張靜嫻 應(yīng)映芬 趙軍招

患者 女，33 歲，BMI 20.57 kg/m2。因“婚后未避孕未孕8+年”于2017 年5 月10 日至溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院就診。患者平素月經(jīng)周期規(guī)律（周期25～30 d，經(jīng)期7 d），量中，偶有痛經(jīng)?；颊咴?015 年在國外因雙側(cè)輸卵管阻塞行輔助生殖助孕共3 周期，第1周期獲卵8 枚，成胚3 個(gè)，移植1 次，未孕。第2 周期獲卵2 枚，無胚胎形成。第3 周期獲卵8 枚，成胚2 個(gè)，移植1 次，未孕?；颊?016 年外院輸卵管造影示左側(cè)輸卵管阻塞，右側(cè)輸卵管通暢。男方2017 年4 月精液常規(guī)檢查基本正常，精子形態(tài)學(xué)檢查提示重度畸形精子癥，精子DNA 碎片率（sperm DNA fragmentation index，DFI）為19.3%。雙方染色體核型無殊。2017 年4 月本院基礎(chǔ)內(nèi)分泌檢查示：促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）7.25 IU/L，卵泡刺激素（follicle-stim‐ulating hormone，F(xiàn)SH）7.90 IU/L，泌乳素11.27 ng/ml，孕酮0.75 ng/ml，雌二醇45.93 pg/ml，睪酮0.51 ng/ml。

患者于2017 年5 月開始第1 周期，考慮其不孕主要原因?yàn)檩斅压苄?，但患者有痛?jīng)，不能排除子宮內(nèi)膜異位癥引起不孕可能，本中心決定使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（gonadotropin-releas‐ing hormone agonist，GnRH-a）全量降調(diào)節(jié)方案（GnRH-a 長方案）促排，獲卵10 枚，行體外受精（in vitro fertilization，IVF）后受精2 枚，培育第3 天（D3）胚胎2 個(gè)，均于當(dāng)月移植，未妊娠。第2 周期中，為改善患者卵母細(xì)胞的成熟情況，本中心改用高孕激素狀態(tài)促排卵（progestinprimed ovarian stimulation，PPOS）方案促排，獲卵7 枚，IVF 后受精4 枚，培養(yǎng)D3 胚胎4 個(gè)，冷凍2 個(gè)第4 天（D4）、2 個(gè)第6 天（D6）胚胎，當(dāng)月未移植。第3 周期，患者移植D6 凍融胚胎2 個(gè)，未妊娠。第4 周期中患者于移植前行宮腔鏡下子宮內(nèi)膜息肉摘除術(shù)，并且在激素替代治療（hor‐mone replace therapy，HRT）以前使用GnRH-a 預(yù)處理，即于月經(jīng)期第3 天注射3.75 mg 醋酸曲普瑞林，28 d 后啟動(dòng)內(nèi)膜準(zhǔn)備，后移植D4 冷凍胚胎2 個(gè)，未妊娠。第5 周期，患者使用PPOS 方案促排，獲卵4 枚，行IVF 后受精2 枚，培育D3 胚胎2 個(gè)，冷凍D4 胚胎2 個(gè)，當(dāng)月未移植。第6 周期，患者移植D4 冷凍胚胎2 個(gè)，未妊娠，截止目前，加上先前國外的移植經(jīng)歷，患者共移植6 次，累計(jì)移植胚胎數(shù)12個(gè)，均失敗，補(bǔ)充診斷“反復(fù)種植失?。╮ecurrent implantation failure，RIF）”。結(jié)合第5 周期的卵母細(xì)胞及胚胎情況，發(fā)現(xiàn)PPOS 促排雖可改善該患者的卵母細(xì)胞發(fā)育情況，但對患者的胚胎發(fā)育及移植結(jié)局并無明顯增益。第7 周期患者再次采用GnRH-a 長方案促排，并采用卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受精，獲卵10枚，受精3枚，培養(yǎng)D3 胚胎3 個(gè)，至第5 天（D5）均無囊胚形成，當(dāng)月無胚胎未移植?；颊哂?019 年6 月開始第8 周期，使用GnRH-a長方案促排，獲卵12 枚，行卵母細(xì)胞輔助激活（artificial oocyte activation，AOA）后正常受精9 枚，培養(yǎng)形成D3 胚胎9 個(gè)，其中4 個(gè)D3 胚胎為一級(jí)優(yōu)胚（8A、8A、8B、8B），繼續(xù)培養(yǎng)后，獲得D5 優(yōu)質(zhì)囊胚1 枚，考慮患者既往胚胎發(fā)育較慢，決定繼續(xù)培育至第7 天（D7），冷凍囊胚2 個(gè)，當(dāng)月移植D5 胚胎1 個(gè)后生化妊娠?；颊哂?019 年9 月開始第9 周期，再次行宮腔鏡下子宮內(nèi)膜息肉摘除術(shù)，移植D7 冷凍胚胎2 個(gè)，后臨床妊娠，于2020 年5 月（孕周39+4）剖宮產(chǎn)一子。周期總結(jié)：患者于本院共進(jìn)行5 次控制性卵巢刺激、2 次新鮮胚胎移植及4 次凍融胚胎移植?；颊咔? 次控制性卵巢刺激后行IVF/ICSI受精，移植后均未妊娠，于第5 次控制性卵巢刺激后行AOA，當(dāng)月移植后生化妊娠，下一周期行凍融胚胎移植后獲得活產(chǎn)結(jié)局。

討論 當(dāng)前國內(nèi)外對RIF 的定義未明確，現(xiàn)被廣泛接受的3 個(gè)定義如下：（1）移植3 次及以上或移植高評(píng)分卵裂期胚胎數(shù)4～6 個(gè)或高評(píng)分囊胚數(shù)3 個(gè)及以上均失??；（2）3 次及以上高質(zhì)量胚胎移植失敗或移植胚胎數(shù)超過10 個(gè)均失??；（3）2 次及以上IVF/ICSI/凍融胚胎移植失?。ㄒ浦哺哔|(zhì)量卵裂期胚胎超過4 枚或高質(zhì)量囊胚超過2 枚）[1-3]。無論哪種定義，該患者均符合。RIF 的病因主要包括：（1）胚胎因素：如精子質(zhì)量、卵子質(zhì)量等；（2）子宮因素：如子宮畸形，黏膜下及肌壁間子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜息肉等影響子宮內(nèi)膜容受性的因素；（3）輸卵管積水等[4]?；颊咄ㄟ^陰道超聲、宮腔鏡等方式排除了子宮因素和輸卵管積水，結(jié)合冷凍移植周期中使用GnRH-a 降調(diào)節(jié)預(yù)處理改善子宮內(nèi)膜容受性及盆腔環(huán)境后，妊娠結(jié)局依然沒有改變，考慮其RIF 的病因以胚胎因素為主。男方雖為重度畸形精子癥，DFI 為19.3%，鑒于患者多次取卵后的成熟卵母細(xì)胞個(gè)數(shù)少，ICSI 后受精及胚胎發(fā)育情況未改善，考慮可能存在卵母細(xì)胞激活不足，因此決定以AOA 方式激活卵母細(xì)胞。

卵母細(xì)胞活化是細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+濃度升高的過程。近年來，有大量研究表明卵母細(xì)胞激活涉及兩步機(jī)制：Ca2+震蕩功能啟動(dòng)和維持細(xì)胞活化。精子將磷脂酶Cζ 引入卵母細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)透明帶反應(yīng)來阻止多精子受精。數(shù)分鐘內(nèi)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放入胞內(nèi)，后Ca2+震蕩持續(xù)存在于整個(gè)受精過程中，其幅度及頻率隨著受精過程的發(fā)展而不斷降低，至原核形成時(shí)終止[5-6]。目前，AOA 較多應(yīng)用在男性因素引起的ICSI 受精失敗患者，如圓頭精子癥。但有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，錯(cuò)誤的Ca2+模式可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育潛能受損，故AOA 可能也適用于一些胚胎發(fā)育停滯、反復(fù)胚胎質(zhì)量差甚至是RIF 的不孕患者[7]。該患者既往多次COS 后雖能獲得可用胚胎，但胚胎數(shù)量少、評(píng)分差，移植后均未妊娠，提示胚胎質(zhì)量不佳，因此本中心決定行AOA 以期提升胚胎質(zhì)量，改善移植結(jié)局。

AOA 技術(shù)包括機(jī)械激活、電激活、化學(xué)激活三大類[8]。本中心選擇Ca2+霉素——一種Ca2+通道激活體，進(jìn)行化學(xué)激活，其基本原理即通過提高卵母細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，模擬受精時(shí)卵母細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+的變化，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞激活。該患者行AOA 后，受精率明顯升高、D3 胚胎分級(jí)優(yōu)化，當(dāng)月移植后獲得生化妊娠，下一周期行凍融胚胎移植后獲得活產(chǎn)，與既往多次移植后未妊娠的結(jié)局對比，提示AOA 明顯改善了胚胎質(zhì)量，最終獲得滿意的臨床結(jié)局。

然而，利用Ca2+載體激活卵母細(xì)胞只會(huì)造成單次Ca2+大量增加，而生理的受精過程中會(huì)出現(xiàn)多次Ca2+振蕩[9]，因此AOA 相關(guān)的安全性及倫理問題仍在討論中。已有研究提示AOA 用于人類生殖技術(shù)的可行性。Miller 等[10]的一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究顯示在分別使用ICSI 和IC‐SI-Ca2+技術(shù)后，單胎和雙胎妊娠中的出生缺陷率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外，單胎或雙胎妊娠的出生體重、分娩時(shí)孕周、胎兒性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在最后一周期中，患者移植了2 個(gè)D7 冷凍胚胎后妊娠。針對D7 囊胚的移植，現(xiàn)存許多爭議。過去認(rèn)為，移植D7囊胚的臨床結(jié)局不佳，因此第6 天未發(fā)育為囊胚的胚胎通常被丟棄。Su 等[11]發(fā)現(xiàn)，63.3%的D7 囊胚為非整倍體或染色體部分缺失，但整倍體的D7 囊胚移植后依然可以獲得活產(chǎn)。多項(xiàng)研究均提示，與D5、D6 囊胚相比，移植D7 囊胚的圍生期指標(biāo)、新生兒的出生情況及孕婦并發(fā)癥的發(fā)生情況并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說明盡管D7 囊胚發(fā)育延遲，它依然可以擁有與D5、D6 囊胚類似的發(fā)育潛能，最終發(fā)育為正常新生兒[12-15]。

至于是否要將胚胎培育時(shí)間延長至7 d，目前有多種聲音：對于胚胎在D6顯示不清楚或早期囊胚發(fā)育的患者，可以將培育時(shí)間延長至D7，防止在D6 具有不典型或邊緣形態(tài)的可存活囊胚被過早丟棄[15]；對于未行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測的延遲發(fā)育的囊胚可適當(dāng)延遲培養(yǎng)時(shí)間，因?yàn)镈7 的囊胚發(fā)生非整倍體的可能性更高，使得胚胎發(fā)育時(shí)間延長[16]。本例患者既往周期中鮮有D5、D6 囊胚，并且囊胚評(píng)分不高，結(jié)合其多次移植失敗的經(jīng)歷，考慮存在胚胎發(fā)育延遲，本中心將胚胎培養(yǎng)延遲至D7，最終獲得活產(chǎn)的良好妊娠結(jié)局。因此在臨床上對于無D5、D6 囊胚的患者，可以個(gè)體化考慮將培養(yǎng)周期延遲至D7，以增加獲得可用胚胎的數(shù)量。

本例患者最終足月妊娠，剖宮產(chǎn)一子，出生體重2 350 g，為低體重出生兒。該新生兒的低出生體重是否與AOA 技術(shù)的實(shí)施或D7 囊胚移植有關(guān)，尚不能做出定論，本中心將繼續(xù)跟蹤該新生兒出生后的生長發(fā)育情況。有研究表明，實(shí)施AOA 后出生的3～10 歲兒童智力評(píng)估及運(yùn)動(dòng)能力評(píng)估結(jié)果平均值均在預(yù)期值內(nèi)[17]，初步證明AOA 的安全性。

綜上所述，本文報(bào)道了1 例通過AOA 后移植D7 囊胚后成功妊娠并抱嬰回家的RIF 患者，希望為RIF 患者的治療提供一些新的思路和啟發(fā)，但AOA 作為一項(xiàng)安全性尚未完全認(rèn)證的新技術(shù)，在實(shí)施前仍需謹(jǐn)慎把握其適應(yīng)證，做到因人制宜。