梁名志，呂海鵬，楊天銘

（1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南 昆明 650205；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3. 云南大學(xué)，云南 昆明 650091）

德昂族酸茶是德昂族長期飲用和食用的一種極具特色的傳統(tǒng)微生物發(fā)酵茶產(chǎn)品，制作工藝及品質(zhì)風(fēng)味獨(dú)特，被列為第4 批云南省省級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)代表性項(xiàng)目名錄，“德昂族酸茶制作技藝”也入選了第五批國家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)代表性項(xiàng)目名錄。有研究發(fā)現(xiàn)，德昂族酸茶水提物可改善高脂飲食小鼠血脂水平，減少肝組織的脂肪變性，具有一定的保肝作用[1]；還具有預(yù)防大鼠非酒精性脂肪肝的作用[2]；此外，德昂族酸茶可維持高脂飲食小鼠腸道微生態(tài)的平衡，降低厚壁菌門與擬桿菌門的比值，對(duì)減肥具有積極的意義[3]。另有一些相關(guān)研究指出，酸茶還具有多種保健功效，如降壓安神、改善睡眠、抗氧化、抗焦慮、抗腫瘤、延緩衰老及調(diào)節(jié)免疫等[4]；酸茶富含益生菌，具有一定的開發(fā)價(jià)值[5]；應(yīng)該加大對(duì)德昂族酸茶功效的研究力度[6]。因此，目前開展德昂族酸茶中的化學(xué)成分的研究工作具有重要的意義，有助于揭示德昂族酸茶風(fēng)味品質(zhì)和保健功效的重要化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為德昂族酸茶的品質(zhì)評(píng)價(jià)、新產(chǎn)品開發(fā)及加工工藝提升等提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

酸茶樣品，來自于云南德鳳茶業(yè)有限公司2018年生產(chǎn)的產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 德昂族酸茶中主要化學(xué)成分測定

水分含量測定參照國標(biāo)GB 5009.3—2016 操作方法；水浸出物含量測定參照國標(biāo)GB/T 8305—2013操作方法；茶多酚、兒茶素類物質(zhì)含量測定參照國標(biāo)GB/T 8305—2018 操作方法；咖啡堿含量測定參照國標(biāo)GB/T 8312—2013 測定方法；氨基酸組成測定采用氨基酸自動(dòng)分析儀；有機(jī)酸和維生素成分測定采用基質(zhì)輔助激光解析-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS） 方法。

1.2.2 德昂族酸茶中非揮發(fā)性成分分析

酸茶樣品代謝物鑒定采用超高效液相色譜（SHIMADZU Nexera X2） 和串聯(lián)質(zhì)譜（Applied Biosystems 4500 QTRAP） （UPLC-MS/MS） 法，委托邁維（武漢） 生物技術(shù)有限公司開展分析。

樣品制備：利用研磨儀（MM 400，Retsch） 研磨（30 Hz，1.5 min） 至粉末狀；稱取100 mg 的粉末，溶解于70%甲醇提取液1.2 mL 中；每30 min 渦旋1 次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6 次，樣本置于4 ℃冰箱中過夜；以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min 后，吸取上清，用微孔濾膜（0.22 μm pore size） 過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。

液相條件：①色譜柱：Agilent SB-C181.8 μm，2.1 mm×100 mm；②流動(dòng)相：A 相為超純水（加入0.1%的甲酸），B 相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；③洗脫梯度：0 min B 相比例為5%，0 min 內(nèi)B 相比例線性增加到95%，并維持在1 min，10.00～11.00 min，B 相比例降為5%，并以5%平衡至14 min，流速0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量4 uL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（IS） 5 500 V（正離子模式） /-4 500 V（負(fù)離子模式）；離子源氣體Ⅰ（GSⅠ），氣體Ⅱ（GSⅡ） 和簾氣（CUR） 分別設(shè)置為50，60，25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離（CAD） 參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿（QQQ） 掃描和線性離子阱（LIT）模式下分別用10 和100 μmol/L 聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ 掃描使用多反應(yīng)檢測（MRM） 模式，并將碰撞氣體（氮?dú)猓?設(shè)置為中等。

1.2.3 德昂族酸茶中揮發(fā)性成分分析

香氣成分分析采用SBSE-GC-MS 方法[7]。

SBSE 香氣富集：準(zhǔn)確稱取600 mg 茶粉與500 mg氯化鈉加入20 mL 頂空瓶中，加入10 mL 沸水平衡1 min 后，加入PDMS 攪拌子，在磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速1 200 r/min 攪拌萃取30 min 后取出攪拌子，并用純凈水洗凈攪拌子表面殘留茶粉，無紡布擦干后暫存放于1.5 mL 小瓶中待測。

GC-MS 分析：色譜參數(shù)為初始溫度50 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min 的速度升溫至170 ℃，保持5 min 后，以10 ℃/min 升溫至265 ℃，保持5 min。溶劑排空模式，以高純度氦（＞99.9%） 為載體，流速1.6 mL/min。質(zhì)譜參數(shù)如下：離子源為EI，溫度220 ℃，電子能量70 eV。質(zhì)量掃描范圍30～600 amu。定性分析：通過NIST 2014 數(shù)據(jù)庫對(duì)GC-MS 檢測的化合物定性，依據(jù)正構(gòu)烷烴測得各化合物的保留指數(shù)試驗(yàn)值，與數(shù)據(jù)庫中理論值對(duì)比，要求兩者差值在20 以內(nèi)。定量分析以相對(duì)含量表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 德昂族酸茶樣品中主要化學(xué)成分分析

茶葉中水浸出物是指在規(guī)定條件下，用沸水浸出茶葉中的水可溶性物質(zhì)的統(tǒng)稱，是茶湯的主要呈味物質(zhì)，包括可溶性糖、茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿等物質(zhì)，其含量水平對(duì)茶葉品質(zhì)有重要影響。

酸茶中主要化學(xué)成分的含量見表1。

表1 酸茶中主要化學(xué)成分的含量

由表1 可知，酸茶樣品中水浸出物含量占干質(zhì)量的49.60%，表明德昂族酸茶中內(nèi)含物質(zhì)比較豐富。此外，另有研究曾報(bào)道德昂酸茶中水浸出物含量高達(dá)52.70%[8]。

茶多酚是茶葉中的重要品質(zhì)成分和活性物質(zhì)，在茶湯中一般呈現(xiàn)苦澀味，其中兒茶素類是茶多酚的主體物質(zhì)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，酸茶中茶多酚的含量占干質(zhì)量的27%，而兒茶素總量（5.87%） 僅占茶多酚總量的21.74%，占比比較低。這主要與酸茶的微生物發(fā)酵過程中多酚類成分的氧化聚合和生物降解有關(guān)[10]。德昂族酸茶中表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（D、L-C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG） 含量分別為2.25%，0.86%，0.18%，2.33%，0.25%，其中非酯型兒茶素含量較高，而酯型兒茶素含量較低，含量規(guī)律與以往文獻(xiàn)[8]報(bào)道的研究結(jié)果接近。

咖啡堿是茶葉中的主要嘌呤堿，是構(gòu)成茶湯滋味的重要物質(zhì)，也是茶葉理化審評(píng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一。德昂族酸茶樣品中咖啡堿含量為3.6%，與常規(guī)茶產(chǎn)品差異不大?？扇苄蕴鞘遣铚兄匾奶鹞冻煞郑瑢?duì)茶湯滋味品質(zhì)有重要影響。德昂族酸茶樣品中可溶性糖含量為3.70%，與常規(guī)茶產(chǎn)品的4%的含量水平比較接近[11]。有研究表明，酸茶發(fā)酵過程中，濕熱作用和微生物作用會(huì)導(dǎo)致茶葉理化成分發(fā)生較大變化。隨著酸茶發(fā)酵過程的進(jìn)行，水溶性總糖的含量呈現(xiàn)先顯著降低后顯著上升的趨勢，發(fā)酵末期含量達(dá)到2.97%[12]。

酸茶中氨基酸成分的含量見表2。

表2 酸茶中氨基酸成分的含量/%

氨基酸是茶葉中重要的品質(zhì)成分，是構(gòu)成茶湯鮮爽味的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。由表2 可知，酸茶樣品中的氨基酸總量為1.344%，其組分上以茶氨酸（1.022%）和谷氨酸（0.097%） 為主。有研究表明，酸茶發(fā)酵過程中游離氨基酸的含量顯著升高[12]。

酸茶有機(jī)酸和維生素等成分含量見表3。

表3 酸茶有機(jī)酸和維生素等成分含量/%

由表3 可知，德昂族酸茶中乳酸和酚酸的含量較高，分別為0.85%和0.41%；維生素成分中以維B6和維B2的含量較高，分別為0.065 0%和0.011 2%。

以往有研究表明，不同級(jí)別德昂族酸茶中理化成分差異明顯[13]。有研究表明，酸茶發(fā)酵屬于厭氧發(fā)酵；由于微生物和茶葉水分的濕熱協(xié)同作用，發(fā)生了茶多酚的氧化、縮合，蛋白質(zhì)和氨基酸的分解、降解，碳水化合物的轉(zhuǎn)化積累，以及各產(chǎn)物之間的聚合、縮合等一系列反應(yīng)，使其茶湯酸澀，具有“酸”而略帶清涼的香氣特征。鑒于德昂族酸茶中化學(xué)成分的含量水平及其微生物發(fā)酵過程中的變化規(guī)律情況尚未系統(tǒng)揭示，未來仍需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行系統(tǒng)分析。

2.2 德昂族酸茶中的非揮發(fā)性成分分析

采用基于UPLC-MS/MS 的代謝組學(xué)方法，從德昂族酸茶樣品中共檢測到1 130 個(gè)代謝物。

酸茶中代謝物數(shù)量統(tǒng)計(jì)見表4。

表4 酸茶中代謝物數(shù)量統(tǒng)計(jì)

由表4 可知，包括252 種黃酮類物質(zhì)、203 種酚酸類、158 種脂質(zhì)、106 種其他類物質(zhì)、94 種氨基酸及其衍生物、94 種有機(jī)酸、71 種核苷酸及其衍生物、70 種生物堿、33 種木脂素和香豆素類、26 種鞣質(zhì)、24 種萜類及8 種醌類。黃酮類、酚酸類、脂質(zhì)以及氨基酸及其衍生物的代謝物數(shù)量和相對(duì)含量較高，相對(duì)含量分別占代謝物總量的14.39%，15.70%，25.50%，14.02%。

黃酮類化合物在茶葉中多以黃酮醇及其糖苷類的形式存在，是茶葉中重要的品質(zhì)化學(xué)成分，也是重要的生物活性成分[14]。酚酸類成分也被證實(shí)具有抗氧化、抗誘變、抗癌、抗皺等多種功效，在治療糖尿病、傷口愈合中發(fā)揮重要作用[15]。該研究發(fā)現(xiàn)，酸茶中存在高含量的黃酮類和酚酸類物質(zhì)，可能是其保健功效的重要化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)之一。酸茶樣品中檢測到的脂質(zhì)成分以α -亞麻酸、γ -亞麻酸、11 -十八碳烯酸為主，都屬于不飽和脂肪酸。研究表明，α-亞麻酸具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂、保護(hù)心血管等功能[16]。 此外，檢測到的代謝物中相對(duì)含量較高的還有6 -甲基巰嘌呤、3 -甲基黃嘌呤等成分。

2.3 德昂族酸茶揮發(fā)性成分分析

采用SBSE-GC-MS 方法，從德昂族酸茶樣品中共鑒定出119 種揮發(fā)性成分。

酸茶中的揮發(fā)性成分見表5。

表5 酸茶中的揮發(fā)性成分

揮發(fā)性成分中，相對(duì)含量較高的化合物有植醇、對(duì)乙烯基苯酚、反式芳樟醇氧化物、棕櫚酸異丙酯、反式- β -紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、水楊酸甲酯、芳樟醇、香葉醇，等等，這些成分構(gòu)成了德昂族酸茶揮發(fā)性成分的主體。

根據(jù)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)上述119 種揮發(fā)

性成分進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)酸茶樣品的香氣成分中，有醛類物質(zhì)9 種（總計(jì)1.76%）、醇類物質(zhì)17 種（總計(jì)28.59%）、酯類物質(zhì)17 種（總計(jì)21.31%）、酚類物質(zhì)6 種（總計(jì)16.73%）、雜環(huán)類物質(zhì)10 種（總計(jì)11.69%）、內(nèi)酯類物質(zhì)5 種（總計(jì)7.40%）、酮類物質(zhì)16 種（總計(jì)6.65%）、碳?xì)浠衔?9 種（總計(jì)4.68%）、酸類物質(zhì)7 種（總計(jì)1.36%）、醚類物質(zhì)3 種（總計(jì)0.46%）。可見，德昂族酸茶揮發(fā)性成分中含有豐富的醇類物質(zhì)、酯類物質(zhì)和酚類物質(zhì)等。酸茶中的關(guān)鍵致香成分后續(xù)尚需要通過GC-O 嗅聞試驗(yàn)和OAV 計(jì)算等進(jìn)行分析。

德昂族酸茶中檢測出的一些化合物，如4,6 -二（1,1 -二甲基乙基） - 2 -甲基苯酚和1,7,7 -三甲基雙環(huán)[2.2.1]庚- 2 -烯等，可能是酸茶中能區(qū)別于綠茶、紅茶等其他茶類的特殊物質(zhì)[17]。后發(fā)酵中生成的甲氧基苯類化合物是發(fā)酵茶中重要的“陳香”成分，酸茶也存在多種甲氧基苯類化合物，如1,2,3 -三甲氧基苯和4 -乙基- 1,2 -二甲氧基苯等，可能對(duì)其香氣品質(zhì)有重要影響。

3 結(jié)論

研究初步查明了德昂族酸茶的水浸出物、茶多酚、兒茶素、游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖等主要成分的含量水平，并從德昂族酸茶中初步鑒定出了119 種揮發(fā)性成分和1 130 種非揮發(fā)性物質(zhì)。研究結(jié)果表明，德昂族酸茶的內(nèi)含物質(zhì)豐富，展現(xiàn)出重要的開發(fā)價(jià)值。后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)德昂族酸茶風(fēng)味品質(zhì)、化學(xué)成分和保健功效的評(píng)價(jià)工作，以期為德昂族酸茶的加工工藝的提升及新產(chǎn)品開發(fā)利用等提供依據(jù)。