李佳琦，荀咪，石鈞元，宋建飛，石宇佳，張瑋瑋，楊洪強(qiáng)

蘋(píng)果幼樹(shù)根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度及根際酶活性對(duì)土壤緊實(shí)脅迫的響應(yīng)特征

李佳琦，荀咪，石鈞元，宋建飛，石宇佳，張瑋瑋，楊洪強(qiáng)

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018

【目的】明確引起緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根系微域環(huán)境中細(xì)菌豐度變化的主要因子，揭示土壤脅迫下蘋(píng)果根際生物學(xué)特征，為果園土壤管理提供參考。【方法】以砧木分別為平邑甜茶（Rehd）和八棱海棠（Rehd.）的2年生‘紅富士’蘋(píng)果（Borkh.cv. Red Fuji）盆栽幼樹(shù)為試材，通過(guò)鎮(zhèn)壓土壤設(shè)置緊實(shí)脅迫，檢測(cè)根際礦質(zhì)養(yǎng)分含量和土壤酶活性以及根際細(xì)菌和根系內(nèi)生細(xì)菌豐度。【結(jié)果】無(wú)論是紅富士/平邑甜茶還是紅富士/八棱海棠，土壤緊實(shí)脅迫均明顯提高蘋(píng)果根際速效磷和有效鉀含量，提高根際過(guò)氧化氫酶活性；顯著降低根際堿解氮含量和根際蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶活性，以及根系內(nèi)生細(xì)菌的豐度，并改變根際微生物組成結(jié)構(gòu)。土壤緊實(shí)脅迫下，根際細(xì)菌數(shù)量和豐度、根際熒光素二乙酸酯（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）水解酶活性的變化因砧木而不同，它們?cè)诩t富士/平邑甜茶中顯著降低，降低幅度分別為46.88%、50.50%和29.13%；在紅富士/八棱海棠中則顯著升高，升高幅度分別為51.41%、20.22%和13.76%。土壤緊實(shí)脅迫下，紅富士/平邑甜茶根際堿解氮含量、水解酶（蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶）活性以及根內(nèi)細(xì)菌豐度的下降幅度大于紅富士/八棱海棠；紅富士/八棱海棠根際比紅富士/平邑甜茶具有更強(qiáng)的FDA水解酶活性。冗余分析顯示，土壤緊實(shí)脅迫下，根際有效鉀、堿解氮和FDA水解酶活性對(duì)蘋(píng)果根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度變異的解釋率最高?！窘Y(jié)論】土壤緊實(shí)脅迫顯著影響蘋(píng)果根際微生物組成，進(jìn)而改變根際土壤酶活性和根際有效性礦質(zhì)養(yǎng)分的含量。根際細(xì)菌和FDA水解酶活性的變化因砧木而不同，其在紅富士/平邑甜茶中受到土壤緊實(shí)脅迫的抑制程度較高。土壤緊實(shí)脅迫下，蘋(píng)果根際有效鉀和堿解氮磷含量以及FAD水解酶酶活性的改變與根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度的變化存在更密切的關(guān)系。

土壤緊實(shí)；蘋(píng)果砧木；根際；土壤酶；根內(nèi)生細(xì)菌

0 引言

【研究意義】土壤酶是土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)的主要推動(dòng)因子，土壤酶主要來(lái)自微生物。土壤緊實(shí)度會(huì)顯著影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和活性，土壤緊實(shí)度過(guò)高會(huì)重塑根際微生物群落[1-2]，降低土壤健康水平和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力。根際是土壤生物活動(dòng)非常旺盛的微域，其中細(xì)菌是評(píng)估土壤環(huán)境質(zhì)量的指示性標(biāo)志，對(duì)環(huán)境變化十分敏感[3]。因此，探討土壤緊實(shí)脅迫對(duì)根際環(huán)境的影響，分析土壤緊實(shí)脅迫下的根微域細(xì)菌響應(yīng)特征及其與環(huán)境因子的相關(guān)性，有助于認(rèn)識(shí)土壤脅迫下果樹(shù)根際生物學(xué)特征及為指導(dǎo)果園土壤管理提供理論參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于重型機(jī)械的使用、頻繁踐踏、不當(dāng)耕作、土壤黏粒沉積以及土壤水分和有機(jī)質(zhì)含量下降等多種因素的影響，土壤緊實(shí)現(xiàn)象普遍存在并有逐年增加的趨勢(shì)[2,4]。緊實(shí)度增加不僅提高土壤容重，改變土壤理化性質(zhì)和土壤生物環(huán)境，增加根系穿透阻力，抑制根系生長(zhǎng)，干擾植物對(duì)養(yǎng)分的吸收和代謝[5-7]，還降低土壤孔隙度和導(dǎo)水率，限制土壤水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸和有效性[8-9]，抑制乙烯等活性氣體分子在根系和根際之間的擴(kuò)散[10]。土壤微生物參與土壤結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，驅(qū)動(dòng)碳、氮、磷和硫等元素循環(huán)，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和根部營(yíng)養(yǎng)，是促進(jìn)植物和土壤進(jìn)行物質(zhì)交換的媒介[11-12]。根系與土壤相連的“根際”形成了特定的根系微環(huán)境，該微環(huán)境中存在著大量活躍的根際微生物[1]，它們不僅受土壤類型、人類農(nóng)事活動(dòng)等因素影響，還受砧木類型的影響[13-14]。同時(shí)，在根系內(nèi)還存在被認(rèn)為是植物“次級(jí)基因”的根內(nèi)微生物，它們是根系與土壤的橋梁，能夠?yàn)樗拗髦参锾峁┲匾墓δ苄曰衔颷1,15]。根際和根內(nèi)微生物的種類、數(shù)量和活性是影響土壤養(yǎng)分有效性和植物養(yǎng)分高效利用的重要因素之一，是反映根區(qū)土壤肥力的重要指標(biāo)[15-16]。土壤微生物是土壤酶的主要來(lái)源，微生物的種類、數(shù)量和活性決定著土壤酶的種類、數(shù)量和活性，土壤酶能直接催化土壤物質(zhì)的轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)有效養(yǎng)分的含量[17-18]。土壤微域是微生物的棲息場(chǎng)所，緊實(shí)度增加會(huì)改變土壤微域環(huán)境，進(jìn)而會(huì)影響植物養(yǎng)分吸收、代謝和生長(zhǎng)，這種影響因果樹(shù)砧木不同而存在明顯差異[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根際是被根系所影響的土壤微域，是土壤生物活動(dòng)非常旺盛的區(qū)域，在緊實(shí)度增加的情況下，該土壤微域的微生物和酶活性等變化尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】平邑甜茶和八棱海棠是蘋(píng)果生產(chǎn)中兩種比較常用的砧木，本研究選用以它們?yōu)檎枘镜奶O(píng)果嫁接樹(shù)，探討土壤緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根際礦質(zhì)養(yǎng)分、酶活性以及根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度的變化，分析它們之間的關(guān)系，為深入揭示土壤緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根際生物學(xué)特征及果園土壤管理提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年3—12月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家蘋(píng)果工程技術(shù)研究中心蘋(píng)果試驗(yàn)站和山東省高校果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料與處理

試材是砧木分別為平邑甜茶（Rehd.）和八棱海棠（Rehd.）的2年生‘紅富士’蘋(píng)果（Borkh cv. Red Fuji）盆栽樹(shù)。盆高23 cm、直徑32 cm；盆土由壤土、有機(jī)肥、河沙按照3﹕1﹕1體積比混合而成[6]，有機(jī)質(zhì)含量10.05 g·kg-1，全氮0.30 g·kg-1、堿解氮110.28 mg·kg-1、全磷3.39 g·kg-1、速效磷44.69 mg·kg-1、全鉀2.67 g·kg-1、有效鉀296.9 mg·kg-1、pH 6.5。

2021年4月選取長(zhǎng)勢(shì)一致的2年生盆栽蘋(píng)果幼樹(shù)，在遮雨棚下移至陶盆，逐層填入盆土，在填土過(guò)程中逐層鎮(zhèn)壓形成“緊實(shí)土壤”，以未進(jìn)行鎮(zhèn)壓的“正常土壤”為對(duì)照?！熬o實(shí)土壤”和“正常土壤”充分澆水，連續(xù)多次澆水沉實(shí)后，“緊實(shí)土壤”的機(jī)械阻力穩(wěn)定在1 200—1 500 kPa，正常土壤的機(jī)械阻力穩(wěn)定在800—900 kPa，其他相關(guān)性狀見(jiàn)表1。試驗(yàn)期間處理和對(duì)照均采用相同的常規(guī)管理，在緊實(shí)脅迫處理3個(gè)月后（2021年7月12日）測(cè)定土壤物理性狀（表1），隨后取樣分析。

表1 緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根區(qū)土壤物理性狀

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。同行不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（Duncan’s新復(fù)極差法）（＜0.05）

All values are mean ± standard deviation (n=3). Different lowercase letters in the same row indicate significant difference (Duncan’s New Multiple Range Method) (＜0.05)

1.2 取樣方法與測(cè)定指標(biāo)

1.2.1 根際土壤與根系取樣 參照Marasco等[19]和CHERIF等[20]的方法采集根際土壤和根系樣品，即去除2 cm表土，將根系連同土壤取出，輕輕抖落根系附著的疏松土塊，用無(wú)菌剪刀剪取直徑1—2 mm、長(zhǎng)4—6 cm的根系，放入含無(wú)菌液的離心管中，在搖床上以200 r/min震蕩清洗20 min，移出根系轉(zhuǎn)至含無(wú)菌液的另一離心管中繼續(xù)震蕩清洗，取出根系，將兩次清洗液合并，在4 000×下離心20 min，沉淀即為根際土壤，一部分保存于-80℃用于根際細(xì)菌總豐度測(cè)定，另一部分風(fēng)干后分析理化性質(zhì)；取出的根系進(jìn)行表面清洗和消毒后，保存于-80 ℃用于分析根內(nèi)細(xì)菌總豐度。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 土壤緊實(shí)度用土壤緊實(shí)度儀（TISD-750-11，浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司）測(cè)定，氧氣濃度用便攜式光纖測(cè)氧儀（Microx 4 trace，慧諾德科技有限公司）測(cè)定，測(cè)點(diǎn)均在地表下10 cm并靠近根系處。土壤容重采用“環(huán)刀法”，土壤孔隙度=（1-容重/比重）×100%。土壤總氮（TN）、總磷（TP）和總鉀（TK）含量分別采用凱氏定氮法、鉬藍(lán)比色法和火焰光度法測(cè)定；土壤堿解氮（AN）、速效磷（AP）和有效鉀（AK）含量分別采用堿溶液擴(kuò)散法、NaHCO3浸提-硫酸鉬銻抗比色法和NH4OAc浸提-火焰光度計(jì)法測(cè)定。土壤過(guò)氧化氫酶（CAT）、蔗糖酶（SAC）、脲酶（URE）以及酸性磷酸酶（ACP）活性按照關(guān)松蔭[21]《土壤酶及其研究方法》中的方法檢測(cè)。

1.2.3 根際細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量測(cè)定 參照李振高等[22]的方法，用稀釋平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量，測(cè)定細(xì)菌數(shù)量使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，測(cè)定真菌數(shù)量使用馬鈴薯-蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基），測(cè)定放線菌數(shù)量使用改良高氏（Gause）1號(hào)培養(yǎng)基。準(zhǔn)確稱取1 g干樣重的新鮮土樣，加入盛有100 mL無(wú)菌水的500 mL錐形瓶中，放置于振蕩機(jī)上振蕩30 min，制作土壤懸液。吸取1 mL土壤懸液到9 mL稀釋液（無(wú)菌水）中，依次按10倍法進(jìn)行稀釋，測(cè)定細(xì)菌稀釋至10-5，真菌稀釋至10-3，放線菌稀釋至10-4，吸取50 μL土壤懸液，用玻璃刮刀涂布于對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基。將接種土壤懸液的培養(yǎng)皿倒置在28—30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間（細(xì)菌2 d、真菌3 d、放線菌5 d）后取出，細(xì)菌和放線菌選取20—200菌落數(shù)的培養(yǎng)皿，真菌選取10—100菌落數(shù)的培養(yǎng)皿。

1.2.4 根際、根內(nèi)生細(xì)菌總豐度測(cè)定 參照Lu等[23]的方法分析根際、根內(nèi)細(xì)菌總豐度，即稱取根際土壤，用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（OMEGA，美國(guó)）試劑盒提取土壤微生物總DNA；稱取根系，用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（Cat#DP3112，無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司）提取根系總DNA。DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定完整性、BioDrop測(cè)定純度和濃度后，根據(jù)細(xì)菌rRNA的V3-V4高變區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，其中，根際土壤細(xì)菌特異引物[24]為：338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，根內(nèi)生細(xì)菌特異引物[25]為：322F：5'-ACGGHCCARACT CCTACGGGA-3'；796R：5'-CTACCMGGGTATCTAA TCCKG-3'。

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括SYBR? Premix Ex TaqTM (2×) 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8.2 μL；反應(yīng)條件為：預(yù)變性90 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s；退火延伸60 ℃ 30 s，60個(gè)循環(huán)。將上述特異性引物制備的標(biāo)準(zhǔn)品在同樣反應(yīng)體系和條件下進(jìn)行熒光定量，其結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線計(jì)算根際土壤和根內(nèi)細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和Origin 2021進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖，利用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較(α=0.05)分析各個(gè)指標(biāo)在4種處理間的差異顯著性；使用Pearson相關(guān)系數(shù)和Canoco 5軟件進(jìn)行冗余分析，評(píng)價(jià)根際、根內(nèi)細(xì)菌豐度與根際土壤酶活性和環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 土壤緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根際礦質(zhì)養(yǎng)分含量的變化

由圖1可見(jiàn)，無(wú)論砧木是平邑甜茶還是八棱海棠，土壤緊實(shí)脅迫對(duì)蘋(píng)果根際總氮（TN）、總磷（TP）、總鉀（TK）含量均無(wú)顯著影響，但降低根際土壤堿解氮（AN）含量，提高速效磷（AP）、有效鉀（AK）含量。其中，緊實(shí)土壤下紅富士/平邑甜茶和紅富士/八棱海棠的根際AN含量分別降低33.67%和7.55%，AP含量分別增加17.39%和35.64%，AK含量分別增加129.10%和198.97%。

Mh：紅富士/平邑甜茶；Mr：紅富士/八棱海棠；Cs：緊實(shí)土壤；Ns：正常土壤。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2 土壤緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根際土壤酶活性的變化

由圖2可見(jiàn)，在土壤緊實(shí)脅迫下，無(wú)論砧木是平邑甜茶還是八棱海棠，蘋(píng)果根際過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均顯著提高，而蔗糖酶（SAC）、脲酶（URE）以及酸性磷酸酶（ACP）活性均顯著降低。其中，在緊實(shí)土壤的紅富士/平邑甜茶和紅富士/八棱海棠中，根際土壤CAT活性分別提高23.46%和22.89%，SAC活性分別降低42.18%和22.25%，URE活性分別降低33.33%和30.00%，ACP活性分別降低58.88%和35.87%。與對(duì)照相比，土壤緊實(shí)脅迫顯著降低紅富士/平邑甜茶中蘋(píng)果根際FDA水解酶活性，但顯著提高紅富士/八棱海棠中根際FDA水解酶活性。

圖2 土壤緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果砧木根際土壤酶活性

2.3 土壤緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化

由表2可見(jiàn)，根際細(xì)菌數(shù)量顯著高于真菌和放線菌數(shù)量，土壤緊實(shí)脅迫顯著改變根際細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量結(jié)構(gòu)。在土壤緊實(shí)脅迫下，紅富士/平邑甜茶和紅富士/八棱海棠的根際真菌數(shù)量分別降低52.51%和45.67%，放線菌數(shù)量分別增加31.03%、39.10%。根際細(xì)菌數(shù)量在土壤緊實(shí)脅迫下的變化因砧木而不同，它在紅富士/平邑甜茶中顯著降低（降低幅度46.88%），而在紅富士/八棱海棠中顯著升高（升高幅度51.41%）。

土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量的比值（ratio of bacteria to fungi，B/F）及放線菌和真菌數(shù)量的比值（ratio of actinomyces to fungi，A/F）是反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。表2顯示，無(wú)論砧木是平邑甜茶還是八棱海棠，根際B/F和A/F在土壤緊實(shí)脅迫下均顯著增加，其中B/F在紅富士/平邑甜茶和紅富士/八棱海棠分別增加了12.81%、187.67%，A/F分別增加了177.99%、202.75%，說(shuō)明緊實(shí)脅迫顯著改變了蘋(píng)果根際微生物群落組成，增加了細(xì)菌和放線菌群落在微生物群落結(jié)構(gòu)組成中的相對(duì)比例，在紅富士/八棱海棠中變化更突出。

因此，蘋(píng)果根際細(xì)菌對(duì)土壤緊實(shí)脅迫的反應(yīng)不同于真菌和放線菌，根際細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真菌和放線菌數(shù)量，而且細(xì)菌和真菌數(shù)量的比值（B/F）在土壤緊實(shí)脅迫下顯著提高，暗示緊實(shí)土壤中細(xì)菌群落在根際微環(huán)境變化中具有獨(dú)特作用。

表2 土壤緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根際微生物群落組成結(jié)構(gòu)

2.4 土壤緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根際及根內(nèi)細(xì)菌豐度的變化

rRNA拷貝數(shù)可反映總細(xì)菌豐度（total bacteria abundance）[26]。由圖3可見(jiàn)，蘋(píng)果根際細(xì)菌rRNA拷貝數(shù)整體上高于根內(nèi)細(xì)菌rRNA拷貝數(shù)。蘋(píng)果根際rRNA拷貝數(shù)在土壤緊實(shí)脅迫下的變化也因砧木種類而異，在以平邑甜茶為砧木時(shí)顯著降低（60.18%）、以八棱海棠為砧木時(shí)顯著提高（389.53%）（圖3-A）。

圖3-B顯示，無(wú)論砧木是平邑甜茶還是八棱海棠，根內(nèi)細(xì)菌rRNA拷貝數(shù)在土壤緊實(shí)脅迫下均顯著降低，紅富士/平邑甜茶和紅富士/八棱海棠中分別降低50.50%和20.22%，即根內(nèi)細(xì)菌豐度在紅富士/平邑甜茶中降低幅度更大，紅富士/平邑甜茶根系內(nèi)生細(xì)菌對(duì)土壤緊實(shí)脅迫的反應(yīng)比八棱海棠根系的更敏感。

圖3 土壤緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根際（A）和根內(nèi)（B）細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)

2.5 土壤緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根際和根內(nèi)生細(xì)菌豐度與根區(qū)土壤性狀的關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在土壤緊實(shí)脅迫下，蘋(píng)果根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度與根區(qū)土壤物理性狀、根際礦質(zhì)養(yǎng)分含量和根際酶活性存在普遍的相關(guān)性，相關(guān)性程度因砧木種類的不同而存在差異。其中，紅富士/平邑甜茶蘋(píng)果根際細(xì)菌和根內(nèi)細(xì)菌豐度與土壤SP、O2、根際AN、URE、ACP和FDA水解酶活性具有極顯著正相關(guān)性，與土壤SBD、根際AP和AK具有極顯著負(fù)相關(guān)性；根際細(xì)菌豐度與根際CAT顯著負(fù)相關(guān)，SAC顯著正相關(guān)，而根內(nèi)細(xì)菌與CAT無(wú)顯著相關(guān)性，與SAC極顯著正相關(guān)（表3）。紅富士/八棱海棠蘋(píng)果根際細(xì)菌豐度與根際CAT活性具有顯著正相關(guān)性，與土壤SBD、根際AP、AK和FDA水解酶活性具有極顯著正相關(guān)性；而與根際AN、ACP活性具有顯著負(fù)相關(guān)性，與土壤SP、O2、根際SAC、URE活性具有極顯著負(fù)相關(guān)性。另外，紅富士/八棱海棠蘋(píng)果根內(nèi)細(xì)菌豐度與土壤SBD、根際AP、AK、CAT和FDA水解酶活性具有極顯著負(fù)相關(guān)性，與土壤SP、O2、根際AN、SAC、URE和ACP具有極顯著正相關(guān)性（表4）。

表3 紅富士/平邑甜茶根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度與土壤理化性狀和根際酶活性相關(guān)系數(shù)

*：＜0.05；**：＜0.01。下同The same as below

表4 紅富士/八棱海棠根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度與土壤理化性狀和根際酶活性的相關(guān)系數(shù)

土壤緊實(shí)脅迫下的根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度的變化是土壤中多個(gè)因素綜合作用的結(jié)果。以根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度作為響應(yīng)變量、以根際土壤酶活性及環(huán)境因子作為解釋變量進(jìn)行冗余分析。由圖4可以看出，橫軸和縱軸分別解釋了總細(xì)菌豐度變異的83.79%和16.08%，AK、AN、FDA、URE是引起根際和根內(nèi)總細(xì)菌豐度變異的顯著變量（＜0.05），其中AK解釋了變異的63.60%，F(xiàn)DA水解酶和AN分別解釋了變異的16.60%和16.30%，說(shuō)明土壤緊實(shí)脅迫下根際AK、AN和FDA水解酶與根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度的變化存在更密切的關(guān)系，尤其是AK。

3 討論

土壤中“水、肥、氣、熱”諸因子相互協(xié)調(diào)是保證作物健康生長(zhǎng)的重要條件[27]。然而土壤緊實(shí)度增加提高了土壤容重，降低了土壤孔隙度和氧氣濃度，改變了土壤諸因子之間的關(guān)系和根際微環(huán)境[7-8]，而這必然會(huì)使依存于該微環(huán)境的微生物重新組裝[28]。本研究結(jié)果顯示，無(wú)論是紅富士/平邑甜茶還是紅富士/八棱海棠，土壤緊實(shí)度的提高均顯著影響蘋(píng)果根際細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量，也顯著改變根際有效土壤礦質(zhì)養(yǎng)分的含量和根際酶活性。包括礦質(zhì)養(yǎng)分在內(nèi)的多種土壤物質(zhì)需要在土壤酶的直接催化下發(fā)生轉(zhuǎn)化，土壤酶主要來(lái)源于土壤中的微生物。氧氣對(duì)土壤生物尤其是微生物的群落組成和根系養(yǎng)分吸收影響顯著[29-30]，土壤緊實(shí)度增加降低了土壤氧氣濃度，影響土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和含量。

圖4 土壤緊實(shí)脅迫下蘋(píng)果根際和根內(nèi)總細(xì)菌豐度與根際土壤酶活和理化性狀的冗余分析

3.1 土壤緊實(shí)脅迫影響根際礦質(zhì)養(yǎng)分

土壤氮、磷、鉀等養(yǎng)分的狀態(tài)和含量是構(gòu)成土壤理化性狀的重要因子，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需元素，土壤緊實(shí)度提高會(huì)限制養(yǎng)分在土壤中的移動(dòng)，影響根系對(duì)它們的吸收[31]。土壤緊實(shí)脅迫導(dǎo)致蘋(píng)果根際AN含量降低，AP和AK含量顯著提高，但沒(méi)有明顯影響它們?cè)诟H中的總含量。土壤緊實(shí)使植物根系和土壤界面緊密接觸，使P和K通過(guò)濃度梯度驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)散方式更易到達(dá)根系附近[28]，而根際養(yǎng)分總量沒(méi)有顯著變化；同時(shí)，緊實(shí)脅迫降低根區(qū)氧氣濃度，限制根系對(duì)養(yǎng)分的吸收，加上土壤養(yǎng)分?jǐn)U散也被限制[27]，導(dǎo)致AP、AK養(yǎng)分滯留于根際而使其含量提高。土壤緊實(shí)脅迫時(shí)，蘋(píng)果根系含硫量因砧木種類不同而異[6]。本研究中的蘋(píng)果根際礦質(zhì)養(yǎng)分含量也會(huì)因砧木種類不同而表現(xiàn)出差異，紅富士/平邑甜茶根際AN含量降低幅度高于紅富士/八棱海棠，其根際AP和AK含量增加幅度低于紅富士/八棱海棠，說(shuō)明土壤緊實(shí)脅迫對(duì)紅富士/平邑甜茶根際有效礦質(zhì)養(yǎng)分含量的負(fù)面影響更大。此外，蘋(píng)果根際AN含量的降低會(huì)抑制微生物對(duì)養(yǎng)分的獲取，進(jìn)而降低微生物豐度和活性[32]，而根際AN含量和AK含量在土壤緊實(shí)脅迫下的變化與蘋(píng)果根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度的變化關(guān)系尤為密切。

3.2 土壤緊實(shí)脅迫影響根際土壤酶活性和根際微生物

土壤中大部分酶來(lái)源于微生物，微生物的種類、數(shù)量和活性又決定著土壤酶的種類、數(shù)量和活性[17-18]。土壤酶推動(dòng)土壤中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化、元素循環(huán)和能量流動(dòng)，與土壤健康緊密相連，是土壤微生物功能性的體現(xiàn)[17]。CAT可以促進(jìn)過(guò)氧化氫的分解，其活性是土壤微生物氧化還原性能指標(biāo)[17]，緊實(shí)土壤的低氧環(huán)境使土壤中的生物化學(xué)變化更多地趨向還原反應(yīng)[29]。低氧是對(duì)需氧生物一種逆境脅迫，而逆境脅迫下活性氧的增加會(huì)誘導(dǎo)過(guò)氧化氫酶活性的升高[33]，這可能是土壤緊實(shí)脅迫導(dǎo)致蘋(píng)果根際CAT活性增強(qiáng)的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，在耕層或耕層以下，土壤緊實(shí)度增加顯著抑制土壤轉(zhuǎn)化酶和水解酶（SAC、URE、ACP）活性，降低微生物功能性[34]，本研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果根際的這些酶活性也同樣受到緊實(shí)脅迫的抑制，這可能與緊實(shí)脅迫限制了土壤通氣有關(guān)。除上述的土壤酶能夠反映土壤微生物功能外，土壤FDA水解酶也是評(píng)價(jià)土壤微生物量和微生物活性的重要指標(biāo)，它與微生物的相關(guān)性比其他酶更顯著[35]。其活性與根際細(xì)菌在紅富士/平邑甜茶（減少）和紅富士/八棱海棠（增加）均表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，說(shuō)明FDA水解酶與蘋(píng)果根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度的變化關(guān)系更密切。除土壤緊實(shí)脅迫外，蘋(píng)果根際土壤酶活性還受砧木種類的影響，紅富士/平邑甜茶根際CAT活性的提高幅度及SAC、URE、ACP活性的降低幅度均高于紅富士/八棱海棠；另外，F(xiàn)DA水解酶活性在紅富士/平邑甜茶根際中更易受到抑制，卻在紅富士/八棱海棠根際具有更強(qiáng)活性，說(shuō)明紅富士/平邑甜茶根際酶活性對(duì)土壤緊實(shí)脅迫更敏感。

土壤理化性質(zhì)的改變會(huì)造成微生物組成結(jié)構(gòu)的變化[12]。本研究也得到類似的結(jié)果，土壤緊實(shí)脅迫顯著改變蘋(píng)果根際微生物群落組成結(jié)構(gòu)，增加根際細(xì)菌群落所占比例。有研究表明土壤微生物特別是細(xì)菌對(duì)環(huán)境變化十分敏感，并將細(xì)菌群落作為評(píng)估土壤環(huán)境質(zhì)量的指示性標(biāo)志[3]，本研究中，蘋(píng)果根際細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真菌和放線菌的數(shù)量，而且細(xì)菌數(shù)量因砧木種類而異，說(shuō)明細(xì)菌群落對(duì)土壤緊實(shí)脅迫最敏感。且有研究證明，土壤細(xì)菌等一些微生物能通過(guò)產(chǎn)生乙烯等信號(hào)分子緩解環(huán)境壓力，協(xié)調(diào)根系生長(zhǎng)與環(huán)境的關(guān)系[36]，由此推測(cè)在土壤緊實(shí)脅迫下細(xì)菌發(fā)揮更為重要的生理作用。根際微生物存在于根土界面，受土壤環(huán)境與根系活動(dòng)的雙重影響[11]，在本研究中，土壤緊實(shí)脅迫下，紅富士/平邑甜茶根際細(xì)菌豐度受到抑制，紅富士/八棱海棠則能夠招募更多的根際細(xì)菌。DE CAMPOS等[37]認(rèn)為影響根際細(xì)菌群落的因素主要是植物而不是土壤。本研究中，根際細(xì)菌豐度與土壤性狀在兩種砧木中呈現(xiàn)不同的相關(guān)性，也說(shuō)明植物本身對(duì)根際細(xì)菌群落組成起主要作用。根內(nèi)微生物存在于植物根組織內(nèi)，能夠直接影響根系對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)[1]。另外，本研究也發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果根內(nèi)細(xì)菌豐度受到土壤緊實(shí)脅迫的顯著抑制，其原因可能在于緊實(shí)脅迫改變了土壤結(jié)構(gòu)以及土壤物理、化學(xué)與生物環(huán)境平衡[8]。綜合來(lái)看，土壤緊實(shí)度增加對(duì)蘋(píng)果根際與根內(nèi)細(xì)菌豐度變化的影響，是土壤多個(gè)因素綜合作用的結(jié)果，其中AN、AK以及FDA水解酶活性對(duì)細(xì)菌豐度的影響最大。此外，砧木種類對(duì)土壤緊實(shí)脅迫的反應(yīng)存在明顯差異[6]。而且，植物種類（基因型）不同所導(dǎo)致的根系形態(tài)和根系分泌物組成和數(shù)量不同，明顯影響根際及根內(nèi)生菌的菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)[38-39]。本研究結(jié)果也表明蘋(píng)果根際與根內(nèi)細(xì)菌豐度及其土壤理化因子的相關(guān)性也受到砧木種類的影響。

4 結(jié)論

土壤緊實(shí)脅迫顯著影響蘋(píng)果根際微生物組成，進(jìn)而改變根際土壤酶活性和根際有效性礦質(zhì)養(yǎng)分的含量。根際細(xì)菌和FDA水解酶活性的變化因砧木而不同，它們?cè)诩t富士/平邑甜茶中更易遭受土壤緊實(shí)脅迫抑制；紅富士/八棱海棠根際具有更強(qiáng)的FDA水解酶活性以及能夠招募更多細(xì)菌。土壤緊實(shí)脅迫下，蘋(píng)果根際有效鉀和堿解氮、磷含量以及FAD水解酶酶活性的改變與根際和根內(nèi)細(xì)菌豐度的變化存在更密切的關(guān)系，且其變化因砧木不同而異。

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LI JiaQi, XUN Mi, SHI JunYuan, SONG JianFei, SHI YuJia, ZHANG WeiWei, YANG HongQiang

College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong

【Objective】The aim of this study was to identify the main factors causing bacterial abundance changed in the apple roots microenvironment under compaction stress, so as to provide a reference for further revealing the biological characteristics of apple rhizosphere and orchard soil management under soil stress.【Method】The experimental materials were potted young apple (Borkh.cv. Red Fuji) tree with the rootstocks ofRehd. andRehd., respectively. After pressing the potted soil to form compaction stress, the rhizosphere mineral nutrient content, soil enzyme activity and the bacterial abundance of rhizosphere and root endosphere were measured.【Result】In bothand, the soil compaction stress significantly increased rhizosphere available phosphorus content, available potassium content and catalase activity, however, significantly decreased rhizosphere alkaline-hydrolyzed nitrogen content, sucrase activity, urease activity, acid phosphatase activity and root endosphere bacterial abundance. Furthermore, the soil compaction stress also changed the composition and structure of rhizosphere microorganisms. Under soil compaction stress, the amount and abundance of rhizosphere bacterial and the activity of fluorescein diacetate (FDA) hydrolase changed with different rootstocks; however, which were significantly decreased inRed Fuji, with the reduction rates were 46.88%, 50.50% and 29.13%, respectively, and significantly increased in Red Fuji, with the increases were 51.41%, 20.22% and 13.76%, respectively. In compacted soil, rhizosphere alkali- hydrolyzed nitrogen content, hydrolase (sucrase, urease, acid phosphatase) activities and the bacterial abundance of root endosphere in Red Fujidecreased more than that inRed Fuji. Compared with Red Fuji,Red Fujihad stronger FDA hydrolase activity and recruited more rhizosphere bacteria. Redundancy analysis showed that rhizosphere available potassium, alkali-hydrolyzed nitrogen, and FDA hydrolase activities had the highest explanatory rate for variation of bacterial abundance in rhizosphere and root endosphere of apple under soil compaction stress.【Conclusion】The soil compaction stress significantly affected rhizosphere microbial composition, then changed soil enzyme activity and mineral nutrient content in apple rhizosphere. Rhizosphere bacteria and FDA hydrolase activity were different with rootstock, and highly inhibited by soil compaction stress in Red Fuji. Under soil compaction stress, the content of rhizosphere available potassium and alkali-hydrolyzed nitrogen, and the activity of rhizosphere FDA hydrolase were more closely related to the abundance of rhizosphere and root endosphere bacteria.

soil compaction; apple rootstock; rhizosphere; soil enzymes; root endosphere bacteria

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.13.010

2022-09-08；

2023-02-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（32172517）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFD1000103）

李佳琦，E-mail：907383250@qq.com。通信作者楊洪強(qiáng)，Tel：0538-8249304；E-mail：hqyang@sdau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）