李允靜，肖芳，武玉花，李俊，高鴻飛，翟杉杉，梁晉剛，吳剛

抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR檢測方法的建立及其標(biāo)準(zhǔn)化

李允靜1，肖芳1，武玉花1，李俊1，高鴻飛1，翟杉杉1，梁晉剛2，吳剛

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（武漢）/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物溯源重點實驗室，武漢 430062；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176

【目的】抗逆大豆IND-??41?-5已獲得中國進口加工原料安全證書，建立一種特異、準(zhǔn)確、靈敏的抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR（qPCR）檢測方法，為抗逆大豆IND-??41?-5在中國的安全監(jiān)管提供精準(zhǔn)測量技術(shù)?！痉椒ā渴紫壤肂eacon designer 8.0軟件對抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體5′端旁側(cè)序列設(shè)計18對引物探針，結(jié)合1對羅薩里奧農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)院公司提供的引物探針，隨后采用qPCR技術(shù)對引物探針進行特異性篩選，遴選出1對候選引物探針；設(shè)置實時熒光定量PCR的引物/探針濃度梯度，優(yōu)化qPCR方法的反應(yīng)體系；設(shè)置不同類型的特異性測試樣品測試方法的特異性；以純合抗逆大豆IND-??41?-5基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，梯度稀釋成標(biāo)準(zhǔn)溶液模板，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察qPCR方法的線性動態(tài)范圍，配置拷貝數(shù)比值為5%、1%和0.1%的測試樣品，評價定量方法的準(zhǔn)確性；配置拷貝數(shù)比值為0.05%和0.025%的樣品，測試方法的檢出限；拷貝數(shù)比值為0.1%的樣品經(jīng)16次定量測試，確定方法的定量限；最終確定抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR檢測方法的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)。8家有資質(zhì)單位對該定量PCR方法的特異性、檢出限、定量限、準(zhǔn)確性等進行驗證，采用柯克倫法和格拉布斯法評估qPCR方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性，利用線性最小二乘法對準(zhǔn)確性樣品測試結(jié)果的測量不確定度進行預(yù)評定?！窘Y(jié)果】通過特異性篩查確定RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1引物探針為候選組合，建立了抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性qPCR方法，擴增片段為138 bp，優(yōu)化的反應(yīng)體系引物終濃度為0.4 μmol·L-1、探針終濃度為0.2 μmol·L-1；IND-??41?-5和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性動力學(xué)范圍為33—83 190 copies的基因組DNA，該方法可準(zhǔn)確定量5%、1%和0.1%含量的IND-??41?-5測試樣品，偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于25%；確定檢出限為0.05%、定量限為0.1%。8家實驗室間聯(lián)合驗證該方法穩(wěn)定性好、特異性強，檢出限為0.05%，定量限為0.1%，且具備良好的實驗室間重復(fù)性和再現(xiàn)性，經(jīng)測量不確定度預(yù)評定后，獲得5份抗逆大豆IND-??41?-5測試樣品的測量結(jié)果分別為（0.10±0.02）%、（0.53±0.09）%、（1.05±0.18）%、（2.05±0.34）%和（5.18±0.87）%，結(jié)果準(zhǔn)確可靠?！窘Y(jié)論】成功建立了抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR檢測方法，能夠?qū)崿F(xiàn)抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體成分的精準(zhǔn)定量檢測。

轉(zhuǎn)基因；抗逆大豆IND-??41?-5；轉(zhuǎn)化體特異性；實時熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織統(tǒng)計，在世界范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積最大，2019年種植面積達9 190萬hm2，占全球轉(zhuǎn)基因種植面積的48%。在世界范圍內(nèi)，31個國家/地區(qū)批準(zhǔn)了38個轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體，用于種植或進口加工[1]。近年來，中國轉(zhuǎn)基因大豆進口量維持在8 000萬t以上[2]。截至2022年3月，中國已審批進口用作加工原料安全證書轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體20個[3]。隨著中國需求的不斷增長和人們食品消費結(jié)構(gòu)的持續(xù)升級，中國對轉(zhuǎn)基因大豆的需求量必定會不斷增加。同時，轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速發(fā)展及其應(yīng)用，使得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性備受社會各界關(guān)注。各個國家根據(jù)自身國情制定了不同的管理政策和措施，如加拿大采取自愿標(biāo)識管理政策，歐盟、韓國、日本等國家分別設(shè)置0.9%、3%和5%的標(biāo)識閾值進行管理[4]。目前，中國規(guī)定對列入目錄的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花、番茄等5類17種產(chǎn)品實施定性強制標(biāo)識[5]。隨著中國生物技術(shù)的不斷發(fā)展進步，為了更好地保護消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)，與國際接軌，轉(zhuǎn)基因生物定量標(biāo)識管理是未來發(fā)展的必然趨勢。然而，建立特異、準(zhǔn)確、靈敏、標(biāo)準(zhǔn)化的定量檢測方法，是定量標(biāo)識管理制度順利實施和轉(zhuǎn)基因生物有效監(jiān)管的重要技術(shù)保障?！厩叭搜芯窟M展】目前，基于DNA水平的轉(zhuǎn)基因成分檢測是最主要、應(yīng)用最廣泛的方法[6]，除了傳統(tǒng)的定性PCR和實時熒光定量PCR檢測技術(shù)[7-11]之外，高通量測序技術(shù)[12-13]、數(shù)字PCR技術(shù)[14-15]、恒溫擴增技術(shù)[16-17]、生物傳感器檢測技術(shù)[18]也得到了應(yīng)用和發(fā)展。然而，實時熒光定量PCR方法通常被認為是核酸定量檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[19]。依據(jù)PCR的特異性可將轉(zhuǎn)基因檢測分為元件篩查檢測、基因特異性檢測、構(gòu)建特異性檢測和轉(zhuǎn)化體特異性檢測等四類方法[20]。其中，轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法具有高度專一性和唯一性，已成為國際上轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)化方法的首選，能夠滿足各個國家對轉(zhuǎn)基因品種轉(zhuǎn)化體監(jiān)管的需求。【本研究切入點】抗逆大豆IND-??41?-5是羅薩里奧農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)院公司研發(fā)的轉(zhuǎn)的抗逆大豆轉(zhuǎn)化體，于2022年獲得中國進口用作加工原料的安全證書，但中國還尚未建立針對該轉(zhuǎn)化體特異性的定量檢測方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以抗逆大豆IND-??41?-5的5′端轉(zhuǎn)化體特異性序列為靶標(biāo)，通過引物探針篩選、特異性測試、準(zhǔn)確性測試、檢測限和定量限等試驗，結(jié)合現(xiàn)有大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因[21]實時熒光定量PCR方法，建立抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR檢測方法，通過多家實驗室針對該方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和再現(xiàn)性等各項參數(shù)進行聯(lián)合驗證，為抗逆大豆IND-??41?-5在國內(nèi)安全檢測監(jiān)測提供技術(shù)支撐，為其定量標(biāo)識管理和有效安全監(jiān)管提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

抗逆大豆（）IND-??41?-5、非轉(zhuǎn)基因大豆受體以及以相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因作物填充的轉(zhuǎn)化體含量為1%的轉(zhuǎn)基因作物混合粉末（表1），由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心提供；非轉(zhuǎn)基因大豆混合樣品（天隆1號、Williams 82、華春3號）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所實驗室保存并配置，抗逆大豆IND-??41?-5及其非轉(zhuǎn)基因大豆受體在溫室種植，取其幼苗葉片用于提取基因組DNA。試驗于2021年至2022年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所實驗室進行并完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

表1 試驗材料信息

1.2 大量DNA的提取與純化

參考高質(zhì)量水稻葉片DNA抽提方法[22]，稍作改良，最終將獲取的DNA溶于800 μL TE溶液中。采用紫外分光光度計NanoDrop OneC（美國，Thermo Fisher）測定DNA濃度并評價其質(zhì)量，儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小量DNA提取及純化

采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（康為，CW0531M）提取和純化少量葉片或種子粉末DNA，具體操作步驟見說明書。經(jīng)紫外分光光度計NanoDrop OneC（美國，Thermo Fisher）測定DNA濃度并評價其質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 材料純合度鑒定

微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含2×ddPCR Master Mix（美國伯樂，1863010）10 μL、10 μmol·L-1上下游引物溶液各0.8 μL、10 μmol·L-1探針溶液0.4 μL、20 ng·μL-1DNA模板1 μL。將20 μL PCR反應(yīng)體系和70 μL微滴生成油依次加入微滴生成卡，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀，生成微滴。PCR擴增程序為95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 60 s，40個循環(huán)；98 ℃ 10 min，4 ℃保存。擴增結(jié)束后，將96孔板置入微滴讀取儀中進行信號讀取，采用QuantaSoft V1.3.2.0軟件分析試驗數(shù)據(jù)，獲得絕對定量結(jié)果。

1.5 引物探針設(shè)計

采用Beacon designer 8.0軟件，針對抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體5′端（RB端）旁側(cè)序列設(shè)計6條正向引物、3條反向引物和2條探針[23]，將設(shè)計的正向引物和反向引物兩兩配對（電子附表1）；結(jié)合羅薩里奧農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)院公司提供的一對引物探針（RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1）共有19對引物探針組合，大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)崟r熒光PCR檢測引物探針直接采用國家標(biāo)準(zhǔn)[21]（表2）。所有引物探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，離心后用雙蒸水稀釋至10 μmol·L-1，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR引物探針

1.6 反應(yīng)體系及程序

25 μL實時熒光定量PCR方法反應(yīng)體系包括2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）混合液12.5μL（Takara，RR390A）、10 μmol·L-1上下游引物溶液各1.0 μL、10 μmol·L-1探針溶液0.5 μL、DNA模板2.0 μL，雙蒸水補齊25 μL。反應(yīng)程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)數(shù)≥40；在第二階段的退火延伸（60 ℃）時段收集熒光信號。

1.7 反應(yīng)體系優(yōu)化

分別設(shè)置不同梯度引物/探針濃度（0.9 μmol·L-1/ 0.25 μmol·L-1、0.8 μmol·L-1/0.40 μmol·L-1、0.6 μmol·L-1/ 0.30 μmol·L-1、0.4 μmol·L-1/0.20 μmol·L-1、0.2 μmol·L-1/ 0.10 μmol·L-1），配置好反應(yīng)體系后，按照1.6的反應(yīng)程序進行實時熒光定量PCR擴增。

1.8 特異性測試

設(shè)置拷貝數(shù)比值為1%的抗逆大豆IND-??41?-5為陽性對照、非轉(zhuǎn)基因受體大豆為陰性對照、雙蒸水為空白對照，將其他轉(zhuǎn)基因大豆混樣、轉(zhuǎn)基因玉米混樣、轉(zhuǎn)基因水稻混樣、轉(zhuǎn)基因油菜混樣、轉(zhuǎn)基因棉花混樣作為測試樣品，對實時熒光定量PCR方法特異性進行測試。

1.9 正確度和精密度測試

將鑒定為純合抗逆大豆IND-??41?-5葉片基因組DNA初始濃度稀釋至50 ng·μL-1，分別設(shè)置100、10、1、0.2和0.04 ng 5個點的標(biāo)準(zhǔn)溶液，試驗設(shè)3個平行，重復(fù)3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線模板的擴增Ct值和初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)間的線性關(guān)系，分別繪制大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線[24]。將純合抗逆大豆IND-??41?-5基因組DNA同受體非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻凑湛截悢?shù)比值分別為M1（5%）、M2（1%）和M3（0.1%）配置測試樣品，進行正確度和精密度測試，試驗設(shè)3個平行，重復(fù)3次。利用實時熒光定量PCR的Ct值以及繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體的拷貝數(shù)，按照公式1計算樣品中轉(zhuǎn)基因成分含量（，%）。

1.10 檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）測定

設(shè)置非轉(zhuǎn)基因受體大豆為陰性對照、雙蒸水為空白對照，將抗逆大豆IND-??41?-5基因組DNA及其非轉(zhuǎn)基因受體基因組DNA分別進行梯度稀釋，制備拷貝數(shù)比值為0.05%和0.025%樣品，分別進行60次測試，PCR反應(yīng)體系中加入50 ng DNA模板，相當(dāng)于分別含有20拷貝和10拷貝的IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性序列，檢測抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR方法的檢出限[23, 25-26]。同時，配置拷貝數(shù)比值為0.1%的樣品，進行16次定量測試，檢測IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR方法定量限[23, 25-26]。

1.11 方法的實驗室間驗證

邀請8家有資質(zhì)的單位對定量檢測方法的以下參數(shù)進行實驗室間驗證[23]：（1）特異性和檢出限驗證：特異性測試樣品設(shè)置見1.8，檢出限測試樣品為拷貝數(shù)比值0.05%的抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體基因組DNA，擴增設(shè)置6個平行。（3）準(zhǔn)確性驗證：測試樣品為拷貝數(shù)比值5%（S1）、2%（S2）、1%（S3）、0.5%（S4）、0.1%（S5）的抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體基因組DNA。將純合IND-??41?-5基因組DNA梯度稀釋獲得G1、G2、G3、G4和G5等5個點的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中G1樣品的拷貝數(shù)含量高于S1，G5樣品的拷貝數(shù)含量低于S5，每個樣品擴增設(shè)置3個平行，重復(fù)3次試驗。（4）定量限驗證：測試樣品為拷貝數(shù)比值0.1%的抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體基因組DNA，擴增設(shè)置3個平行，重復(fù)3次試驗。

1.12 測量不確定度預(yù)評定

2 結(jié)果

2.1 引物探針篩選與確定

針對19對實時熒光定量PCR方法引物探針組合，以拷貝數(shù)比值為1%的抗逆大豆IND-??41?-5基因組DNA為模板，采用推薦的實時熒光定量PCR擴增體系和反應(yīng)程序進行特異性初篩（圖1）。綜合考慮擴增結(jié)果的信號強度、Ct值和PCR引物探針位置等因素，遴選引物探針組合12（RB-QF4/RB-QR3/RB-QP1）和19（RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1）作為候選引物探針，并對這兩對引物探針組合做進一步比較。

圖1 IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR引物探針的篩選

將2對候選引物探針12和19分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴增模板DNA為50、10、2、0.4、0.08和0.016 ng。結(jié)果顯示，12引物探針組合的擴增效率為87.8%，且斜率為-3.655；而19引物探針組合的擴增效率為92.5%，且斜率為-3.517，19引物探針組織的擴增效率為90%—110%，斜率為-3.6—-3.1（圖2），滿足標(biāo)準(zhǔn)要求[23, 25-26]，而12引物探針組合的擴增效率不能滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。最終確定19為最終候選引物探針組合，并對其進行引物探針濃度優(yōu)化和特異性測試。

2.2 引物和探針濃度的確定

設(shè)置不同的引物探針濃度組合，優(yōu)化最佳反應(yīng)體系（表3）。根據(jù)平臺期的信號強度及擴增效率、穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)雖然0.8 μmol·L-1引物和0.40 μmol·L-1探針濃度組合的信號最高，但是Ct值差異很小（表3和圖3）。為了和國家標(biāo)準(zhǔn)中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)崟r熒光PCR方法的反應(yīng)體系保持一致，調(diào)整反應(yīng)體系引物濃度0.4 μmol·L-1和探針濃度0.20 μmol·L-1，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，擴增模板DNA為100、10、1、0.2和0.04 ng，發(fā)現(xiàn)2組數(shù)據(jù)Ct值差異極小，且擴增效率均為90%—110%，線性決定系數(shù)均大于0.98，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求（圖4）。因此，確定IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR檢測體系中的引物濃度為0.4 μmol·L-1，探針濃度為0.20 μmol·L-1。

A：12引物探針擴增曲線圖；a：對應(yīng)圖A的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：19引物探針擴增曲線圖；b：對應(yīng)圖B的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1：空白對照；2：引物濃度0.2 μmol·L-1，探針濃度0.10 μmol·L-1；3：引物濃度0.4 μmol·L-1，探針濃度0.20 μmol·L-1；4：引物濃度0.9 μmol·L-1，探針濃度0.25 μmol·L-1；5：引物濃度0.6 μmol·L-1，探針濃度0.30 μmol·L-1；6：引物濃度0.8 μmol·L-1，探針濃度0.40 μmol·L-1

2.3 特異性測試

經(jīng)特異性測試，發(fā)現(xiàn)19引物探針僅從1%含量IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體中獲得預(yù)期特異性典型擴增曲線，而在其他轉(zhuǎn)基因大豆混樣、轉(zhuǎn)基因玉米混樣、轉(zhuǎn)基因水稻混樣、轉(zhuǎn)基因油菜混樣、轉(zhuǎn)基因棉花混樣中均未獲得典型擴增曲線（圖5）。因此，選擇19引物探針組合作為IND-??41?-5檢測實時熒光PCR方法的候選引物，并將該引物探針組合命名為IND-??41?-5/qF/IND-??41?-5/qR/IND-??41?-5qP，片段大小為138 bp，測序驗證結(jié)果與羅薩里奧農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)院公司提供的分子特征信息一致。

2.4 材料純合度鑒定

采用單株抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體基因組DNA，利用微滴數(shù)字PCR平臺分別檢測大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體的拷貝數(shù)（表4）。單重微滴PCR檢測結(jié)果顯示，抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體與大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的百分比為97.17%—103.47%，平均值為99.26%，表明所選抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體單株均為純合體。

表3 抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

A：0.8/0.40 μmol·L-1引物探針組合擴增曲線圖；a：對應(yīng)圖A的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：0.4/0.20 μmol·L-1引物探針組合擴增曲線圖；b：對應(yīng)圖B的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用大豆單倍體基因組大小為1 115 Mb[28]，配置5個點的標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)的拷貝數(shù)分別為83 190、8 319、831、166和33，針對抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因進行實時熒光定量PCR擴增，分別繪制IND-??41?-5和的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6）。結(jié)果顯示，3次重復(fù)試驗中，IND-??41?-5和標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)2均大于0.98、擴增效率E為90%—110%、斜率為-3.6—-3.1，均滿足標(biāo)準(zhǔn)要求的范圍，表明抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測體系的Ct值與模板拷貝數(shù)的對數(shù)間均具有良好的線性關(guān)系。

1：空白對照、陰性對照、其他轉(zhuǎn)基因大豆混樣、轉(zhuǎn)基因玉米混樣、轉(zhuǎn)基因水稻混樣、轉(zhuǎn)基因油菜混樣、轉(zhuǎn)基因棉花混樣；2：1%抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體

表4 單株基因型鑒定結(jié)果

2.6 正確度和精密度測試

抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR正確度和精密度測試結(jié)果顯示，M1（5%）、M2（1%）和M3（0.1%）等3個測試樣品的抗逆大豆IND-??41?-5測定含量的偏差（Bias）均小于25%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于25%（表5），表明抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR檢測方法的正確度與精密度均符合標(biāo)準(zhǔn)要求[23, 25]，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性良好。

A、B、C：IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體標(biāo)準(zhǔn)曲線的3次重復(fù)；a、b、c：Lectin標(biāo)準(zhǔn)曲線的3次重復(fù)

2.7 檢出限（LOD）和定量限（LOQ）的確定

檢出限測試結(jié)果顯示，0.05%抗逆大豆IND-??41?-5的60次PCR測試均有典型擴增曲線（圖7-a）；0.025%的抗逆大豆IND-??41?-5的60次PCR測試均有擴增信號，但Ct值相對較大（圖7-b）。因此，綜合考慮實驗室內(nèi)部測定結(jié)果以及實際檢測中的適用性，抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR方法檢出限不高于0.05%，反應(yīng)體系加入50 ng DNA模板，相當(dāng)于20個拷貝。

表5 正確度和精密度測試

a：0.05%抗逆大豆IND-??41?-5的擴增結(jié)果；b：0.025%抗逆大豆IND-??41?-5的擴增結(jié)果

定量限測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16次測定0.1%樣品的平均偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為14.51%和8.59%，均小于25%（表6）。因此，抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光PCR方法的定量限確定為0.1%，反應(yīng)體系加入50 ng DNA模板，相當(dāng)于40個拷貝。

2.8 方法的實驗室間驗證

2.8.1 特異性及檢出限驗證 8家實驗室針對實時熒光定量PCR方法進行特異性測試，結(jié)果顯示，1%的抗逆大豆IND-??41?-5樣品中均有典型擴增曲線，在其他轉(zhuǎn)基因大豆混樣、轉(zhuǎn)基因玉米混樣、轉(zhuǎn)基因水稻混樣、轉(zhuǎn)基因油菜混樣、轉(zhuǎn)基因棉花混樣中均無典型擴增曲線（表7），表明抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR方法的特異性良好。

8家實驗室對0.05%的抗逆大豆IND-??41?-5樣品進行檢出限測試，發(fā)現(xiàn)均有典型擴增曲線，且Ct值小于36，與實驗室內(nèi)部測試結(jié)果一致（表7和表8）。表明抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR方法檢出限不高于0.05%（20拷貝）。

表6 定量限測試

表7 特異性和檢出限驗證結(jié)果

P：陽性結(jié)果；N：陰性結(jié)果 P: positive results; N: negative results

表8 8家實驗室檢測限擴增Ct值

2.8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性及擴增效率 針對大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體進行實時熒光定量PCR擴增，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（表9）。發(fā)現(xiàn)大豆內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴增效率為91.10%—109.60%，斜率平均值為-3.355、擴增效率平均值98.85%、決定系數(shù)2平均值為0.996；抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴增效率為90.80%—104.60%，斜率平均值為-3.403、擴增效率平均值96.89%、決定系數(shù)2平均值為0.998，均符合標(biāo)準(zhǔn)要求[23, 25-26]。

2.8.3 準(zhǔn)確性驗證 采用科克倫法和格拉布斯法對5份準(zhǔn)確性測試樣品結(jié)果進行異常值檢驗[29]，當(dāng)實驗室數(shù)量p=8，試驗重復(fù)n=3時，分別計算測試樣品的值和G值，在置信區(qū)間1%和5%的臨界值下，發(fā)現(xiàn)Lab6實驗室1%含量的樣品中出現(xiàn)了一個科克倫法檢驗的離群值（表10）。剔除異常值后，5份測試樣品中抗逆大豆IND-??41?-5含量測量平均值稍偏離真值，5%樣品的偏差為-10.83%—11.38%，2%樣品的偏差為-4.19%—14.12%，1%樣品的偏差為-5.42%— 13.76%，0.5%樣品的偏差為-8.92%—13.29%，0.1%樣品的偏差為-4.61%—23.05%，5個樣品偏差平均值為2.64%—5.06%，測量值的偏差均小于25%（圖8）。結(jié)果表明，抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR方法在實驗室間具備良好的準(zhǔn)確性。

圖8 轉(zhuǎn)基因含量的測量值與真值間的相對偏差

表9 8家實驗室標(biāo)準(zhǔn)曲線驗證結(jié)果

2.8.4 重復(fù)性與再現(xiàn)性 根據(jù)5份測試樣品準(zhǔn)確性測試結(jié)果，統(tǒng)計分析8家實驗室內(nèi)重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDr）和實驗室間再現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDR）（表11），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5份測試樣品的RSDr值分別為4.61%、6.18%、3.66%、5.59%和7.75%，均小于25%；RSDR值分別為8.34%、8.61%、6.60%、8.86%和11.58%，均小于35%，正確度和精密度符合標(biāo)準(zhǔn)要求[23, 29]。結(jié)果表明抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR方法具備良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。

2.8.5 定量限驗證 8家實驗室對拷貝數(shù)比值為0.1%的抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體定量限測試，結(jié)果顯示，8家實驗室的測試結(jié)果平均值為0.10%，實驗室內(nèi)重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr為1.69%—16.82，均小于25%，實驗室間再現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDR為8.61%，小于35%（表12）。表明抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR方法的定量限不高于0.1%（40拷貝），與實驗室內(nèi)部測試結(jié)果相符。

表10 測試樣品的百分含量

*：科克倫檢驗的離群值 *: Outlier from Cochran's test

2.8.6 測量不確定度預(yù)評定 采用線性最小二乘法對抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR方法測量不確定度進行預(yù)評定[23, 27]，以8家測量5份測試樣品結(jié)果的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差（SR）為縱坐標(biāo)與5份測試樣品結(jié)果的平均值（）為橫坐標(biāo)繪制回歸曲線（圖9），標(biāo)準(zhǔn)不確定度0為0.0019，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0838。測量標(biāo)準(zhǔn)不確定度，擴展不確定度為=2×，5個測試盲樣的測試平均值分別是0.10%、0.53%、1.05%、2.05%和5.18%（w/w），計算出的擴展不確定度分別是0.02%、0.09%、0.18%、0.34%和0.87%（w/w）。因此，5個測試樣品的測定含量分別表示為（0.10±0.02）%、（0.53±0.09）%、（1.05±0.18）%、（2.05±0.34）%和（5.18±0.87）%，5份樣品測量結(jié)果的擴展不確定度均在聯(lián)合測量平均值的20%以內(nèi)。結(jié)果表明，測量數(shù)據(jù)分散性小，接近真值，建立的抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR方法測量結(jié)果精準(zhǔn)可靠，可實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用。

表11 驗證結(jié)果匯總

表12 8家實驗室LOQ測量值結(jié)果匯總

3 討論

3.1 定量檢測方法的建立

本研究針對抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性序列的5′端設(shè)計了18對引物探針組合，結(jié)合羅薩里奧農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)院公司提供的1對引物探針，經(jīng)特異性篩選、反應(yīng)體系優(yōu)化與比較，最終確定了研發(fā)者提供19號引物探針組合為最優(yōu)抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR檢測方法。本方法優(yōu)化后PCR反應(yīng)體系與國家標(biāo)準(zhǔn)大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的體系一致，與羅薩里奧農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)院公司的方法相比成本低，適用性強，更易于標(biāo)準(zhǔn)化和推廣應(yīng)用。本研究測定實時熒光定量PCR方法的檢出限為0.05%，約為20個拷貝的抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體序列，與該公司結(jié)果相當(dāng)；測定的定量限為0.1%，反應(yīng)體系中50 ng的DNA模板，相當(dāng)于40個拷貝的抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體序列，而羅薩里奧農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)院公司測定的定量限為0.058%，但反應(yīng)體系中100 ng的DNA模板，相當(dāng)于50個拷貝，表明本研究抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR方法能夠測定更低的轉(zhuǎn)基因成分含量。轉(zhuǎn)基因檢測實時熒光定量PCR方法的檢出限應(yīng)不高于目標(biāo)濃度的1/20，定量限應(yīng)不高于目標(biāo)濃度的1/10[23,26]，由于中國法律法規(guī)尚未規(guī)定轉(zhuǎn)基因的標(biāo)識閾值，本研究參考歐盟管理閾值0.9%，將目標(biāo)濃度設(shè)定為1%，本方法確定的檢出限0.05%和定量限0.1%，能滿足國際上定量檢測需求。在準(zhǔn)確性測試中，直接采用未經(jīng)定值的純合抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，雖然科學(xué)性有待加強[30-31]，但是在沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下，能夠準(zhǔn)確地測定樣品的轉(zhuǎn)基因含量，甚至含量低至0.1%的樣品。本研究成功建立了抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR方法。

圖9 再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差（SR）與測試樣品平均值（）間的回歸曲線

3.2 方法的實驗室間驗證

本研究組織了8家業(yè)內(nèi)有資質(zhì)的實驗室對本方法進行實驗室間聯(lián)合驗證，本方法特異性好、穩(wěn)定性強，檢出限為0.05%，定量限為0.1%。采用科克倫法和格拉布斯法對5份準(zhǔn)確性測試樣品測定結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析[29, 32]，每份測試樣品的偏差均小于25%，表明本方法的準(zhǔn)確性和精密度良好；實驗室內(nèi)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDr）小于25%，實驗室間再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDR）小于35%，充分證明重復(fù)性和再現(xiàn)性表現(xiàn)良好。然而，技術(shù)資料顯示，羅薩里奧農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)院公司僅提供了3家實驗室驗證數(shù)據(jù)，尚不能達到實時熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)化的要求。本研究建立的抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR方法經(jīng)多家實驗室聯(lián)合驗證后，能夠?qū)崿F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用。

3.3 測量不確定度預(yù)評定

測量不確定度是衡量檢測結(jié)果質(zhì)量的重要指標(biāo)，能表示檢測數(shù)據(jù)的分散范圍[33]。在轉(zhuǎn)基因生物安全管理實施定量標(biāo)識的國家，測量不確定度對準(zhǔn)確表示定量檢測結(jié)果具有重要意義，尤其當(dāng)檢測結(jié)果接近標(biāo)識閾值的時候，是否對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行標(biāo)識依賴于不確定度提供的測量結(jié)果的置信區(qū)間[34]。近年來，測量不確定度評定被越來越多地引入轉(zhuǎn)基因定量檢測工作中[27,33-36]，但是由于中國還沒有采用定量標(biāo)識管理，在轉(zhuǎn)基因檢測行業(yè)內(nèi)尚未得到廣泛應(yīng)用。本研究利用8家實驗室對拷貝數(shù)比值為0.1%、0.5%、1%、2%和5%的5份樣品的聯(lián)合測試結(jié)果的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差，采用線性最小二乘法對測量不確定度進行預(yù)評定。根據(jù)測量不確定度評定結(jié)果，樣品中抗逆大豆IND-??41?-5的含量分別表示為（0.10±0.02）%、（0.53±0.09）%、（1.05±0.18）%、（2.05±0.34）%和（5.18±0.87）%；該結(jié)果與2013年6家實驗室驗證轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1實時熒光定量PCR檢測方法獲得的不確定度相比[26]，抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR方法獲得的不確定度明顯要小得多，一方面表明本研究聯(lián)合驗證結(jié)果具有良好的一致性和準(zhǔn)確性，另一方面表明中國轉(zhuǎn)基因檢測實驗室的轉(zhuǎn)基因定量檢測能力有很大的提升。隨著實時熒光定量PCR檢測方法在轉(zhuǎn)基因檢測行業(yè)不斷應(yīng)用，中國轉(zhuǎn)基因檢測機構(gòu)定量檢測水平大幅度提高，定量檢測技術(shù)、人員、設(shè)施儲備充足，能夠為中國轉(zhuǎn)基因定量標(biāo)識管理提供更有力技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

成功建立了抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體實時熒光定量PCR檢測方法，該方法的特異性強和穩(wěn)定性好，且能精準(zhǔn)地定量拷貝數(shù)比值為5%、2%、1%、0.5%和0.1%的抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體成分，檢出限為0.05%，定量限為0.1%，并具備良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，能夠?qū)崿F(xiàn)抗逆大豆IND-??41?-5轉(zhuǎn)化體成分定量檢測。

致謝：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心為本研究提供試驗材料，并組織了方法的實驗室間驗證。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物及植物用微生物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（廣州）（Lab1）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及加工品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心（杭州）（Lab2）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（合肥）（Lab3）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物及產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗測試中心（哈爾濱）（Lab4）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（長春）（Lab5）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（哈爾濱）（Lab6）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（天津）（Lab7）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（太原）（Lab8）參加了本方法的實驗室間驗證，特此致謝！

[1] 國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織. 2019年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢. 中國生物工程雜志, 2021, 41(1): 114-119.

International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications. Global commercialization of biotechnology/transgenic crops in 2019. China Biotechnology, 2021, 41(1): 114-119. (in Chinese)

[2] 陳佳俊, 高維新. 我國大豆進口沖擊下的大豆產(chǎn)業(yè)優(yōu)化發(fā)展路徑. 市場周刊, 2022, 35(1): 85-89.

CHEN J J, GAO W X. Optimal development path of soybean industry under the impact of soybean import in China. Market Weekly, 2022, 35(1): 85-89. (in Chinese)

[3] LIANG J G, YANG X W, JIAO Y, WANG D X, ZHAO Q, SUN Y, LI Y H, WU K M. The evolution of China’s regulation of agricultural biotechnology. aBIOTECH, 2022, 3(4): 237-249.

[4] 黃耀輝, 樊殿峰, 焦悅, 吳小智, 葉紀(jì)明. 淺談多國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度對我國的啟示. 生物技術(shù)進展, 2022, 12(4): 516-522.

HUANG Y H, FAN D F, JIAO Y, WU X Z, YE J M. Enlightenment of GMO labeling system in other countries to China. Current Biotechnology, 2022, 12(4): 516-522. (in Chinese)

[5] 徐琳杰, 劉培磊, 李文龍, 孫卓婧, 宋貴文. 國際轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度變動趨勢分析及對我國的啟示. 中國生物工程雜志, 2018, 38(9): 94-98.

XU L J, LIU P L, LI W L, SUN Z J, SONG G W. Analysis of the recent trends of international labeling policies for genetically modified products and the enlightenment to China’s labeling management. China Biotechnology, 2018, 38(9): 94-98. (in Chinese)

[6] RANDHAWA G, SINGH M, SOOD P. DNA-based methods for detection of genetically modified events in food and supply chain. Current Science, 2016, 110(6): 1000.

[7] WU G, Wu Y H, XIAO L, LU C M. Event-specific qualitative and quantitative PCR methods for the detection of genetically modified rapeseed Oxy-235. Transgenic Research, 2008, 17(5): 851-862.

[8] WU G, WU Y H, NIE S J, ZHANG L, XIAO L, CAO Y L, LU C M. Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1. Food Chemistry, 2010, 119(1): 417-422.

[9] WU Y H, WANG Y L, LI J, LI W, ZHANG L, LI Y J, LI X F, LI J, ZHU L, WU G. Development of a general method for detection and quantification of the P35S promoter based on assessment of existing methods. Scientific Reports, 2014, 4: 7358.

[10] LONG L K, YAN W, LI C C, DONG L M, LIU N, XING Z J, LI F W. Event-specific quantitative polymerase chain reaction methods for detection of double-herbicide-resistant genetically modified corn MON 87419 based on the 3’-junction of the insertion site. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2021, 85(6): 1468-1475.

[11] LI Y J, XIAO F, ZHAI C, LI X F, WU Y H, GAO H F, LI J, ZHAI S S, LIU B, WU G. Qualitative and quantitative real-time PCR methods for assessing false-positive rates in genetically modified organisms based on the microbial-infection-linkedgene. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(17): 10000.

[12] YANG L T, WANG, C M, HOLST-JENSEN A, MORISSET D, LIN Y J, ZHANG D B. Characterization of GM events by insert knowledge adapted re-sequencing approaches. Scientific Reports, 2013, 3: 2839.

[13] LI Y J, LI J, WU Y H, CAO Y L, LI J, ZHU L, LI X F, HUANG S M, WU G. Successful detection of foreign inserts in transgenic rice TT51-1 (BT63) by RNA-sequencing combined with PCR. Journal of the Science of food and Agriculture, 2017, 97(5): 1634-1639.

[14] LI X F, WU Y H, LI J, LI Y J, LONG L K, LI F W, WU G. Development and validation of a 48-target analytical method for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Scientific Reports, 2015, 5: 7616.

[15] DEMEKE T, LEE S J, ENG M. Increasing the efficiency of canola and soybean GMO detection and quantification using multiplex droplet digital PCR. Biology, 2022, 11(2): 201.

[16] XU J Y, ZHENG Q Y, YU L, LIU R, ZHAO X, WANG G, WANG Q H, CAO J J. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of genetically modified maize T25. Food Science & Nutrition, 2013, 1(6): 432-438.

[17] TAKABATAKE R, KAGIYA Y, MINEGISHI Y, FUTO S, SOGA K, NAKAMURA K, KONDO K, MANO J, KITTA K. Rapid screening detection of genetically modified crops by loop-mediated isothermal amplification with a lateral flow dipstick. Journal of agricultural and food chemistry, 2018, 66(29): 7839-7845.

[18] SáNCHEZ-PANIAGUA LóPEZ M, MANZANARES-PALENZUELA C L, LóPEZ-RUIZB. Biosensors for GMO testing: Nearly 25 years of research. Critical reviews in analytical chemistry, 2018, 48(5): 391-405.

[19] BROEDERSA S, HUBERB I, GROHMANNC L, BERBEND G, TAVERNIERSE I, MAZZARAF M, ROOSENSA N, MORISSETG D. Guidelines for validation of qualitative real-time PCR methods. Trends in Food Science & Technology, 2014, 37(2): 115-126.

[20] HOLST-JENSEN A, BERTHEAU Y, DE LOOSE M, GROHMANN L, HAMELS S, HOUGS L, MORISSET D, PECORARO S, PLA M, VAN DEN BULCKE M, WULFF D. Detecting un-authorized genetically modified organisms (GMOs) and derived materials. Biotechnology Advances, 2012, 30(6): 1318-1335.

[21] 農(nóng)業(yè)部2031號公告—8—2013, 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2013.

Announcement by the Ministry of Agriculture No.2031-8-2013. Detection of genetically modified plants and derives products target-taxon specific qualitative PCR method for soybean. Beijing: China Agriculture Press, 2013. (in Chinese)

[22] 吳昊, 陳太鈺, 林擁軍, 陳浩. 水稻葉片高質(zhì)量DNA抽提. Bio-Protoc, 2018, 101, e1010102. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010102.

Wu H, Chen T Y, Lin Y J, Chen H. High-quality DNA extraction from rice leaves. Bio-Protoc, 2018, 101, e1010102. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010102. (in Chinese)

[23] 農(nóng)業(yè)部2259號公告—5—2015, 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測實時熒光定量PCR方法制定指南. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2015.

Announcement by the Ministry of Agriculture No.2259-5-2015. Detection of genetically modified plants and derives products technical guidelines for development of real-time quantitative PCR methods. Beijing: China Agriculture Press, 2015. (in Chinese)

[24] 農(nóng)業(yè)部2122號公告-8-2014, 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲水稻TT51-1及其衍生品種定量PCR方法. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2014.

Announcement by the Ministry of Agriculture No.2122-8-2014. Detection of genetically modified plants and derives products quantitative PCR method for insect-resistant rice TT51-1 and its derivates. Beijing: China Agriculture Press, 2014. (in Chinese)

[25] Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry, 2009, 55(4): 611-622.

[26] MARCO M, CRISTIAN S, CHRYSTELE C D, HERMANN B, ANDREW D, CLAUDIA P, DEN EEDE GUY V. Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing. European Network of GMO Laboratories, 2015.

[27] WU Y H, YANG L T, CAO Y L, SONG G W, SHEN P, ZHANG D B, WU G. Collaborative validation of an event-specific quantitative real-time PCR method for genetically modified rice event TT51?1 detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(25): 5953-5960.

[28] 段武德. 轉(zhuǎn)基因植物檢測. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2008.

DUAN W D. Detection of genetically modified plants. Beijing: China Agriculture Press, 2008. (in Chinese)

[29] GB/T 6379. 2-2004, 測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2部分: 確定標(biāo)準(zhǔn)測量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2004.

GB/T 6379. 2-2004. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results-Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. Beijing: China standard press, 2004. (in Chinese)

[30] LI J, ZHANG L, LI L, LI X Y, ZHANG X J, ZHAI S S, GAO H F, LI Y J, WU G, WU Y H. Development of genomic DNA certified reference materials for genetically modified rice Kefeng 6. ACS Omega, 2020, 5(34): 21602-21609.

[31] 安娜, 柳方方, 董美, 胡曉穎, 宛煜嵩, 金蕪軍, 蘭青闊, 李亮, 韓陽. 基于PCR技術(shù)的DNA分析測試關(guān)鍵要素. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2019, 38(2): 624-629.

AN N, LIU F F, DONG M, HU X Y, WAN Y S, JIN W J, LAN Q K, LI L, HAN Y. Key elements of DNA analysis and testing based on PCR technology. Genomics and Applied Biology, 2019, 38(2): 624-629. (in Chinese)

[32] 王顥潛, 肖芳, 楊蕾, 繆青梅, 張旭冬, 張秀杰. 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法驗證結(jié)果分析. 生物技術(shù)通報, 2020, 36(5): 48-55.

WANG H Q, XIAO F, YANG L, MIAO Q M, ZHANG X D, ZHANG X J. Analysis of verification results by PCR methods for genetically modified double-resistant 12-5 event-specific maize. Biotechnology Bulletin, 2020, 36(5): 48-55. (in Chinese)

[33] 宋君, 常麗娟, 張富麗, 王東, 李潔. 采用蒙特卡洛法評定轉(zhuǎn)基因水稻樣品中NOS終止子的測量不確定度. 計量學(xué)報, 2019, 40(1): 164-171.

SONG J, CHANG L J, ZHANG F L, WANG D, LI J. Measurement uncertainty in NOS terminator from genetically modified rice estimated by Monte Carlo method. Acta Metrologica Sinica, 2019, 40(1): 164-171. (in Chinese)

[34] 楊冬燕, 楊永存, 李浩. 轉(zhuǎn)基因成分定量檢測數(shù)據(jù)分析及不確定度評估現(xiàn)狀概述. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報, 2016, 7(8): 3025-3028.

YANG D Y, YANG Y C, LI H. Data analysis and uncertainty evaluation of genomic modified ingredients quantitation by real- time PCR. Journal of Food Safety & Quality, 2016, 7(8): 3025-3028. (in Chinese)

[35] TRAPMAN S, BURNS M, CORBISIER P, GATTO F, ROBOUCH P, SOWA S, EMONS H. Guidance document on measurement uncertainty for GMO testing laboratories-3rdedition. European Union, 2020. DOI: 10.2760/738565.

[36] 黃文勝, 鄧婷婷, 韓建勛, 吳亞君, 陳穎. 轉(zhuǎn)基因定量檢測的不確定度研究. 中國生物工程雜志, 2012, 32(1): 49-55.

HUANG W S, DENG T T, HAN J X, WU Y J, CHEN Y. Estimate the uncertainty on quantification of GMO by the fluorescence real-time PCR method. China Biotechnology, 2012, 32(1): 49-55. (in Chinese)

Establishment and standardization of event-Specific real-time quantitative PCR detection method of stress-resistant soybean IND-??41?-5

LI YunJing1, XIAO Fang1, WU YuHua1, LI Jun1, GAO HongFei1, ZHAI ShanShan1, LIANG JinGang2, WU Gang

1Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Science/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/ Supervision and Test Center (Wuhan) for Plant Ecological Environment Safety, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Agricultural Genetically Modified Organisms Traceability, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062;2Development Center of Science and Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100176

【Objective】Stress-resistant soybean IND-??41?-5 has been authorized as a safety certificate for imported processed raw materials in China. This study aims to develop a specific, accurate, and sensitive real-time quantitative PCR (qPCR) assay for the quantification of the stress-resistant soybean IND-??41?-5 event, providing a precise measurement technique for regulating its safety in China. 【Method】18 pairs of primers and probes were designed using Beacon designer 8.0 software for the 5′ end flanking sequence of the stress-resistant soybean IND-??41?-5 event, in combination with one pair of primer and probe providing by Instituto de Agrobiotecnologia Rosario (INDEAR) S.A. Subsequently, the specific screening of the primers and probes was performed using real-time PCR technology, and one pair of candidate primer and probe was selected. The reaction system parameters, such as primer and probe concentration, were optimized during the establishing the qPCR method. A specificity test was performed using different test samples. The pure stress-resistant soybean IND-??41?-5 genomic DNA was serially diluted into standard solution templates, and standard curves were plotted to investigate the linear dynamic range of the qPCR method. Test samples with copy number ratios of 5%, 1% and 0.1% were prepared by mixing IND-??41?-5 genomic DNA with non-GM counterpart to evaluate the accuracy of the qPCR method. The limit of detection (LOD) was detected by using test samples with copy number ratios of 0.05% and 0.025%. The limit of quantification (LOQ) was determined after 16 tests on samples with a copy number ratio of 0.1%. Finally, the technical parameters of qPCR assay for the stress-resistant soybean IND-??41?-5 event were determined. The specificity, LOD, LOQ and accuracy of the qPCR method were validated by eight qualified testing laboratories. The repeatability and reproducibility of the qPCR were evaluated by Cochran′s test and Grubbs' test, and the measurement uncertainty of the accuracy samples were pre-evaluated by linear least-square method. 【Result】The RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1 primer and probe combination was selected as a candidate to establish the qPCR for the stress-resistant soybean IND-??41?-5 event, with an amplified fragment of 138 bp. The optimized reaction system had a final concentration of 0.4 μmol·L-1for the primer and 0.2 μmol·L-1for the probe. Standard curves of IND-??41?-5 andgene assay showed good linearity with the dynamic range from 33 to 83190 copies of genomic DNA. The qPCR can accurately quantify 5%, 1%, and 0.1% content of IND-??41?-5 test samples with less than 25% bias and relative standard deviation (RSD). The LOD was determined to be 0.05%, and the LOQ was 0.1%. After validation by eight qualified laboratories, the results indicated that the method was stable, specific and had good repeatability and reproducibility, with the LOD of 0.05% and LOQ of 0.1%. After pre-evaluating the measurement uncertainty, the content of IND-??41?-5 in the five test samples was found to be (0.10±0.02)%, (0.53±0.09)%, (1.05±0.18)%, (2.05±0.34)% and (5.18±0.87)%, respectively. These results demonstrate the accuracy and reliability of the qPCR method established in this study for the quantification of stress-resistant soybean IND-??41?-5 event components.【Conclusion】This study successfully developed a specific, accurate, and sensitive qPCR assay for the quantification of stress-resistant soybean IND-??41?-5 event using real-time PCR technology. The results show that method is capable of achieving precise measurement and reliable quantification of IND-??41?-5 event components.

transgenic; stress-resistant soybean IND-??41?-5; event-specific; real-time quantitative PCR (qPCR)

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.13.002

2023-02-27；

2023-04-12

農(nóng)業(yè)生物育種重大項目（2022ZD04019）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASYIP-2021-OCRI）

李允靜，E-mail：liyunjing@caas.cn。通信作者吳剛，E-mail：wugang@caas.cn。通信作者梁晉剛，E-mail：liangjingang@agri.gov.cn

（責(zé)任編輯 李莉）