)間點(diǎn)22 種游離脂肪酸（FFA）含量特征Table 2 Content characteristics of 22 kinds of free fatty acids（FFA）at different digestion time points

2.3 體外消化過(guò)程中核桃多肽及游離氨基酸含量的變化

人體內(nèi)的消化酶主要由胃蛋白酶和胰蛋白酶構(gòu)成，它們與胃酸共同作用即可水解蛋白質(zhì)[29]。在體外消化模擬過(guò)程中，多肽含量呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)，如圖3a 所示。在消化120 min 時(shí)達(dá)到最大值0.37 mg/mL，整體變化較平緩，從消化初始到消化終點(diǎn)，多肽含量從0.34 mg/mL 增到0.36 mg/mL。如圖3b 所示，核桃蛋白質(zhì)隨著消化的進(jìn)行，逐漸分解為氨基酸，使游離氨基酸（Free Amino Acid，AA）總量從0 min 時(shí)的0.59 μmol/mL 升至240 min 時(shí)的17.75 μmol/mL，在120 min 后進(jìn)入腸消化階段，氨基酸增量明顯升高。推測(cè)0～120 min 為胃消化階段，蛋白被分解為多肽，導(dǎo)致多肽含量增加；120～240 min 為腸消化階段，部分多肽逐漸被分解為氨基酸，整體多肽含量減少，而游離氨基酸總量明顯增加，說(shuō)明蛋白質(zhì)經(jīng)胃和腸道的消化分解依次產(chǎn)生多肽和蛋白質(zhì)兩級(jí)產(chǎn)物，短肽和游離氨基酸更有利于人體吸收利用，且功能活性優(yōu)于直接吸收蛋白質(zhì)。

圖3 核桃蛋白質(zhì)在體外消化過(guò)程中多肽及游離氨基酸含量的變化Fig.3 The changes of polypeptide and free amino acid contents in walnut protein during digestion in vitro

2.4 體外消化過(guò)程中核桃多肽及游離氨基酸組分分析

采用HPLC-MS/MS 分析具有代表性的20 種游離氨基酸含量。0 min 時(shí)樣品即核桃蛋白，隨消化進(jìn)行，不同時(shí)間點(diǎn)游離氨基酸含量的變化情況見(jiàn)表3 所示?？梢钥闯?，0 min 時(shí)核桃蛋白中含量最高的是色氨酸0.71 μg/g，當(dāng)消化240 min 時(shí)，含量最高的是精氨酸25.50 μg/g。消化過(guò)程中精氨酸和賴氨酸的含量增加明顯，精氨酸有助于軟化血管，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，賴氨酸有助于提高人體免疫力，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育。半胱氨酸與冠心病等心腦血管疾病有關(guān)[30]，而研究發(fā)現(xiàn)核桃蛋白質(zhì)中不含有半胱氨酸，且隨消化進(jìn)行不會(huì)產(chǎn)生半胱氨酸，因此核桃蛋白質(zhì)可作為維持人體健康的優(yōu)質(zhì)營(yíng)養(yǎng)源；游離氨基酸總量從3.50 μg/g 增至61.85 μg/g，在120～180 min 有明顯上升，從20.79 μg/g 增至47.46 μg/g，與上述指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果保持一致。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)消化產(chǎn)物的AA 組分進(jìn)行聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，如圖4 和圖5 所示，消化60 min 時(shí)的產(chǎn)物組分與消化0 min 即未消化時(shí)的產(chǎn)物組分相近，消化180 min 時(shí)的產(chǎn)物組分與消化240 min 時(shí)的產(chǎn)物組分相近，而消化前60 min 與消化120 min后產(chǎn)物組分有明顯差異。蛋白質(zhì)的消化產(chǎn)物主要以氨基酸和肽段的形式被生物體吸收[31]。小腸中所含有的消化酶種類(lèi)成分復(fù)雜，能進(jìn)一步水解胃消化產(chǎn)生的氨基酸和肽[31]。綜上結(jié)果，初步判斷蛋白質(zhì)的主要消化部位在腸道。

圖4 消化產(chǎn)物中AA 聚類(lèi)分析圖Fig.4 Cluster analysis of AA in digestive products

圖5 消化產(chǎn)物中AA 聚類(lèi)分析圖Fig.5 Cluster analysis of AA in digestive products

表3 不同消化時(shí)間點(diǎn)20 種游離氨基酸（AA）具體含量Table 3 Specific contents of 20 kinds of free amino acids（AA）at different digestion time points

2.5 核桃主成分消化產(chǎn)物抗氧化能力

隨著消化產(chǎn)物濃度的增加，5 個(gè)試驗(yàn)組都保持上升趨勢(shì)。如圖6 所示，Pr 組的整體DPPH 清除能力較高，在消化終產(chǎn)物濃度為50 mg/mL 時(shí)有最高清除率為80.65%；Oil 組相對(duì)清除能力最弱，在消化終產(chǎn)物濃度為50 mg/mL 時(shí)其最高清除率僅40.61%；不同比例復(fù)配組中7∶3 比例組清除效果較好，最高清除率為75.88%，3∶7 比例組清除效果較差，最高清除率僅53.70%。初步推斷核桃蛋白質(zhì)的DPPH 清除能力比油的DPPH 清除能力好。如圖7 所示，除Oil 組，其它4 組在消化終產(chǎn)物濃度為50 mg/mL 時(shí)的清除率趨于一致；Pr 組的整體ABTS+清除能力較高，在50 mg/mL 時(shí)有最高清除率81.02%；Oil 組清除能力最弱，在50 mg/mL 時(shí)其最高清除率為60.14%；不同比例復(fù)配組中7∶3比例組清除效果較好，最高清除率為79.05%，1∶1比例組清除效果較差，最高清除率僅74.61%。初步推斷核桃蛋白質(zhì)的ABTS+清除能力比油的ABTS+清除能力強(qiáng)。如圖8 所示，7∶3 和3∶7 復(fù)配比例組的還原能力在消化終產(chǎn)物濃度為50 mg/mL 時(shí)趨于一致，1∶1 組和Oil 組在質(zhì)量濃度為30 mg/mL 時(shí)吸光度值很接近；Pr 組的整體鐵離子還原能力較高，在消化終產(chǎn)物質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)測(cè)定其在700 nm 處的吸光度，最高值為1.55；Oil 組清除能力最弱，在消化終產(chǎn)物質(zhì)量濃度為50 mg/mL 時(shí)其吸光度值為0.88；不同比例復(fù)配組中7 ∶3 比例組清除效果較好，最高吸光度值為1.46，1∶1 比例組清除效果較差，最高吸光度值僅1.20。初步推斷核桃蛋白質(zhì)的鐵離子還原能力比油的鐵離子還原能力強(qiáng)。

圖6 核桃蛋白質(zhì)和油脂在體外消化過(guò)程中DPPH 清除率的變化Fig.6 Changes of DPPH clearance of walnut protein and oil during digestion in vitro

圖7 核桃蛋白質(zhì)和油脂在體外消化過(guò)程中ABTS+清除率的變化Fig.7 Changes of ABTS+ clearance of walnut protein and oil during digestion in vitro

圖8 核桃蛋白質(zhì)和油脂在體外消化過(guò)程中鐵離子還原力的變化Fig.8 Changes of iron reducing power of walnut protein and oil during digestion in vitro

核桃蛋白包括醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白、谷蛋白-1 和谷蛋白-2，這5 種蛋白質(zhì)均具有一定的抗氧化性[15]。核桃蛋白具有較高的抗氧化活性與小分子多肽含量有關(guān)[33]，同時(shí)與其氨基酸組成、分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)有關(guān)[15]。核桃油的抗氧化能力主要與酚類(lèi)物質(zhì)相關(guān)，酚類(lèi)物質(zhì)通過(guò)獲得羥基自由基、過(guò)氧自由基和烷氧自由基，起到抗氧化作用[1]。結(jié)合上述HPLC-MS/MS 和GC-MS 分析結(jié)果可知，由于核桃蛋白質(zhì)在消化階段會(huì)產(chǎn)生多肽和氨基酸兩種次級(jí)代謝物，均具有良好的抗氧化性，推斷其抗氧化性與多肽含量和氨基酸組成有關(guān)，多肽分子質(zhì)量越小，氨基酸含量越高，抗氧化性越強(qiáng)。核桃油經(jīng)消化分解主要產(chǎn)生代謝產(chǎn)物為脂肪酸，推斷其抗氧化性與脂肪酸含量相關(guān)[19]。隨著消化的進(jìn)行，產(chǎn)生的短鏈脂肪酸含量越高，酚類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量越少，越容易被氧化，因此其抗氧化性弱于蛋白質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)核桃粉中含油量越高，其貨架期越短[34]，復(fù)合核桃油的抗氧化能力也明顯優(yōu)于純核桃油[35]。添加外源性抗氧化劑，與提高核桃油抗氧化性之間起到協(xié)調(diào)增效作用，而核桃油本身也含一定的抗氧化活性物質(zhì)，有助于結(jié)合內(nèi)源的抗氧化成分，優(yōu)化核桃油抗氧化劑的配方，以此達(dá)到有效延長(zhǎng)易氧化核桃產(chǎn)品貨架期的目的[36]?？梢钥紤]通過(guò)添加核桃內(nèi)源性氨基酸，如精氨酸和賴氨酸等，在不降低核桃產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的前提下，延長(zhǎng)其貨架期。

3 結(jié)論

利用體外模擬消化試驗(yàn)明確核桃主要成分蛋白和油脂的代謝變化特征，并對(duì)兩種物質(zhì)的抗氧化性進(jìn)行探究。結(jié)果表明：0～120 min 為胃消化階段，產(chǎn)物中多肽含量、游離氨基酸含量和游離脂肪酸含量顯著增加（P＜0.05），多肽從0.34 mg/mL 增到0.37 mg/mL，游離氨基酸從3.50 μg/g 增到20.79 μg/g，游離脂肪酸從1 080 μg/g 增 到27 451.01 μg/g；120～180 min 為腸消化階段，多肽含量逐漸降低，游離氨基酸和游離脂肪酸含量顯著提高（P＜0.05），多肽從0.37 mg/mL 降到0.36 mg/mL，游離氨基酸從20.79 μg/g 增到61.85 μg/g，游離脂肪酸從27 451.01 μg/g 增到413 199.89 μg/g。通過(guò)體外消化終產(chǎn)物抗氧化能力分析，發(fā)現(xiàn)核桃蛋白質(zhì)的抗氧化能力比油脂的抗氧化能力強(qiáng)，在同時(shí)存在蛋白質(zhì)和油脂的情況下，沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。以上結(jié)論表明核桃油和蛋白質(zhì)的主要消化部位在腸道，核桃蛋白的抗氧化性高于核桃油，二者混合不利于抗氧化性的提高，在等比混合時(shí)甚至導(dǎo)致抗氧化性更差。本研究結(jié)果為核桃油內(nèi)源性天然抗氧化劑的研發(fā)，以及開(kāi)發(fā)高抗氧化性核桃功能產(chǎn)品提供研究思路。