張蕓，袁風(fēng)雷，袁若琳，李釗

華北醫(yī)療健康集團(tuán)峰峰總醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056000

脂多糖（LPS）是內(nèi)毒素的有效成分，是一種多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的復(fù)合物，能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞、組織的損傷，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要誘因。研究［1-2］顯示，LPS可觸發(fā)氣道炎癥，它通過降低肺泡毛細(xì)血管屏障功能，增加肺血管通透性以及促進(jìn)白細(xì)胞浸入肺泡間隙，從而引起肺損傷。LPS可誘導(dǎo)炎癥因子如白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8和腫瘤壞死因子（TNF）-α釋放到局部肺組織和血液循環(huán)中，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)，這也是引起呼吸功能下降的呼吸道疾病的主要誘因，急性肺損傷的大鼠模型、急性肺損傷的細(xì)胞模型均是由LPS誘導(dǎo)形成的［3-4］。有絲分裂原激活的轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1參與炎癥的發(fā)生過程，可調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用的各種基因的表達(dá)，若TGF-β1激活與Smad家族蛋白3（Smad3）結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α的表達(dá)升高［5-6］。依托咪酯是一種新型選擇性抗膽堿藥，是一種常用的麻醉藥物，可降低乙酰膽堿活性，從而發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用［7］。依托咪酯的抗炎活性已在藥理學(xué)研究中被證明。研究［8-9］發(fā)現(xiàn)，依托咪酯對潰瘍性結(jié)腸炎、肺炎均有明顯的抑制作用，可有效阻止?jié)冃越Y(jié)腸炎和肺炎的疾病進(jìn)展。然而，依托咪酯對呼吸道炎癥疾病的抗炎作用機(jī)制尚未得到充分研究。2022年12月—2023年1月，我們觀察了依托咪酯對LPS誘導(dǎo)人氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）炎性損傷的改善作用，并探討其機(jī)制，以期為呼吸系統(tǒng)炎癥疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人ASMCs購自武漢菲恩生物科技有限公司。依托咪酯（原料藥，純度99.86%）購自深圳市民康源生物科技有限公司；胎牛血清、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒、IL-2、IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒均購自廣州博輝生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、LPS、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）試劑盒、TRIzol試劑、PCR試劑盒、蛋白裂解液、ECL試劑均購自昆明亞靈生物科技有限公司；兔源TGF-β1、Smad3、GAPDH一抗、羊抗兔二抗均購自武漢菲越生物科技有限公司。MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱、CMax Plus型酶標(biāo)儀、iQue 3型流式細(xì)胞儀均購自常州祥泰生物技術(shù)有限公司；Esan-Gene 696型熒光定量PCR儀、OmegaLum G型凝膠成像系統(tǒng)均購自南京北魚生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞分組及LPS、依托咪酯給予 于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)環(huán)境在含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)ASMCs，每天更換培養(yǎng)液，在細(xì)胞覆蓋率達(dá)到90%左右時(shí)使用胰蛋白酶消化、傳代。選對數(shù)生長期的ASMCs接種于96孔板上（1×105個(gè)/孔），并分為對照組、LPS組［10］、依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組［11］。對照組常規(guī)培養(yǎng)ASMCs；LPS組在含ASMCs的培養(yǎng)基中加入500 ng/mL的LPS［10］；依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組在含ASMCs的培養(yǎng)基中加入500 ng/mL的LPS后，再分別加入5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的依托咪酯［11］。各組設(shè)8個(gè)平行樣，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3 各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α檢測 采用ELISA法。取各組細(xì)胞以3×104個(gè)/孔接種于24孔板上，棄培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液沖洗2次，按ELISA試劑盒說明書操作方法及步驟，檢測各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α。

1.4 各組細(xì)胞存活率、凋亡率測算

1.4.1 各組細(xì)胞存活率測算 采用MTT法。取各組細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板上，加入MTT溶液，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜，振蕩15 min，用酶標(biāo)儀檢測樣本490 nm處的吸光度值（OD490值），計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=各組OD490值/對照組OD490值×100%。

1.4.2 各組細(xì)胞凋亡率測算 采用流式細(xì)胞法。取各組細(xì)胞重懸為1×105個(gè)/mL，加入Annexin VFITC和PI各8 μL，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.5 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白檢測

1.5.1 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA檢測采用熒光定量PCR法。取各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑分離總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，以U6為內(nèi)參，熒光定量PCR法檢測各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA，引物由武漢瓊格生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列如下：TGF-β1正向引物為5'-ATCGCGCCATGTTAACAACT-3'，反向引物為5'-TGGAAAGTCGCCACCGCGTG-3'；Smad3正向引物為5'-GTCTACTGAAGAGTAGTTAAC-3'，反向引物為5'-AATCCACATTCCCATCCATTG-3'；U6正向引物為5'-GCTCGAGTCCTCACATGCTCG-3'，反向引物為5'-TGATAGTAATCAGTCACTAGT-3'。反應(yīng)條件及環(huán)境的配置參照PCR試劑盒說明書，以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達(dá)量。

1.5.2 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3蛋白檢測 采用蛋白印跡法。取各組細(xì)胞，蛋白裂解液裂解，BCA試劑盒定量總蛋白，電泳分離各組中等量的蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入稀釋好的兔源TGF-β1（1：600）、Smad3（1：700）、GAPDH（1：1000）一抗，4 ℃下孵育過夜，加入羊抗兔二抗（1：1400），室溫下孵育1 h，ECL試劑顯色，采用Image J軟件檢測蛋白灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量為目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比較 各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比較見表1。由表1可知，與對照組相比，LPS組、依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞中IL-2、IL-6、TNF-α水平均升高（P均＜0.05）；與LPS組相比，依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞中IL-2、IL-6、TNF-α水平均降低（P均＜0.05），且依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組低于依托咪酯低濃度組（P均＜0.05），依托咪酯高濃度組低于依托咪酯中濃度組（P＜0.05）。

表1 各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與LPS組相比，bP＜0.05；與依托咪酯低濃度組相比，cP＜0.05；與依托咪酯中濃度組相比，dP＜0.05。

組別依托咪酯低濃度組依托咪酯中濃度組依托咪酯高濃度組LPS組對照組IL-239.56 ± 5.11ab 28.79 ± 4.86abc 17.78 ± 2.77abcd 52.68 ± 5.86a 6.68 ± 1.65 IL-6104.76 ± 15.44ab 83.85 ± 12.86abc 65.85 ± 9.06abcd 127.68 ± 19.90a 41.75 ± 7.96 TNF-α 228.05 ± 27.87ab 195.69 ± 24.75abc 160.54 ± 19.58abcd 268.47 ± 29.16a 125.58 ± 17.86

2.2 各組細(xì)胞存活率、凋亡率比較 對照組、LPS組、依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞存活率分別為100.00%、40.08% ±6.04%、52.87% ± 6.21%、66.48% ± 7.10%、81.26% ± 9.54%，組間相比，P均＜0.05。對照組、LPS組、依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞凋亡率分別為4.40% ± 1.09%、25.16% ± 5.07%、19.77% ± 4.03%、14.71% ±2.25%、10.05% ± 2.05%，組間相比，P均＜0.05。

2.3 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA相對表達(dá)量比較見表2。由表2可知，與對照組相比，LPS組、依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞中TGF-β1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量、Smad3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均升高（P均＜0.05）；與LPS組相比，依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞中TGF-β1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量、Smad3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均降低（P均＜0.05），且依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組低于依托咪酯低濃度組（P均＜0.05），依托咪酯高濃度組低于依托咪酯中濃度組（P＜0.05）。

表2 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

表2 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與LPS組相比，bP＜0.05；與依托咪酯低濃度組相比，cP＜0.05；與依托咪酯中濃度組相比，dP＜0.05。

組別依托咪酯低濃度組依托咪酯中濃度組依托咪酯高濃度組LPS組對照組TGF-β1 mRNA 2.18 ± 0.41ab 1.78 ± 0.26abc 1.46 ± 0.21abcd 2.67 ± 0.55a 1.00 ± 0.00蛋白0.57 ± 0.12ab 0.40 ± 0.09abc 0.27 ± 0.05abcd 0.85 ± 0.18a 0.15 ± 0.02 Smad3 mRNA 2.05 ± 0.36ab 1.72 ± 0.31abc 1.33 ± 0.27abcd 2.55 ± 0.54a 1.00 ± 0.00蛋白0.90 ± 0.19ab 0.65 ± 0.15abc 0.48 ± 0.07abcd 1.08 ± 0.23a 0.29 ± 0.06

3 討論

LPS是內(nèi)毒素的有效成分，是一種多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的復(fù)合物，能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞、組織的損傷，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要誘因，同時(shí)其能干預(yù)氣道上皮細(xì)胞分泌炎癥因子，這些炎癥因子能夠參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程和免疫應(yīng)答過程［12-14］。依托咪酯是一種小分子量的化合物，也是一種常用的麻醉藥物，起效快，同時(shí)有鎮(zhèn)靜和催眠的作用，其被證明可有效保護(hù)器官免受急性損傷，例如缺血和再灌注引起的心臟損傷以及動(dòng)物急性肺損傷［15-16］。這些保護(hù)作用部分歸因于其抗炎功能，依托咪酯已被證明可減輕急性肺損傷小鼠的肺組織炎性浸潤和病理損傷［17］。然而，依托咪酯的抗炎作用的細(xì)胞和分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究使用LPS處理ASMCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS處理的ASMCs存活率顯著降低，凋亡率、IL-2、IL-6、TNF-α水平顯著升高。在LPS處理的ASMCs培養(yǎng)基中加入依托咪酯后，可以觀察到ASMCs存活率顯著升高，凋亡率、IL-2、IL-6、TNF-α水平顯著降低，且呈現(xiàn)濃度依賴性，與景建闖等［17］研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)的ASMCs發(fā)生炎性損傷，導(dǎo)致ASMCs存活減少，凋亡細(xì)胞數(shù)目增多，而依托咪酯能減輕LPS誘導(dǎo)的ASMCs炎性損傷，減少因炎性損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，提高ASMCs存活率。

TGF-β1/Smad3是與氣道重塑和脂質(zhì)代謝過程密切相關(guān)的信號(hào)通路，TGF-β1在肝臟中含量較高，能夠參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等生物學(xué)行為［18-19］。Smad3是TGF-β1的下游信號(hào)分子，TGF-β1與其受體結(jié)合后能激活Smad3，調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路也在炎癥反應(yīng)和多種器官纖維化的發(fā)展中起著重要作用［20-21］。FENG等［22］研究表明，地塞米松能夠抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路拮抗氣道重塑。GUAN等［23］研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1能降低TGF-β1/Smad3信號(hào)通路活性，從而改善香煙煙霧誘導(dǎo)的大鼠氣道重塑和肺功能。WU等［24］報(bào)道，細(xì)顆粒物能夠激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路促使哮喘大鼠病情加重，從而導(dǎo)致氣道纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS處理的ASMCs中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白水平顯著升高，在LPS處理的ASMCs培養(yǎng)基中加入依托咪酯后，ASMCs中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白水平顯著降低，且依托咪酯濃度越高，降低效果越明顯。結(jié)合FENG和GUAN等［22-23］的研究，我們推測，抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路能改善大鼠氣道重塑，可能是因?yàn)闇p輕了大鼠ASMCs的炎性損傷，降低了ASMCs的凋亡率；而依托咪酯能抑制LPS誘導(dǎo)的ASMCs炎性損傷和凋亡，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的依托咪酯對LPS誘導(dǎo)人ASMCs炎性損傷均具有改善作用，可升高細(xì)胞存活率、降低細(xì)胞凋亡率，且20 μg/mL依托咪酯的的改善作用最強(qiáng)。依托咪酯對LPS誘導(dǎo)人ASMCs炎性損傷的改善作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活有關(guān)。但本研究僅探討了依托咪酯通過TGF-β1/Smad3信號(hào)通路對LPS誘導(dǎo)的ASMCs炎性損傷的抑制作用，依托咪酯能否通過其他信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的ASMCs炎性損傷，有待深入研究。