楊倩，何舒婷，孟 東，王重娟 ，吳明一

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671003；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院，云南昆明 650051；3.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，云南昆明 650204）

蕁麻（UrticaL.）為被子植物門、蕁麻科、蕁麻屬一年生或多年生草本植物，具有悠久的食用和藥用歷史，其葉子常作為蔬菜用于烹飪，而風(fēng)干的莖和根則可用于泡茶。早在《本草綱目》、《本草圖經(jīng)》中就有記載，蕁麻具有祛風(fēng)通絡(luò)、平肝定驚、消積通便、解毒等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明蕁麻具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功效，能夠用于治療前列腺炎、風(fēng)濕病、扭傷疼痛、蕁麻疹、白癜風(fēng)、皮膚瘙癢等疾病[1?3]。蕁麻屬植物在我國(guó)產(chǎn)量充沛，在全世界現(xiàn)今所知的36 種蕁麻屬植物中，有23 種分布在我國(guó)各地區(qū)，其中粗根蕁麻（Urtica macrorrhizaHand.-Mazz.）具長(zhǎng)而粗的木質(zhì)化根狀莖，產(chǎn)量大，療效確切且毒副作用小，具有較高的研發(fā)價(jià)值。

近年來的多項(xiàng)研究表明，蕁麻屬植物中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括黃酮類、多糖類、木脂素類、氨基酸、類胡蘿卜素和脂肪酸等[4?8]。其中多糖是細(xì)胞組成和生命活動(dòng)中不可或缺的物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等多種生物活性[9?12]。Chen等[13]研究表明，蕁麻多糖能夠有效治療前列腺增生。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)口服粗根蕁麻粗多糖對(duì)腸道免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用，能夠顯著改善環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的腸道粘膜損害和免疫低下[14?16]。

然而，由于多糖的生理活性及其他方面的特性取決于其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，多糖分子量大小、單糖組成、單糖的連接方式等均會(huì)影響多糖的活性[17?19]，因此，不同來源的多糖由于其結(jié)構(gòu)不同，活性也存在較大差異，導(dǎo)致許多學(xué)者和消費(fèi)者對(duì)其質(zhì)量和功效心存疑慮[20]。蕁麻屬植物的根、莖、葉均可食用和入藥，F(xiàn)aleri 等[21]研究表明異株蕁麻不同部位多糖的結(jié)構(gòu)或組成存在差異，具有不同的用途及功效。但目前關(guān)于粗根蕁麻不同部位多糖的化學(xué)組成及功效差異尚不明確，這是進(jìn)一步開發(fā)粗根蕁麻多糖類的食品及藥品亟需解決的問題。

本文以粗根蕁麻為研究對(duì)象，采用熱水提取、乙醇分級(jí)沉淀法制備不同部位粗多糖，利用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）、單糖組成、紅外等化學(xué)及光譜方法，對(duì)6 種多糖進(jìn)行理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)的研究。最后以Raw264.7 細(xì)胞為模型，評(píng)價(jià)不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞毒性、形態(tài)、吞噬功能、細(xì)胞因子分泌水平的調(diào)節(jié)作用，以期為粗根蕁麻多糖的免疫活性研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南粗根蕁麻 2021 年7 月采自云南大理，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所楊文光鑒定為粗根蕁麻（Urtica macrorrhizaHand.-Mazz.）的全草；D-葡萄糖醛酸（D-GlcA）、D-葡萄糖（D-Glc）、D-半乳糖（DGal）、D-半乳糖醛酸（D-GalA）、D-N-乙酰葡糖胺（DGlcNAc）美國(guó)Sigma 公司；L-鼠李糖（L-Rha）、D-甘露糖（D-Man）、D-阿拉伯糖（D-Ara）Alfa Aesar公司；右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品D0、D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8 中國(guó)藥品生物制品檢定所；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、三氟乙酸（TFA）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；30%過氧化氫（H2O2）天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醇和乙腈為色譜純北京邁瑞達(dá)科技有限公司；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)級(jí)Lipopolysaccharides（LPS）來源于大腸桿菌055:B5 美國(guó)Sigma公司；中性紅染色劑、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2（MTT）北京索萊寶生物科技有限公司；青鏈霉素美國(guó)Millipore 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶 美國(guó)HyClone 公司；一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：061322220805）；人腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒 深圳欣博盛生物科技有限公司（批號(hào)：M220906-102a）；95%乙醇為市售食品級(jí)，其他試劑均為分析純；小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7 加拿大ABM 公司，培養(yǎng)在含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2，溫度為37 ℃，濕度為95%。

1260 Infinity 高效液相色譜儀 Agilent Technologies 公司；UV-2600 紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Tensor 27 傅立葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司；2500A 粉碎機(jī) 永康市速鋒工貿(mào)有限公司；FD-1A-50 低溫冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE 2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SQP 十萬分之一天平 Sartorius 科學(xué)儀器有限公司；Neofuge 13R 高速冷凍離心機(jī) 上海力新儀器有限公司；Model 550 全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó) Bio-Rad 公司；DMi1 倒置顯微鏡 德國(guó)Leica。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗根蕁麻不同部位粗多糖的制備 采用熱水提取、乙醇分級(jí)沉淀、H2O2脫色的方法提取純化粗根蕁麻多糖[14,22]。分別稱取粗根蕁麻不同部位（根、莖、葉）粉末300 g 置于回流裝置中，加入95%乙醇1.5 L，攪拌條件下，70 ℃回流3 h，重復(fù)2 次，以除去藥材中脂溶性小分子物質(zhì)，收集藥渣，室溫晾干。將藥渣置于回流裝置中，加入去離子水3 L，攪拌條件下，70 ℃回流提取3 h，重復(fù)提取2 次，合并兩次提取液。依次加入95%乙醇，使其終濃度分別為40%、60%（v/v），攪拌后離心（4000 r/min，15 min），分別收集沉淀。加入3 倍量去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH 至9～10。緩慢加入30% H2O2使其終濃度達(dá)3%，50 ℃水浴攪拌反應(yīng)1.5 h。調(diào)節(jié)pH 至中性后將溶液離心（4000 r/min，15 min），上清液中加入終濃度為70%（v/v）的乙醇，離心收集沉淀，重復(fù)操作2 次，收集沉淀。真空干燥箱干燥，即得粗根蕁麻葉粗多糖（UML40、UML60）、莖粗多糖（UMS40、UMS60）、根粗多糖（UMR40、UMR60），提取流程如圖1 所示。不同部位粗多糖產(chǎn)率或占比計(jì)算公式如下：

圖1 粗根蕁麻粗多糖提取分離流程圖Fig.1 Extraction and separation procedure of polysaccharides from Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.

1.2.2 多糖分子量的測(cè)定 采用高效凝膠滲透色譜法（High performance gel permeation chromatography，HPGPC）對(duì)多糖分子量分布進(jìn)行測(cè)定[23]。標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的制備：分別稱取粗根蕁麻不同部位多糖（UML40、UML60、UMS40、UMS60、UMR40、UMR60）和右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（180、2700、5250、9750、13050、36800、646500、135350 和2000 kDa）10 mg，加1 mL 去離子水溶解，0.22 μm 濾膜過濾。色譜分析條件：Agilent 1260 HPLC 系統(tǒng)，Agilent 示差檢測(cè)器，Shodex Ohpak SB-806HQ 凝膠色譜柱，流動(dòng)相：0.1 mol/L NaCl，流速：0.5 mL/min，柱溫：35 ℃，示差檢測(cè)器溫度：40 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。應(yīng)用GPC 軟件分析數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：lgMw=10.96?0.501Rt+0.006049Rt2?4.485e?5Rt3（Mw：重均分子量，Rt ：保留時(shí)間），R2=0.9999。根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品的相對(duì)分子量。

1.2.3 單糖組成分析

1.2.3.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的制備 分別取D-Man、L-Rha、D-Glc、D-Gal 和D-Ara 單糖標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg 和D-GlcNAc、D-GlcA、D-GalA 單糖標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg，分別加水定容至10 mL。精密量取各對(duì)照品溶液100 μL，加水定容至1 mL，混勻，即得混合單糖對(duì)照品溶液。各粗根蕁麻粗多糖供試品以去離子水配制成4 mg/mL 溶液。

1.2.3.2 多糖水解和衍生化產(chǎn)物的制備 精密量取各單糖標(biāo)準(zhǔn)制品、單糖標(biāo)準(zhǔn)混合溶液制品和粗根蕁麻粗多糖樣品1 mL，加4 mol/L 的TFA 1 mL，110 ℃水解4 h；蒸干，加200 μL 去離子水溶解，加入200 μL 0.6 mol/L 的NaOH 溶液和400 μL 0.5 mol/L 的PMP甲醇溶液，充分混合；70 ℃衍生化反應(yīng)1 h，HCl 溶液中和后，加入CHCl3萃取3 次，水相經(jīng)0.22 μm 的微孔濾膜過濾后供液相色譜分析。

1.2.3.3 色譜分析條件 色譜柱：Hadesil C18-BIO（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.8）緩沖液-乙腈（82:18）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：3 μL；DAD 檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm，進(jìn)樣時(shí)間：75 min。

1.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程如表1 所示。計(jì)算樣品中各單糖的濃度，將D-Man 的摩爾數(shù)定為1，計(jì)算其它單糖與D-Man 的摩爾比。

表1 各單糖PMP 衍生物的回歸方程和線性范圍Table 1 Regression equations and linear ranges of PMP derivatives of each monosaccharides

1.2.4 光譜分析

1.2.4.1 全波長(zhǎng)分析 將UML40、UML60、UMS40、UMS60、UMR40、UMR60 加水溶解至0.25 mg/mL，在190～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)掃描。

1.2.4.2 紅外光譜分析 根據(jù)2020 版《中國(guó)藥典》第四部的固體壓片法[24]：分別稱取粗根蕁麻不同部位粗多糖各1 mg，加適量KBr 壓片，利用傅里葉變換紅外光譜在4000～400 cm?1波長(zhǎng)下掃描。

機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)課程除了由經(jīng)典教學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容歸納的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)以及由“三理”學(xué)科實(shí)驗(yàn)有機(jī)整合的綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目外，還依托學(xué)校的本科生科研訓(xùn)練計(jì)劃（Student Research Training Program，SRTP），展開了面向本科生的開放實(shí)驗(yàn)。SRTP項(xiàng)目的重點(diǎn)在于由學(xué)生自主查閱文獻(xiàn)、立項(xiàng)開題、書寫設(shè)計(jì)報(bào)告，最后完成實(shí)驗(yàn)，具有一定的技術(shù)含量與難度。機(jī)能實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員應(yīng)該視其為教學(xué)相長(zhǎng)的過程，積極配合指導(dǎo)教師，協(xié)同指導(dǎo)，高效高質(zhì)量完成開放實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)計(jì)劃[7]。不斷鞏固相關(guān)理論知識(shí)和儀器操作能力，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)儀器使用的統(tǒng)籌安排能力，把機(jī)能實(shí)驗(yàn)開放工作當(dāng)做全新挑戰(zhàn)，豐富教學(xué)科研經(jīng)驗(yàn)。

1.2.5 MTT 法考察粗根蕁麻多糖的細(xì)胞毒性 將Raw264.7 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔鋪入96 孔板中培養(yǎng)24 h。分別加入含有各濃度粗根蕁麻粗多糖的新鮮培養(yǎng)基（低濃度：0.1 μg/mL、中濃度：1 μg/mL、高濃度：10 μg/mL），每孔150 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO 溶液，振蕩混勻，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm 處吸光度A 值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

1.2.6 中性紅實(shí)驗(yàn)考察粗根蕁麻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響 將Raw264.7 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔鋪入96 孔板中培養(yǎng)24 h。分別加入含有各濃度粗根蕁麻粗多糖的新鮮培養(yǎng)基（低濃度：0.1 μg/mL、中濃度：1 μg/mL、高濃度：10 μg/mL），每孔150 μL。以1 μg/mL LPS 為陽性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后于倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。棄去培養(yǎng)基，各孔分別加入含有中性紅1 mg/mL 的PBS 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。棄去上清液，用預(yù)冷的PBS 洗3 遍，每孔加入細(xì)胞裂解液（乙醇:冰醋酸=1:1）100 μL，室溫下放置2 h，待細(xì)胞溶解后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定540 nm處吸光度A 值。吞噬率計(jì)算公式如下：

1.2.7 Griess 和ELISA 法檢測(cè)粗根蕁麻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的影響 Raw264.7 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔鋪入24 孔板中培養(yǎng)24 h。分別加入含有各濃度粗根蕁麻粗多糖的新鮮培養(yǎng)基（低濃度：0.1 μg/mL、中濃度：1 μg/mL、高濃度：10 μg/mL），每孔500 μL。以1 μg/mL LPS 為陽性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集培養(yǎng)液，?80 ℃保存?zhèn)溆?。分別按照Griess 和ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)培養(yǎng)液中NO 和TNF-α和的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05；采用GraphPad Prism 9 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗根蕁麻不同部位粗多糖產(chǎn)率及性狀

粗根蕁麻葉、莖和根的多糖水提液由深綠色至深棕色，考慮含有色素可能性大，進(jìn)一步脫色，所得粗多糖呈淡黃色，粉末細(xì)膩，具引濕性。粗根蕁麻不同部位粗多糖產(chǎn)率如表2 所示，葉粗多糖產(chǎn)率最高，占總多糖產(chǎn)量的71.74%，莖粗多糖和根粗多糖占比分別為10.71%和17.55%。

表2 粗根蕁麻不同部位粗多糖得率及占比Table 2 The yield and proportion of crude polysaccharide in different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.

2.2 粗根蕁麻不同部位粗多糖分子量及分布

由于不同分子量的多糖在低醇中溶解度不同，隨著乙醇量的增加，分子量由大到小的多糖將逐級(jí)沉淀出來，本研究分別采用40%（v/v）和60%（v/v）的乙醇對(duì)各部分粗多糖進(jìn)行分級(jí)沉淀，不同部位粗多糖的分子量分布曲線如圖2 所示，各部位多糖40%（v/v）乙醇沉淀分子量均大于60%（v/v）乙醇沉淀，這與Gu 等[22]的研究結(jié)果一致。粗根蕁麻葉粗多糖UML40和UML60 的平均重均分子量較小，主要分布在2.11和2.74 kDa；莖粗多糖UMS40 主要分布在68.54 kDa，UMS40 主要分布在61.94 kDa；根粗多糖UMR40分子量較大，主要分布在802.21 kDa，UMR60 主要分布在38.06 kDa。根和莖作為植物能量?jī)?chǔ)存和支撐組織，多為纖維素和果膠等多聚糖構(gòu)成，因而分子量較大，而葉中的多糖主要為光合作用的初級(jí)產(chǎn)物，為低聚多糖，因而分子量較小。

圖2 粗根蕁麻各部位粗多糖的分子量分布曲線Fig.2 Molecular weight distribution curves of crude polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.

2.3 單糖組成分析

表3 粗根蕁麻不同部位粗多糖的單糖比例Table 3 Characteristics of monosaccharide composition of crude polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.

圖3 經(jīng)PMP 衍生化后的HPLC 圖UML40（A）、UML60（B）、UMS40（C）、UMS60（D）、UMR40（E）、UMR60（F）、標(biāo)準(zhǔn)混合單糖（G）Fig.3 HPLC chromatogram of PMP derivatives of UML40 (A),UML60 (B),UMS40 (C),UMS60 (D),UMR40 (E),UMR60 (F)and standard mixed monosaccharides (G)

2.4 粗根蕁麻不同部位粗多糖的光譜分析

2.4.1 全波長(zhǎng)分析 結(jié)果如圖4A 所示，粗根蕁麻葉和根多糖在280 nm 處具有少量吸收，說明樣品中有少量蛋白質(zhì)存在，而莖多糖在260 和280 nm 處均無吸收，說明樣品中不存在核酸和蛋白質(zhì)。

圖4 粗根蕁麻各部位多糖全波長(zhǎng)掃描圖（A），紅外光譜圖（B）與二階求導(dǎo)紅外光譜圖（C）Fig.4 Spectroscopic analysis of polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.full wavelength scanning (A),infrared spectrum (B) and second derivative infrared spectrum (C)

2.4.2 紅外光譜分析 粗根蕁麻不同部位粗多糖的紅外光譜見圖4B，6 種多糖的紅外吸收光譜形狀相似，均具有糖類復(fù)合物官能團(tuán)特征吸收峰，3412 cm?1處有較強(qiáng)吸收，這是多糖中O-H 的伸縮振動(dòng)引起的，2932 cm?1處的吸收是C-H 吸收振動(dòng)峰[28]；此外，紅外分析顯示，在1730 cm?1附近未檢測(cè)到明顯的吸收峰，說明粗根蕁麻各部位多糖中的糖醛酸是未酯化的糖醛酸，1644 cm?1處的吸收峰為羧基的C=O 的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰[29]。1400～1200 cm?1的吸收峰是CH 鍵的角變振動(dòng)峰；約1000～1200 cm?1顯示為C-OC 和C-O-H 鍵的存在，為吡喃糖的特征峰。920～840 cm?1存在多條吸收帶，提示存在α和β構(gòu)型。紅外光譜結(jié)果表明，各部位粗多糖的特征官能團(tuán)和骨架結(jié)構(gòu)基本一致[30]。二階導(dǎo)數(shù)光譜通過求導(dǎo)使斜率變大峰形狀變尖，能夠更好的分辨紅外光譜圖中重疊的吸收峰。圖4C 為各粗多糖二階求導(dǎo)紅外光譜圖，粗根蕁麻葉、根多糖在1383 cm?1均存在吸收峰，提示其為蛋白結(jié)合多糖；而UMS40和UMS60 在1383 cm?1處無明顯吸收峰，與全波長(zhǎng)掃描測(cè)定結(jié)果一致。

2.5 粗根蕁麻不同部位粗多糖的毒性

巨噬細(xì)胞是研究細(xì)胞免疫和分子免疫的重要工具，在機(jī)體免疫應(yīng)答和防御中具有重要作用。因此，本研究選擇小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7 作為細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)粗根蕁麻多糖對(duì)Raw264.7 細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。首先通過MTT 法考察了各粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性。結(jié)果如圖5 所示，UML60 具有較大的細(xì)胞毒性，1 μg/mL 的UML60 即可使細(xì)胞存活率降低至80%以下，此外，10 μg/mL 的UMR40 也具有一定的細(xì)胞毒性。其余各多糖在10 μg/mL 濃度以內(nèi)均能使細(xì)胞存活率保持在80%以上。

圖5 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性Fig.5 Toxicity of crude polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.to macrophages

2.6 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響

巨噬細(xì)胞的形態(tài)在一定程度上可以反應(yīng)其被激活的程度，本研究考察了不同濃度的粗根蕁麻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果如圖6 所示。空白對(duì)照組中巨噬細(xì)胞呈圓形或橢圓形，較少見突起，細(xì)胞內(nèi)未見空泡。采用LPS 處理24 h 后，細(xì)胞體積變大，出現(xiàn)較多偽足和細(xì)胞內(nèi)空泡（白色箭頭所示），細(xì)胞變?yōu)樗笮?、橢圓形或不規(guī)則形，呈現(xiàn)激活狀態(tài)。UML40在中濃度和高濃度下能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化，UML60不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化，且中、高濃度下可見巨噬細(xì)胞死亡，說明其具有一定的細(xì)胞毒性，與MTT 檢測(cè)結(jié)果一致。莖多糖UMS40 和UMS60 激活巨噬細(xì)胞的活性均較弱，僅UMS40 在高濃度下能夠促進(jìn)其分化。根多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用最強(qiáng)，各濃度的UMR40 和UMR60 均能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化。

圖6 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.6 Effect of crude polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.on macrophage morphology

2.7 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響

通過采中性紅實(shí)驗(yàn)考察粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響，結(jié)果如圖7 所示。低、中濃度的UML40 和各濃度的UMR40 均能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬活性（P<0.05），且以UMR40 促進(jìn)細(xì)胞吞噬的活性最強(qiáng)，但UMR60 表現(xiàn)出一定的抑制巨噬細(xì)胞吞噬的作用。

圖7 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.7 The phagocytic activity of macrophages of polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.

2.8 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響

首先采用Griess 法檢測(cè)了各粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞NO 釋放量的影響，結(jié)果如圖8A 所示，粗根蕁麻根多糖促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO 的活性最強(qiáng)，各濃度的UMR40 和UMR60 均能夠高度顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO（P<0.001），UMR60 的活性隨著濃度的增加而增加，而UMR40 在1 μg/mL 時(shí)活性最強(qiáng)。此外，1 μg/mL 以上的UML40 以及10 μg/mL 的UMS40也能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO（P<0.05）。進(jìn)一步采用ELISA 法檢測(cè)了各粗多糖在高濃度（10 μg/mL）下對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α的影響，結(jié)果與NO 檢測(cè)結(jié)果一致，UMR40 和UMR60 促TNF-α分泌的作用最強(qiáng)（P<0.001），UML60 和UMS60 不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α。

圖8 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的影響Fig.8 Effects of polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.on cytokine release from macrophages

結(jié)合上述巨噬細(xì)胞活性調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)表明，本研究提取的6 個(gè)粗根蕁麻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用存在差異，可能是由各多糖之間的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的。一方面是分子量不同的多糖，其活性可能不同，Zhang等[31]的研究也表明，從云芝中提取的兩種多糖，由于分子量不同，對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用也不同。另一方面單糖組成及其比例不同的多糖活性也不同，如Shen 等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，柑橘中的兩種多糖CAVAPI 和CAVAP-II 由相同類型的單糖組成，但D-Ara、D-Man、D-Glc 和D-Gal 的比例存在差異，CAVAPII 表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性。上述研究表明，來自不同部位的6 個(gè)粗根蕁麻多糖在分子量及單糖組成上均存在一定的差異，因此對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用也不同，結(jié)合粗根蕁麻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的分化、吞噬活性、以及細(xì)胞因子NO、TNF-α分泌的影響這3 個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，粗根蕁麻根多糖具有更強(qiáng)的巨噬細(xì)胞激活作用。

3 結(jié)論

本研究通過熱水提取和乙醇分級(jí)沉淀從粗根蕁麻葉、莖、根中提取得到6 種粗多糖UML40、UML60、UMS40、UMS60、UMR40、UMR60，產(chǎn)率分別為3.60%、1.02%、0.35%、0.34%、0.81%、0.32%；平均重均分子量分別為2.11、2.74、68.54、61.94、802.12、38.06 kDa；6 種粗多糖均為酸性多糖，主要由DGlc、D-Gal、D-Ara 和D-GalA 組成，但不同部位粗多糖的單糖組成摩爾比不同。進(jìn)一步研究了這些多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用，結(jié)果表明，不同部位、不同分子量、不同單糖組成的粗根蕁麻多糖活性存在較大差異，其中UML40、UMS40、UMR40 均能夠顯著活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬活性，并顯著提高巨噬細(xì)胞免疫因子NO、TNF-α分泌水平；UMR60雖然不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬活性但能顯著促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌；UML60 細(xì)胞毒性較大且活性較低；UMS60 在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)不能激活巨噬細(xì)胞?？傮w來說，粗根蕁麻不同部位多糖在組成及免疫調(diào)節(jié)活性上存在一定差異，粗根蕁麻根多糖具有更高的免疫調(diào)節(jié)活性，因此在對(duì)其進(jìn)行研究及開發(fā)利用時(shí)應(yīng)當(dāng)注意質(zhì)量控制并對(duì)根多糖給與更多的關(guān)注。本研究為今后深入研究粗根蕁麻有效成分的結(jié)構(gòu)鑒定及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也可為開發(fā)粗根蕁麻多糖的相關(guān)健康產(chǎn)品提供理論依據(jù)。