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1內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030

2內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 0140300

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率均居惡性腫瘤前列。中國結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）數(shù)據(jù)顯示，中國2020 年結(jié)直腸癌新發(fā)病例56 萬例，病死29 萬例[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生大多遵循“腺瘤-癌”的發(fā)病機(jī)制，在該機(jī)制下從腺瘤發(fā)展到癌一般需要5～10 年，為結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療提供了重要的窗口期[2]。因此研究結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)尤為重要。特異性頂部盤狀底板反應(yīng)蛋白（roof plate-specific spondin，RSPO）是新興的成年人干細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)，RSPO 在白血病[3]、乳腺癌[4]、宮頸癌[5]、膀胱癌[6]、食管癌[7]、胃癌[8]、結(jié)直腸癌[9-10]等多種惡性腫瘤中均異常表達(dá)，在各種惡性腫瘤中發(fā)揮不同的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，RSPO3 在結(jié)直腸癌中起著促癌和抑癌兩種截然相反的作用。本研究探討RSPO3 在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年6—12 月內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸腺瘤或結(jié)直腸腺癌；既往未接受過放化療；病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；合并其他免疫系統(tǒng)疾??；存在遺傳性結(jié)直腸癌家族史。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入30 例結(jié)直腸腺瘤和30 例結(jié)直腸腺癌患者。結(jié)直腸腺癌患者中，男19 例，女11 例；年齡49～86 歲；分化程度：低分化4 例，中分化25 例，高分化1 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28 例。結(jié)直腸腺瘤患者中，男14例，女16 例；年齡37～66 歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測RSPO3 及β-catenin、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）的相對(duì)表達(dá)量

取30 例結(jié)直腸腺瘤組織及瘤旁5 cm 處正常組織、30 例結(jié)直腸腺癌組織及癌旁5 cm 處正常組織。研磨、裂解細(xì)胞提取蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度，定量定體積配置上樣液。制備8%分離膠和濃縮膠，將膠板固定于電泳儀中，加入電泳液，定量定體積加入上樣液，以恒定電壓進(jìn)行電泳，上樣液在濃縮膠內(nèi)使用恒壓80 V，約30 min，當(dāng)上樣液進(jìn)入分離膠后，調(diào)整為恒壓120 V，約70 min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)下膠邊緣關(guān)掉電源。將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于無水甲醇中激活1 min，制作轉(zhuǎn)膜“三明治”，由陰極至陽極，依次以海綿、濾紙、凝膠、PVDF 膜、濾紙、海綿的順序疊放，置入轉(zhuǎn)膜儀中，以390 mA 的恒定電流轉(zhuǎn)膜70 min。封閉并孵育一抗、二抗。將電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液的A 液和B 液按1∶1的比例配置，現(xiàn)配現(xiàn)用，將配置好的ECL工作液滴加至膜上，孵育1 min，在暗室內(nèi)進(jìn)行顯影，根據(jù)顯影的效果，調(diào)整曝光的時(shí)間，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算RSPO3、BAX、β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 免疫組化法檢測RSPO3、BAX、β-catenin 蛋白的表達(dá)情況

取30 例結(jié)直腸腺瘤組織及瘤旁5 cm 處正常組織、30 例結(jié)直腸腺癌組織及癌旁5 cm 處正常組織，固定于載玻片上，65 ℃、90 min 進(jìn)行烤片，于100%二甲苯中脫蠟3 次，每次10 min，按100%、95%、85%、75%梯度乙醇水化，每次5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3 次，每次3 min。稀釋乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗原修復(fù)液至pH 值=8.0 進(jìn)行抗原修復(fù)，高溫高壓修復(fù)20 min，室溫下自然冷卻，PBS 沖洗3 次，每次3 min。濕化盒中，滴加3%H2O2覆蓋組織，室溫放置10 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min。濕化盒中，滴加正常山羊血清封閉液，室溫放置20 min，甩去多余液體，免沖洗。滴加一抗兔抗人RSPO3、BAX、β-catenin 單克隆抗體（稀釋比例1∶100），每張切片40 μl，每種樣品留片1 張，更替抗體為生理鹽水40 μl（陰性對(duì)照），置于濕化盒中防止干燥，4 ℃孵育過夜，次日復(fù)溫40 min，濕化盒中，滴加酶標(biāo)山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 次，每次3 min。濕化盒中滴加鏈霉親和素-POD 工作液，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗4 次，每次5 min。滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液顯色，顯微鏡下觀察顯色完成后，蒸餾水沖洗終止染色，蘇木素復(fù)染，流動(dòng)水沖洗2 min。鹽酸乙醇分化5 s，流動(dòng)水沖洗2 min，氨水返藍(lán)。75%、85%、95%、100%梯度乙醇脫水，每次5 min，二甲苯脫蠟透明5 min，蓋玻片封片，顯微鏡下觀察RSPO3、BAX、β-catenin 蛋白的表達(dá)情況。

結(jié)果判定：RSPO3、BAX 主要定位于細(xì)胞質(zhì)，β-catenin 主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒判定為陽性細(xì)胞。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分，未著色計(jì)0 分，淡黃色染色計(jì)1分，棕黃色染色計(jì)2 分，黃褐色染色計(jì)3 分；陽性細(xì)胞所占比例為0%計(jì)0分，陽性細(xì)胞所占比例為1%～33%計(jì)1 分，陽性細(xì)胞所占比例為34%～66%計(jì)2分，陽性細(xì)胞所占比例為67%～100%計(jì)3 分。將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分相加，≤3 分判定為低表達(dá)，≥4 分判定為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSPO3、β-catenin、BAX 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

結(jié)直腸腺癌組織中RSPO3、β-catenin 的相對(duì)表達(dá)量均高于結(jié)直腸腺癌癌旁正常組織，結(jié)直腸腺瘤組織中RSPO3、β-catenin 的相對(duì)表達(dá)量均高于結(jié)直腸腺瘤瘤旁正常組織，結(jié)直腸腺癌組織中RSPO3、β-catenin 的相對(duì)表達(dá)量均高于結(jié)直腸腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)直腸腺癌組織中BAX 的相對(duì)表達(dá)量低于結(jié)直腸腺癌癌旁正常組織，結(jié)直腸腺瘤組織中BAX 的相對(duì)表達(dá)量低于結(jié)直腸腺瘤瘤旁正常組織，結(jié)直腸腺癌組織中BAX 的相對(duì)表達(dá)量低于結(jié)直腸腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1、表1）

表1 結(jié)直腸腺癌及癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤及瘤旁正常組織中RSPO3、β-catenin、BAX 相對(duì)表達(dá)量的比較（x-x-±s）

圖1 Western blot檢測結(jié)直腸腺癌及癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤及瘤旁正常組織中RSPO3、β-catenin、BAX 的表達(dá)情況

2.2 RSPO3、β-catenin、BAX 蛋白表達(dá)情況的比較

結(jié)直腸腺癌組織、結(jié)直腸腺癌癌旁正常組織及結(jié)直腸腺瘤組織中RSPO3、β-catenin、BAX 蛋白表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；結(jié)直腸腺癌組織中RSPO3、β-catenin 蛋白高表達(dá)率均高于結(jié)直腸腺癌癌旁正常組織及結(jié)直腸腺瘤組織，BAX 蛋白高表達(dá)率低于結(jié)直腸腺癌癌旁正常組織及結(jié)直腸腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2、圖2）

表2 結(jié)直腸腺癌組織、結(jié)直腸腺癌癌旁正常組織及結(jié)直腸腺瘤組織中RSPO3、β-catenin、BAX蛋白表達(dá)情況的比較[n（%）]

圖2 免疫組化法檢測結(jié)直腸腺癌組織、結(jié)直腸腺癌癌旁正常組織及結(jié)直腸腺瘤組織中RSPO3、β-catenin、BAX蛋白的表達(dá)情況（鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶染色，×400）

2.3 結(jié)直腸腺癌組織中RSPO3 與β-catenin、BAX表達(dá)的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸腺癌組織中RSPO3 的表達(dá)與β-catenin 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.936，P＜0.05），RSPO3 的表達(dá)與BAX 的表達(dá)無相關(guān)性（r=0.333，P＞0.05）。

3 討論

RSPO 是新興的成年人干細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，影響干細(xì)胞的增殖與分化。RSPO 的結(jié)構(gòu)域高度保守：N 末端疏水的分泌信號(hào)肽序列，兩個(gè)富含半胱氨酸的furin-like 結(jié)構(gòu)域，一個(gè)血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域，C 末端帶有不同電量的正電荷。RSPO 蛋白家族（RSPO1～4）在胚胎的發(fā)育過程中發(fā)揮作用，并且每種蛋白都具有獨(dú)特的作用[11]。研究顯示，RSPO家族蛋白主要通過WNT/β-catenin 信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[12]。β-catenin 是WNT 信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)蛋白，在WNT 信號(hào)通路激活的細(xì)胞中由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核成為轉(zhuǎn)錄激活因子，激活促使細(xì)胞分裂的基因。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸腺癌組織中RSPO3的表達(dá)上調(diào)，且高于結(jié)直腸腺癌癌旁正常組織及結(jié)直腸腺瘤組織。Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸腺癌組織中RSPO3 的表達(dá)與β-catenin 的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。RSPO3 可通過WNT 信號(hào)通路激活下游信號(hào)因子β-catenin 的表達(dá)，促使β-catenin 由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活因子，啟動(dòng)促使細(xì)胞激活的基因。RSPO3、β-catenin 可作為結(jié)直腸腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。本研究初步證實(shí)了RSPO3、WNT/β-catenin 信號(hào)通路可能參與了結(jié)直腸腺癌的惡性生物學(xué)行為，RSPO3 可能作為結(jié)直腸腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，RSPO3 在結(jié)直腸腺癌組織中高表達(dá)，可能作為結(jié)直腸腺癌臨床治療的潛在靶點(diǎn)。