畢繼安 王芳 張國芳 朱宏芬 沈嵐 鄭紅英 嚴成其

摘要 以藥用野生稻為試驗材料，分別選用傳統(tǒng)的CTAB提取法、CTAB改良方法、堿裂解法、磁珠法、吸附柱法、尿素提取法及酶消化法7種方法提取水稻葉片組織DNA，7種方法分別標記為A～G。通過比較這些方法提取出DNA的濃度和純度，分析這些方法的優(yōu)劣勢。7種方法均能獲得較好的基因組，按獲得DNA濃度表現(xiàn)為A＞B＞F＞C＞G＞E＞D，純度表現(xiàn)為D＞E＞C＞G＞B＞F＞A。綜合考量DNA的純度、濃度、提取時間、成本、安全無毒等方面因素，若對基因組的質(zhì)量要求不高，只是做簡單的檢測且考慮成本問題，可以選擇CTAB提取法、CTAB改良方法和尿素提取法；若需要高純度基因組，可以選擇磁珠法、吸附柱法、堿裂解法；若考慮安全無毒、快速提取及成本可控，可以選擇磁珠法、吸附柱法；若樣品稀有，可以選用CTAB提取法和CTAB改良法。

關鍵詞 藥用野生稻；葉片；基因組；提取方法；有利基因

中圖分類號 S511? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）14-0086-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.14.021

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

作者簡介 畢繼安（1987—），男，山東青島人，博士，從事抗病育種研究。

*通信作者，研究員，博士，從事抗病育種研究。

藥用野生稻多生長于海拔600～1 100 m丘陵山坡中下部的沖積地和溝邊，為喜暖、喜雨、喜潮濕的短日照植物，適宜在陰蔽、腐殖質(zhì)豐富、pH為6左右的肥沃砂壤土上生長。藥用野生稻在稻屬22個種中長勢最強，是普通栽培稻的20倍以上，在進化過程中，藥用野生稻形成了豐富的遺傳多樣性，藥用野生稻因長期處于野生環(huán)境，經(jīng)受各種自然災害和地理生態(tài)因素的考驗，形成了較強的抗性和耐受不良環(huán)境因素等方面的優(yōu)異性狀，是天然的基因庫。藥用野生稻農(nóng)藝性狀具有大穗、寬葉片、粗莖稈等性狀，為遺傳改良提供了良好的資源條件。因此，深入挖掘藥用野生稻的優(yōu)良基因?qū)τ谛路N質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。①大量的抗病基因。有研究人員通過對抗病基因的克隆以及高抗條紋葉枯病水稻材料的獲得，使藥用野生稻資源得到了充分利用，更進一步推動了藥用野生稻抗病基因的開發(fā)與研究［ 1］。水稻白葉枯病是水稻生長發(fā)育過程中常見的病害，而藥用野生稻具有大量的優(yōu)異抗性基因，因此從藥用野生稻中挖掘抗白葉枯病基因并加以利用，得到了廣大科研工作者的高度重視。研究發(fā)現(xiàn)，云南藥用野生稻多個居群類型對4種主要病害存在一定抗性［ 2-3］，云南藥用野生稻種質(zhì)資源對當?shù)匾欢〞r期流行的白葉枯病小種及國內(nèi)外部分強致病菌整體抗性較好［ 4］，這些研究為藥用野生稻的有效抗病基因挖掘奠定了基礎。②創(chuàng)制新種質(zhì)資源。研究發(fā)現(xiàn)，利用構建藥用野生稻TAC文庫篩選有利基因并通過克隆、遺傳轉(zhuǎn)化方法及結合育種技術，有望實現(xiàn)藥用野生稻在新種質(zhì)資源上的創(chuàng)制［ 5-7］。同時，栽培稻與藥用野生稻種間雜種體內(nèi)異源基因組重組引起的DNA甲基化變異規(guī)律為不對稱體細胞雜交的基因融合奠定了基礎［ 8］，有研究發(fā)現(xiàn)，將藥用野生稻總DNA通過穗莖注射法導入恢復系R225可以創(chuàng)制耐陰、耐光氧化的水稻新種質(zhì)［ 9］。③優(yōu)異內(nèi)源基因的挖掘。有研究表明，云南藥用野生稻凈光合速率較高，其在羧化效率和光飽和點上所表現(xiàn)出的高光效潛能為探索機體高光效基因提供了理論依據(jù)［ 10-11］。藥用野生稻中淀粉合成酶基因在同屬內(nèi)的自然進化規(guī)律的探索，也為水稻的遺傳育種和品質(zhì)改良提供科學依據(jù)［ 12-13］。④抗逆途徑基因挖掘。有研究人員通過基于藥用野生稻干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析探索ADF基因?qū)λ幱靡吧痉巧锩{迫的影響［ 14］，同時還有研究表明，藥用野生稻中LEA蛋白在植物抗逆反應起著重要的作用，這為水稻遺傳改良提供重要的理論依據(jù)［ 11，15］。上述研究說明藥用野生稻中藥用野生稻中存在大量、有利、可挖掘的基因，是種質(zhì)創(chuàng)新的有利基因庫，而組織樣品的提取方法還不夠完善與全面，這將會導致存在部分有利基因片段獲取不夠完整，因此選擇一種合適的方法提取藥用野生稻基因組DNA對于有利基因的深入挖掘至關重要。藥用野生稻因其生理結構特征比栽培稻較為復雜，其基因組提取相對困難，提取質(zhì)量相對偏低，因此對藥用野生稻DNA提取方法進行探索，優(yōu)化提取步驟，為獲得更加合適、更加完整的基因組結構提供理論依據(jù)。筆者以藥用野生稻為素材，綜合采用7種方法來提取植物的基因組，比較各種方法所提取的基因組含量與純度，旨在為后序深入挖掘藥用野生稻的有利基因提供技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藥用野生稻為該試驗培育，準備藥用野生稻相同葉位的7組樣品，每組樣品準確稱取0.6 g，然后三等分。

主要試劑：聚乙烯吡咯烷酮（生工生物工程（上海）股份有限公司，中國），β-巰基乙醇（索萊寶生物科技有限公司，中國），Protein K（索萊寶生物科技有限公司，中國），磁珠（美國Promega公司，US），DNA提取試劑盒（QIAGEN，Germany），R-淀粉酶（美國Sigma公司，US）。主要儀器：組織研磨儀（Tissuelyser-96，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司），離心機（5424R，德國艾本德股份公司），恒溫水浴鍋（DK-8D，上海一恒科學儀器有限公司），超微量紫外分光光度計（NanoDrop One C，US）。

1.2 試驗方法

1.2.1 基于CTAB的經(jīng)典DNA提取方法。

①取0.2 g水稻葉片組織于液氮中研磨成細粉狀，并將粉末快速轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中。

②加入500 μL提取緩沖液［2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），50 mmol/L EDTA （pH 8.0），1.4 mol/L NaCl，0.2% β-巰基乙醇］，顛倒混合均勻離心管，將混合物置于65 ℃水浴中孵育30 min，每隔10 min顛倒混勻一次。

③將離心管置于離心機中，12 000 r/min 離心15 min。轉(zhuǎn)移離心管中上層液體到新的 1.5 mL 離心管中。

④加入200 μL苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）到離心管中并顛倒混合均勻，于室溫靜置5 min，將離心管置于離心機中，12 000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移離心管中上層液于新的 1.5 mL 離心管中。

⑤加入200 μL 氯仿∶異戊醇（24∶1）溶液輕輕顛倒混勻，于室溫靜置5 min后，將其置于離心機中，12 000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移離心管的上層液體到新的 1.5 mL 離心管中。⑥加入2倍體積的冷乙醇（預先于-20 ℃保存），輕混勻，并轉(zhuǎn)移到-20 ℃冰箱中靜置30 min。

⑦將離心管置于離心機中，14 000 r/min 離心2 min，棄上清。

⑧加入洗滌緩沖液（70% 乙醇，10 mmol/L醋酸銨），重懸沉淀，12 000 r/min 離心1 min，棄上清。重復該操作步驟一次。

⑨將沉淀置于空氣中干燥并用100 μL 超純水將其溶解，并將其置于37 ℃水浴鍋中孵育30 min。最后將其置于-20 ℃冰箱中備用或用于后續(xù)試驗［ 16-17］。

1.2.2 基于CTAB提取DNA方法的改良。

①取0.2 g水稻葉片和0.1 g聚乙烯吡咯烷酮于液氮中研磨成粉末。

②將粉末轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中。隨后將1 mL預冷提取緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L EDTA、500 mmol/L NaCl和2% β-巰基乙醇，最終調(diào)節(jié)pH至8.0）加入離心管中，渦旋振蕩混合物，并在室溫下靜置10 min。然后將離心管于4 ℃ 12 000 r/min下離心10 min，棄上清。

③將沉淀懸浮于1 mL預熱的提取緩沖液中（3% CTAB、1.4 mmol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L EDTA和2% β-ME，pH為80），與此同時加入20 μL Protein K 并將混合物于65 ℃水浴下孵育至少1 h，同時每隔20 min顛倒混勻一次，然后將混合物于4 ℃ 12 000 r/min下離心10 min。

④將上清液轉(zhuǎn)移到新的 2 mL 離心管中，然后向離心管中加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）。顛倒混勻后置于室溫下靜置10 min，然后于4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min。

⑤將水相轉(zhuǎn)移到新的2 mL離心管中。加入大約1/10體積的 2.5 mol/L KAC溶液（pH 5.2）。

⑥將上層水相轉(zhuǎn)移到另一個新的2 mL 管中，加入1/3體積的冰異丙醇溶液。將離心管靜置于-20 ℃冰箱中30 min，隨后在 4 ℃12 000 r/min下離心10 min。

⑦棄上清，用多糖、多酚洗滌緩沖液（含50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、350 mmol/L 山梨糖醇，pH 8.0）洗滌1次。

⑧棄掉上清液，將含有DNA的白色沉淀用70%乙醇洗滌2次，自然環(huán)境干燥。

⑨將最終的DNA沉淀用100 μL 超純水溶解［ 18-19］。

1.2.3 堿裂解法。

①取0.2 g水稻葉片組織于液氮中研磨成細粉狀，接著將其轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中。

②在離心管中加入100 μL堿性裂解試劑［25 mmol/L NaOH 和 0.2 mmol/L EDTA（PH 8.0）］，隨后添加100 μL 緩沖試劑［40 mmol/L Tris-HCl（pH 5）］并混勻，靜置2 min。

③將離心管置于離心機中12 000 r/min 離心5 min，取上清液。

④上清液中加入20 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL）及5 μL RNase（10 mg/mL）后于37 ℃水浴鍋中孵育30 min，再將其置于65 ℃水浴鍋孵育10 min。

⑤加入200 μL 氯仿∶異戊醇（24∶1）溶液并輕輕顛倒混勻，靜置5 min后，將其置于離心機中，12 000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移離心管中的上層液體到新的 1.5 mL 離心管中。

⑥加入2倍體積的冷乙醇（預先于-20 ℃保存），輕混勻，并于-20 ℃冰箱中靜置30 min。

⑦將離心管置于離心機中，14 000 r/min 離心2 min，棄上清。

⑧加入70%乙醇溶液重懸沉淀，12 000 r/min 離心1 min，棄上清；重復該操作步驟 1次。

⑨室溫條件下晾干沉淀，加入100 μL超純水充分溶解，保存于-20 ℃冰箱中待用［ 20］。

1.2.4 磁珠法。

①取0.2 g水稻葉片組織于液氮中研磨成粉末，并將粉末轉(zhuǎn)移到2 mL 離心管中，并加入1 mL裂解緩沖液（2% CTAB、2.5 mmol/L NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA），顛倒混勻。

②將上述混合物通過0.22 μm 過濾器，轉(zhuǎn)移到新2 mL離心管中，在濾液中加入800 μL異丙醇和50 μL蛋白酶K，充分混勻。

③在濾液中加入20 μL 磁珠原液并渦旋3～4 min，靜置1 min。

④將混合物置于磁力架沉淀磁珠，棄去上清中不含磁珠的液體。

⑤磁珠用 1 mL CW1 緩沖液（含7 mol/L鹽酸胍的50%異丙醇溶液）進行清洗。

⑥磁珠再用 1 mL CW2 緩沖液（75%乙醇）洗滌2次。隨后室溫放置 5 min以蒸發(fā)殘留的乙醇。

⑦將30 μL洗脫緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，預熱至55 ℃）加入磁珠中，隨后在55 ℃水浴鍋中孵育5 min，孵育期間每隔1 min渦旋20 s。

⑧將混合物置于磁力架上，吸取上清液備用［ 21-23］。

1.2.5 吸附柱法。

①取0.2 g水稻葉片組織置于研缽中，同時加入液氮充分研磨。

②加入440 μL緩沖液AP1，顛倒混勻材料，再加4 μL RNase后，劇烈渦旋混勻。

③將上述混合物在65 ℃下溫浴15 min，每隔5 min輕輕顛倒試管2～3次。

④加入130 μL緩沖液AP2后，輕柔顛倒混勻，并將其置于冰上靜置5 min。

⑤將離心管置于離心機中，14 000 r/min離心5 min，緩慢吸取上層液體（500 μL）置于Mini Spin Colum（柱）中，14 000 r/min離心1 min。

⑥將上一步中的濾液（450 μL）緩慢轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，并在溶液中緩慢加入1.5倍體積（675 μL）的緩沖液AP3。

⑦將上一步中混合液（包括形成的沉淀）轉(zhuǎn)移至Mini Spin Colum（柱）中，14 000 r/min離心1 min，丟棄廢液。

⑧在Mini Spin Colum（柱）中加入500 μL緩沖液AW，放置3～5 min，12 000 r/min離心1 min，棄掉廢液。重復洗滌1次。

⑨在Mini Spin Colum（柱）中加入500 μL無水乙醇，放置3～5 min，12 000 r/min離心3 min，丟棄廢液和收集管。

⑩在Mini Spin Colum（柱）下置1.5 mL離心管，吸取100 μL超純水加到Dneasy膜上。65 ℃水浴鍋中靜置5 min，14 000 r/min離心1 min得到DNA。

1.2.6 尿素提取法。

①利用液氮將0.2 g 水稻葉片組織研磨成粉末，并轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中。

②在離心管中加入600 μL 尿素提取液（42 g尿素、7 mL 5 mol/L NaCl、5 mL 1 mol/L Tris-HCl pH 8.0、4 mL 0.5 mol/L EDTA pH 8.0和 5 mL 20% Na-N-月桂酰肌氨酸，加入無菌蒸餾水調(diào)整最終體積至 100 mL，溫度不高于70 ℃）渦旋混勻，于室溫下靜置1 h。

③將離心管置于離心機中，以12 000 r/min 離心5 min。

④取上清，加入等體積的苯酚∶氯仿（1∶1）溶液，渦旋混勻離心管。

⑤將離心管置于預冷的4 ℃離心機中，12 000 r/min 離心5 min。

⑥取上清液，加入等體積的異丙醇溶液，顛倒混勻，于4 ℃環(huán)境靜置1 h。

⑦將離心管置于預冷的4 ℃的離心機中，12 000 r/min 離心5 min。

⑧棄上清，真空干燥沉淀2 min。

⑨用100 μL TE緩沖液（1 mL 1.0 mol/L Tris-HCl和 0.2 mL 0.5 mol/L EDTA，調(diào)節(jié)pH到8.0，并用無菌水定容至100 mL）溶解沉淀，待用［ 24-25］。

1.2.7 酶消化法。

①取0.2 g水稻組織葉片在液氮中充分研磨后加入300 μL緩沖液［含0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）和 0.1 mol/L NaCl］，并渦旋振蕩混勻。

②在上述溶液中加入10 μL R-淀粉酶（Sigma，US），顛倒混勻，于80 ℃恒溫金屬浴中孵育1 h。

③加入33 μL 2% SDS、20 μL Protein K和1 μL RNase A，并將其置于55 ℃恒溫金屬浴中孵育1 h。

④加入300 μL苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）溶液，劇烈渦旋振蕩2 min。

⑤將上述溶液于15 000 r/min 離心1 min，轉(zhuǎn)移上清溶液至2.0 mL 離心管中，隨后加入2倍體積預冷乙醇并置于冰上靜置15 min。

⑥將離心管置于預冷的離心機中，4 ℃ 15 000 r/min離心15 min，棄上清。

⑦離心管中加入500 μL 預冷的70%乙醇，洗滌沉淀，4 ℃，15 000 r/min離心1 min。重復1遍。

⑧棄上清，室溫下風干沉淀，加入100 μL 超純水溶解沉淀，待用［ 26-28］。

2 結果與分析

2.1 水稻基因組濃度

采用7種方法得到水稻葉片的基因組后，利用超微量紫外分光光度計測量其濃度，具體數(shù)值見表1，不同提取方法得到的DNA濃度存在差異，濃度由高到低依次為A＞B＞F＞C＞G＞E＞D，通過CTAB法獲得的基因組DNA可能存在與植物組織中少量的糖類及淀粉或其他物質(zhì)結合，因此在測量過程中存在一定偏差，導致濃度偏高；而通過磁珠法提取的基因組，因其是在外磁場的作用下納米磁性微球與核酸結合，磁場大小及磁性微球的特性決定其結合能力，因此濃度偏低一些。

2.2 水稻基因組純度

核酸純度一般用A260/A230和A260/A280來表示。其中，260 nm是核酸最高吸收峰的吸收波長，230 nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，280 nm是蛋白最高吸收峰的吸收波長。高純度的DNA其A260/A280比值大于1.8，如果比值小于1.8，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要對樣品進行純化；同時DNA純度的另一個指標為A260/A230，如果A260/A230的比值大于1.8，說明純度較高，如果小于1.8，表示樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑污染，需要對樣品進行純化。根據(jù)測定結果來看，這些方法提取的DNA純度均較高，純度表現(xiàn)為D＞E＞C＞G＞B＞F＞A（表1）。從純度數(shù)據(jù)來看，利用磁珠法提取的基因組純度最高。

3 討論

對以上7種方法提取的基因組DNA濃度及純度進行測定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)典CTAB提取方法提取的濃度及純度較高，適合一般性試驗需要，但在試驗過程中會用到含有氯仿的有毒試劑，且耗時較長，這需要試驗人員規(guī)范操作；基于CTAB的改良方法，提取過程中會使用蛋白酶K，這樣會有效酶解與核酸結合的組蛋白，使 DNA游離在溶液中，且EDTA等螯合劑均不能使之失活，這樣提取出的DNA純度會更高一些；利用堿裂解法提取的葉片組織效果和CTAB相差不大，在裂解植物組織方面效果較好，尤其是在提取纖維素較多的根部、莖部優(yōu)勢較為明顯；磁珠法提取基因組DNA在前期裂解上使用的是CTAB試劑，但是在純化的過程中利用了磁珠的優(yōu)勢，使其能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結合，并利用二氧化硅包被的納米磁性微球的超順磁性，在Chaotropic鹽（鹽酸胍、異硫氰酸胍等）和外加磁場的作用下，能從樣本中分離出純度較高的基因組DNA，可用于后續(xù)分子雜交試驗，但是價格較昂貴。吸附柱法是在離心吸附柱內(nèi)使用一種硅基質(zhì)濾膜，這種濾膜在低pH、高濃度鹽存在的條件下，可以選擇性吸附DNA片段，而蛋白和其他雜質(zhì)不會被吸附。通過這種方法提取出的DNA濃度相對其他方法較低，有一定量的DNA損失，但是純度相對較高，減少了有毒試劑的使用，提取時間也相對較短；尿素提取法操作過程比較溫和，不需要劇烈的振蕩及高溫的處理，不易造成DNA變性降解；酶消化法提取的DNA可以輕松地去除植物組織中的淀粉和糖原，用這種方法提取的DNA能避免了基因組中淀粉及糖原的干擾，使DNA的純度會更高一些，利于基因組獲取更加全面與完整。因此，需要根據(jù)試驗材料、目的以及后續(xù)研究需要綜合評估選用適宜的提取純化方法，在得率與純度間取得平衡。該研究比較了7種不同DNA提取方法，為后續(xù)開展藥用野生稻基因組的分離及其功能研究奠定基礎。

4 結論

藥用野生稻作為我國的主要野生稻物種，因其體內(nèi)含有大量未知功能的有利基因，近些年得到了較為廣泛的研究。筆者比較了不同提取野生稻基因組DNA方法，綜合各方面因素考量，若只需簡單的檢測且考慮成本問題，可以選擇CTAB提取法、CTAB改良方法和尿素提取法，但在使用過程中會用到較毒的有機試劑，提取過程需小心謹慎；如需要高純度基因組可以選擇磁珠法、吸附柱法、堿裂解法；若考慮安全無毒、快速提取及成本可控可以選磁珠法、吸附柱法；若樣品稀有可以選用CTAB提取法和CTAB改良法。通過比較這些方法的優(yōu)劣勢，可以為滿足不同試驗需要選擇高效、簡便、安全無毒、低成本的最優(yōu)DNA提取方法提供了一定理論依據(jù)，同時也為指導水稻不同組織部位DNA的提取提供了參考價值，進一步為開發(fā)與優(yōu)化快速提取藥用野生稻基因組DNA提供理論指導。

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