王芮，蔣起宏，周宇芳，陳 慧，朱正華，劉書(shū)來(lái), ，相興偉,

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江杭州 310014；2.浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310014；3.國(guó)家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心（杭州），浙江杭州 310014；4.浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，浙江舟山 316021；5.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310018）

糖尿病的發(fā)生主要與遺傳因素或者后天城市化行為（高脂飲食導(dǎo)致的肥胖）等環(huán)境因素有關(guān)[1?2]。1 型糖尿?。═ype 1 diabetes mellitus，T1DM），是由自身免疫反應(yīng)引起的，機(jī)體的防御機(jī)制錯(cuò)誤的對(duì)負(fù)責(zé)產(chǎn)生胰島素的胰島β細(xì)胞發(fā)起攻擊，導(dǎo)致胰島素分泌的絕對(duì)不足。2 型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種代謝性疾病，主要表現(xiàn)為身體對(duì)胰島素敏感性降低，產(chǎn)生了胰島素抵抗[3]，導(dǎo)致糖代謝紊亂，血糖上升[4]。此外，胰島素抵抗還會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)異常積累和脂質(zhì)合成改變，誘發(fā)慢性肝病，包括非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎，甚至肝硬化[5]。根據(jù)糖尿病聯(lián)盟（International diabetes federation，IDF）統(tǒng)計(jì)，2021 年中國(guó)糖尿病患者超1.4 億，預(yù)估到2045 年將超過(guò)1.74 億，居全球第一位[6]。

目前用于改善糖尿病的藥物包括二甲雙胍、磺脲類(lèi)和吡格列酮，這些藥物依賴(lài)性較強(qiáng)，長(zhǎng)期使用會(huì)伴隨一定的副作用，如頭暈、惡心、腹瀉等[7?8]。因此，探尋無(wú)副作用且具有降血糖的物質(zhì)，對(duì)改善糖尿病具有重要意義。貽貝是一種雙殼類(lèi)軟體動(dòng)物，富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和微量礦物質(zhì)元素[9]。大量研究結(jié)果表明，從貽貝中提取的多糖具有免疫抑制，抗氧化和炎癥等一系列生物活性[10?12]。多糖是生物體內(nèi)的主要活性成分，在改善胰島素抵抗方面具有很大潛力，如海參多糖[13]，褐藻糖膠[14]和海藻多糖[15]等。重要的是這些多糖具有低毒性和高效性，已經(jīng)被提議作為預(yù)防和治療糖尿病的潛在治療劑。

在之前的研究工作中，本團(tuán)隊(duì)從貽貝中分離出一種新型貽貝多糖（Mussel polysaccharides，MP），平均分子量為4.25×103Da，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于抗氧化、抗炎癥具有很好的改善效果[11?12]，但對(duì)肝細(xì)胞胰島素抵抗的保護(hù)作用尚不清楚。因此，鑒于人體試驗(yàn)開(kāi)展的局限性，本研究在體外建立了胰島素抵抗的HepG2 細(xì)胞模型，可在細(xì)胞水平探討胰島素抵抗形成的機(jī)制和葡萄糖代謝障礙[16]，同時(shí)便于篩選改善胰島素抵抗的活性物質(zhì)，為貽貝產(chǎn)業(yè)的高值化利用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MP 采用先前方法提取制備，平均分子量為4.25×103Da，主鏈連接為→4）-α-D-Glcp-（1→糖苷鍵，端基α-D-Glcp-（1→和α-D-Glcp-（1→6）-α-D-Glcp-（1→pass→4,6）-α-D-Glcp-（1→.O-6 鍵與主鏈相連[11]。HepG2 肝癌細(xì)胞 浙江省立同德醫(yī)院惠贈(zèng)；高糖DMEM 培養(yǎng)基、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）、噻唑蘭（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenylterazolium bromide，MTT）和BeyoAOFTM重組胰酶細(xì)胞消化液 杭州浩克生物有限公司；胎牛血清和雙抗（含100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素）Thermo Scientific（Gibco）；人源胰島素 北京沃凱生物科技有限公司；糖原試劑盒 南京建成有限公司；RIPA 裂解液、Fasting gDNA Dispelling RT SuperMix 試劑盒、Cell Kit RNA Easy Fast 試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所；Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix（High Rox Plus）翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

TE2000 倒置熒光顯微鏡 日本Nikon 公司；3111型CO2培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀 Thermo Scientific（Gibco）；ABI ViiA? 7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 Applied Biosystems；Micro21R 高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HepG2 細(xì)胞的體外培養(yǎng)

1.2.1.1 HepG2 細(xì)胞的復(fù)蘇 用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2，當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代和種板[17]。將培養(yǎng)瓶中指數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)基棄去，用37 ℃預(yù)熱的PBS 洗3 次后，吹落瓶底細(xì)胞，收集懸液，稀釋后計(jì)數(shù)，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)取不同細(xì)胞數(shù)進(jìn)行種板。

1.2.1.2 HepG2 細(xì)胞的傳代 將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出后，使用倒置顯微鏡在4 倍鏡下觀察細(xì)胞的密度，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（80%～90%）時(shí)候，細(xì)胞活力最好，即為最佳傳代時(shí)間。傳代過(guò)程如下：吸棄原有培養(yǎng)基，用PBS 清洗兩次，加入1 mL 胰酶細(xì)胞消化液消化2 min，觀察細(xì)胞狀態(tài)。隨后加入2 mL完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，將瓶壁的細(xì)胞吹落，離心棄去上清液，加入1 mL 完全培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀吹散至細(xì)胞懸液，隨即轉(zhuǎn)移至預(yù)先含有5 mL 完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

1.2.2.1 不同濃度貽貝多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞每孔4×103個(gè)接種到96 孔板中，培養(yǎng)箱孵育24 h 后，棄去上清液。除空白組只加入完全培養(yǎng)基外，其余組則加入含有不同濃度MP（100、200、400、600、800、1000 μg/mL）的完全培養(yǎng)基，每個(gè)復(fù)孔為6。采用CCK8 法檢測(cè)MP對(duì)HepG2 細(xì)胞活性的影響[18]。簡(jiǎn)而言之，在37 ℃下孵育24 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基后加10 μg/mL CCK8 溶液。將96 孔板于37 ℃培養(yǎng)箱中放置1 h 后，在450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)OD 值。試驗(yàn)每隔1 h 測(cè)定一次OD 值，重復(fù)三次以上步驟即可。

1.2.2.2 胰島素最佳造模濃度篩選 將處于對(duì)數(shù)期的HepG2 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×104（個(gè)/mL）接種于96 孔板，每孔150 μL，分別設(shè)置不含細(xì)胞的空白對(duì)照組，正常組（NC）和模型組（IR）。孵育24 h 后細(xì)胞單層貼壁，此時(shí)棄去舊的培養(yǎng)基，使用PBS 清洗3 次后，正常組加入含10% FBS 的正常完全培養(yǎng)液，模型組加入含胰島素濃度分別為1×10?4、1×10?5、1×10?6、1×10?7、1×10?8（mol/L）的完全培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS 清洗三次后收集細(xì)胞上清液，用葡萄糖檢測(cè)試劑盒在505 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清的葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖消耗量，計(jì)算公式如下[19]：

式中：18 為mg/dL 和mmol/L 的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.2.2.3 不同濃度貽貝多糖對(duì)HepG2 胰島素抵抗模型細(xì)胞增殖的影響 設(shè)置正常培養(yǎng)的細(xì)胞（簡(jiǎn)稱(chēng)NC）、模型組（簡(jiǎn)稱(chēng)IR）、陽(yáng)性對(duì)照組（IR+3.5 mg/L的二甲雙胍[20]，簡(jiǎn)稱(chēng)Met）以及不同濃度（100、200、400、600、800、1000 μg/mL）貽貝多糖干預(yù)組（簡(jiǎn)稱(chēng)MP）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為5×104（個(gè)/mL），按上述方法分組，每組設(shè)6 個(gè)平行孔，每孔150 μL 接種在96 孔板中。待細(xì)胞單層貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次，NC 組加入正常培養(yǎng)液，其他各組均按最佳造模條件誘導(dǎo)胰島素抵抗模型。用完全培養(yǎng)液分別配制不同濃度的MP 溶液以及35 mg/L 的二甲雙胍溶液，分別干預(yù)胰島素抵抗模型細(xì)胞24 h 后，每孔均加入10 μL 的CCK8 溶液，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h 后取出，置于酶標(biāo)儀上450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD 值。

1.2.3 貽貝多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞糖原分泌的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞每孔2.5×104接種于6 孔板，放入培養(yǎng)箱，孵育24 h。除NC 組外，各組加入1×10?6mol/L 的胰島素處理24 h。然后，除NC 和IR組以外，Met 組更換為含有35 mg/L 二甲雙胍的完全培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別添加200、400、600 μg/mL 的MP 的完全培養(yǎng)基孵育24 h。最后，收集培養(yǎng)基上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定細(xì)胞糖原的分泌水平。

1.2.4 貽貝多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 使用1.2.3 方法處理HepG2 細(xì)胞，24 h 后取出六孔板，去除上清液，用PBS 吹六孔板底部，收集細(xì)胞懸液，用PBS 洗3 遍后，棄去PBS，轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA 酶的5 mL 離心管中，加入1 mL 預(yù)冷TRIzol試劑，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，室溫放置15 min，將離心管放入?80 ℃冰箱待用。按照TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，2 μg 總RNA 根據(jù)Fasting gDNA Dispelling RT SuperMix 試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系：含有10 μL SYBR Green 混合液，1 μL cDNA樣品，上游引物和下游引物各0.4 μL，用ddH2O 補(bǔ)足至20 μL，并在 95 ℃，5 s；60 ℃，34 s 條件下循環(huán)40 次。以β-actin 為內(nèi)參基因，通過(guò)RT-PCR 系統(tǒng)測(cè)定靶基因的相對(duì)表達(dá)水平，計(jì)算公式為2?△△Ct。測(cè)定的目標(biāo)基因?yàn)榱字＜〈?-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）、糖原合成酶激酶-3（Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（Glucose transporter 2，GLUT-2）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）。（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），各組間釆用Duncan 法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SEM）表示，P<0.05 判定差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度貽貝多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響

本實(shí)驗(yàn)采用CCK8 評(píng)價(jià)MP 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響，以篩選合適的MP 濃度。由圖1 可知，與正常組相比，MP 濃度在100～1000 μg/mL 范圍以?xún)?nèi)能促進(jìn)HepG2 細(xì)胞增殖，且在100～800 μg/mL 濃度時(shí)呈顯著性（P<0.05）。表明在一定范圍內(nèi)，MP 對(duì)HepG2細(xì)胞增殖沒(méi)有毒性影響，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 貽貝多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of mussel polysaccharide on the proliferation of HepG2 cells

2.2 不同濃度胰島素對(duì)構(gòu)建IR-HepG2 模型的影響

由圖2 所示，不同濃度胰島素干擾HepG2 細(xì)胞后，上清液葡萄糖含量均高于正常組，尤其以1×10?6mol/L 胰島素干預(yù)后含量最多。表明通過(guò)胰島素干預(yù)后，HepG2 細(xì)胞對(duì)于葡萄糖的敏感性降低，產(chǎn)生了胰島素抵抗，導(dǎo)致葡萄糖消耗量降低。因此，當(dāng)對(duì)HepG2 細(xì)胞施用1×10?6mol/L 的胰島素時(shí)，HepG2細(xì)胞胰島素抵抗最強(qiáng)，對(duì)葡萄糖的消耗能力最弱。這Wang 等試驗(yàn)結(jié)果一致[21]，由此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將統(tǒng)一采用此濃度進(jìn)行操作。

圖2 胰島素濃度對(duì)HepG2 細(xì)胞的影響Fig.2 Effect of different insulin concentrations on the HepG2 cells

2.3 不同濃度貽貝多糖對(duì)IR-HepG2 模型的影響

確定以1×10?6mol/L 為造模濃度后，考察了6 個(gè)不同濃度的MP 在此模型刺激下的細(xì)胞活力情況。目的在于確定后續(xù)種板的多糖濃度，方便后續(xù)開(kāi)展分子學(xué)和酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)。由圖3 所示IR 組的細(xì)胞活力與NC 組相比顯著下降（P<0.05），Met 組對(duì)細(xì)胞活力的恢復(fù)能力最強(qiáng)。MP 組6 個(gè)濃度對(duì)IRHepG2 細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，且在一定范圍內(nèi)（100～800 μg/mL）與正常組無(wú)顯著差異。結(jié)合之前研究結(jié)果（圖1），試驗(yàn)選取200、400、600 μg/mL 濃度的MP 進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 貽貝多糖對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of mussel polysaccharide on the proliferation of IR-HepG2 cell

2.4 貽貝多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞糖原含量的影響

糖原合成、分解過(guò)程是肝糖代謝的主要途徑之一[22]，當(dāng)人體血糖過(guò)低時(shí)，會(huì)促進(jìn)肝糖原分解為葡萄糖。相反，當(dāng)血糖過(guò)高時(shí)，會(huì)促使葡萄糖轉(zhuǎn)化為肝糖原，調(diào)控血糖水平[23]。如圖4 所示，不同劑量的MP干預(yù)可以使IR-HepG2 細(xì)胞內(nèi)糖原合成量增加，作用效果略微低于二甲雙胍。相比于NC 組，IR 模型組的糖原含量則顯著降低（P<0.05），說(shuō)明高濃度胰島素不利于正常HepG2 細(xì)胞糖原合成作用，而二甲雙胍和MP 都能提高IR-HepG2 細(xì)胞的糖原相對(duì)含量，分別增加了51.78%、17.20%、22.95%和32.50%。這主要是由于MP 提高了細(xì)胞對(duì)于葡萄糖的攝入，在各種酶的作用下促進(jìn)糖原合成。由此可以得出貽貝多糖能改善IR-HepG2 細(xì)胞中糖代謝，提高糖原含量。馬二蘭等采用1×10?6mol/L 胰島素建立胰島素抵抗細(xì)胞模型，其糖原含量與正常組相比顯著下降，而荔浦芋球蛋白劑量依賴(lài)性地增加了IR-HepG2 細(xì)胞中的糖原含量[24]。此外，趙可心等指出松花粉提取物能通過(guò)PI3K/AKT 途徑，增強(qiáng)胰島素敏感性，抑制IR-HepG2 細(xì)胞的糖原含量下降[25]。這些活性物質(zhì)對(duì)肝糖原合成的促進(jìn)作用主要通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

圖4 貽貝多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞糖原含量的影響Fig.4 Effect of mussel polysaccharide on the glycogen content of HepG2 cells

2.5 貽貝多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的影響

為更進(jìn)一步分析MP 增強(qiáng)IR-HepG2 細(xì)胞糖原合成的分子機(jī)制，測(cè)定了與糖代謝相關(guān)基因AKT、PI3K、GSK-3β和GLUT2 表達(dá)情況。由圖5 的RTPCR 結(jié)果可知，相較于空白對(duì)照組，模型組IR-HepG2細(xì)胞中的GSK3β基因表達(dá)水平上調(diào)，增長(zhǎng)了107.53%（P<0.05），而AKT、PI3K 和GLUT2 基因表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05）。IR-HepG2 細(xì)胞表現(xiàn)出葡萄糖消耗量和糖原合成量減少的癥狀，通過(guò)MP 干預(yù)后，顯著下調(diào)了GSK3β的基因表達(dá)（P<0.05），并上調(diào)了AKT、PI3K 和GLUT2 的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05），且高劑量MP 作用效果與二甲雙胍相當(dāng)。PI3K/AKT/通路是研究最多的胰島素抵抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[26]，其表達(dá)的變化與葡萄糖代謝密切相關(guān)[27]。PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而GSK-3β在該信號(hào)通路中受胰島素的調(diào)控，與糖原合成調(diào)控有關(guān)[28]。GLUT2 是肝細(xì)胞質(zhì)膜中的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在葡萄糖攝取中起到關(guān)鍵作用[29]。Chen 等發(fā)現(xiàn)?；撬崮芴岣逫R-HepG2 細(xì)胞中PI3K 和AKT 基因表達(dá)，減輕HepG2 細(xì)胞中高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗，增加葡萄糖消耗量[30]。Yang 等試驗(yàn)結(jié)果表明，鱘魚(yú)蛋白衍生肽KIWHHTF 能通過(guò)調(diào)節(jié)HepG2 細(xì)胞中的IRS-1/PI3K/AKT 信號(hào)通路來(lái)預(yù)防胰島素抵抗[31]。綜上所述，MP 改善IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖代謝異常，可能是通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路及下游基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

圖5 貽貝多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的影響Fig.5 Effect of mussel polysaccharides on transcription factors of HepG2 cells

3 結(jié)論

文章以HepG2 細(xì)胞為載體，通過(guò)建立最佳的IR-HepG2 細(xì)胞模型，探究MP 對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，胰島素濃度為1×10?6mol/L時(shí)可以建立效果最佳的IR-HepG2 細(xì)胞模型。當(dāng)MP質(zhì)量濃度在200～600 mg/mL 時(shí)可以提高IR-HepG2細(xì)胞肝糖原的合成，對(duì)促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用具有積極作用。此外，糖代謝相關(guān)基因結(jié)果表明，高劑量MP 組能顯著上調(diào)PI3K 和GLUT2 基因的表達(dá)量（P<0.05），并能下調(diào)GSK-3β的表達(dá)量（P<0.05）。這些結(jié)果表明MP 能有效激活PI3K/AKT 途徑，促進(jìn)糖原合成，提高葡萄糖利用率，進(jìn)而改善IR-HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗。本研究彌補(bǔ)了MP 在胰島素抵抗細(xì)胞層面上的空缺，為開(kāi)發(fā)貽貝多糖預(yù)防胰島素抵抗功能食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。