李如新，郭媛媛,2，解春艷,2,3，賈 云，張兵兵，羅海波，武張飛,2,3,

（1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000；2.河北省食藥用菌資源高值利用技術(shù)創(chuàng)新中心，河北廊坊 065000；3.廊坊市食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊 065000；4.中國人民警察大學(xué)教學(xué)保障處，河北廊坊 065000；5.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇南京 210023）

甜瓜（Cucumis meloL.）屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜族（Trib.CUCURBITEAE Ser）黃瓜屬（Cucumis），是世界第五大產(chǎn)量水果[1]。目前我國甜瓜品種資源約有三百種，其栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位[2]。甜瓜果實(shí)肉質(zhì)甘美，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，鮮切甜瓜具有新鮮、營養(yǎng)、衛(wèi)生、方便等特點(diǎn)，常作為旅游休閑食品或餐后水果食用，深受消費(fèi)者的喜愛[3]。然而切分損傷會(huì)導(dǎo)致果蔬生理代謝紊亂和貨架期縮短，加速品質(zhì)劣變進(jìn)程、營養(yǎng)水平降低等[4]?；诖耍瑖鴥?nèi)外許多學(xué)者關(guān)注鮮切產(chǎn)品品質(zhì)變化研究，以期能更好的保持鮮切產(chǎn)品品質(zhì)、保障物流中鮮切產(chǎn)品的安全性及運(yùn)輸后的貨架期[5?6]。

切分是鮮切果蔬加工必不可少的一道工序，切分損傷誘導(dǎo)植物自身啟動(dòng)應(yīng)答機(jī)制，通過一系列復(fù)雜的代謝途徑生成酚類物質(zhì)，達(dá)到修復(fù)愈合傷口的目的[7?8]。酚類物質(zhì)作為一種重要的抗氧化物質(zhì)，其含量也被作為衡量果蔬抗氧化能力的主要指標(biāo)。在高等植物中，酚類物質(zhì)的合成起始于莽草酸途徑，經(jīng)苯丙烷代謝途徑生成最終產(chǎn)物。在不同切分方式的胡蘿卜[9]和火龍果[10]中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性和酚類物質(zhì)含量的變化保持一致，說明切分損傷強(qiáng)度越大，苯丙烷代謝越強(qiáng)。切分可以誘導(dǎo)胡蘿卜、馬鈴薯和火龍果等果蔬酚類物質(zhì)的積累，這可作為酚類物質(zhì)生產(chǎn)新途徑[9?11]。Li 等[7]發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和切分損傷可協(xié)同誘導(dǎo)糖的利用和轉(zhuǎn)化，從而為鮮切火龍果傷口誘導(dǎo)的酚類物質(zhì)積累提供必需的前體和能量。研究表明，外源MeJA 可作為一種外源信號(hào)因子，不僅能夠調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，促進(jìn)植物合成次級(jí)代謝產(chǎn)物，還可參與植物防御信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，激活多種脅迫應(yīng)答基因，誘導(dǎo)防御基因的表達(dá)以及防御反應(yīng)物質(zhì)的生成，調(diào)控植物的系列連鎖防御反應(yīng)，提高植物對(duì)生物或非生物脅迫的抗性[12?14]。MeJA 無毒、無污染，可作為傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑的替代物用于果蔬貯藏保鮮[15?16]。目前已在番茄、草莓、枇杷、柑橘、菜心、火龍果、菠蘿等多種果蔬采后施用MeJA，發(fā)現(xiàn)MeJA對(duì)這些果蔬的貯藏品質(zhì)、生理代謝、抗病性、抗冷性產(chǎn)生了較為顯著的影響[17?19]。

外源施用MeJA 可減輕機(jī)械損傷對(duì)鮮切果蔬品質(zhì)的影響，能夠有效抑制微生物對(duì)受傷部位的侵染以及果蔬組織內(nèi)部的酶促褐變，改善鮮切果蔬貯藏品質(zhì)[20]。國內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為適宜濃度的MeJA 處理鮮切果蔬可以顯著提高其商業(yè)價(jià)值[20]，而MeJA 如何改善鮮切果蔬貯藏品質(zhì)，如何調(diào)控鮮切果蔬營養(yǎng)物質(zhì)的代謝的研究還很少。本研究以“西州蜜-17”甜瓜為材料，切分前采用MeJA 熏蒸，探索其對(duì)貯藏期間鮮切甜瓜苯丙烷代謝的影響，以期為MeJA 處理改善鮮切甜瓜的品質(zhì)和貯藏性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“西州蜜-17”甜瓜 從廊坊甜瓜種植農(nóng)戶中收獲無機(jī)械損傷、無病蟲害的商業(yè)成熟甜瓜（開花后45 d；硬度11.17±0.31 N；可溶性固形物含量13.18%±0.35%），并在2 h 內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，20 ℃貯藏24 h 以散去田間熱。

MeJA、β-巰基乙醇、Folin-Ciocalteu 試劑 美國Sigma 公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、反式肉桂酸、亮抑肽酶、苯甲基磺酰氟（benzylsulfonyl fluoride，PMSF）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、葡萄糖-6-磷酸鈉鹽、p-香豆酸、輔酶A 北京索萊寶科技有限公司；碳酸鈉、氯化鎂、硼酸、抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、L-苯丙氨酸、鹽酸、EDTA國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；植物RNA 提取試劑盒（DP441）天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR036A）、SYBR?PremixEx Taq?（RR420A）試劑 寶生物工程（大連）有限公司。

WFJUV-2802PC 型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Applied Biosystems 7500 PCR 儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；FRESCO17 型高速離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技公司；XW-80A 型漩渦儀 上海滬西分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 課題組采用不同濃度的MeJA（10、50、100 和200 μmol/L）熏蒸甜瓜，研究發(fā)現(xiàn)切分前采用100 和200 μmol/L MeJA 熏蒸甜瓜可顯著延長鮮切甜瓜貯藏期，增加其抗氧化性（數(shù)據(jù)未顯示）。參照前期研究結(jié)果，將甜瓜隨機(jī)分為兩組，一組（30 個(gè)果實(shí)）采用100 μmol/L MeJA 于20 ℃熏蒸20 h（MeJA 組）；另一組（30 個(gè)果實(shí)）不熏蒸作為對(duì)照組（CK 組）。待到熏蒸結(jié)束后，將兩組甜瓜果實(shí)同時(shí)切分，將果肉切分成2 cm×2 cm×2 cm 左右大小的塊狀，置于透明聚丙烯塑料的一次性保鮮盒內(nèi)（尺寸為：長17 cm×寬11.5 cm×高6 cm，厚0.4 mm），每盒果重120±10 g。將切分好的果實(shí)分別于貯藏柜中貯藏（5 ℃，相對(duì)濕度90%）。在第0、2、4、6、8 d 進(jìn)行鮮切甜瓜取樣，樣品立即用液氮冷凍，并儲(chǔ)存在?80 ℃以備后續(xù)指標(biāo)的測定。

1.2.2 總酚含量測定 總酚含量的測定參照Slinkard等[21]的方法。取20.0 g 甜瓜冷凍樣品進(jìn)行研磨，然后取甜瓜粉末2.0 g，加入25 mL 預(yù)冷的甲醇溶液，充分振蕩混勻后，置于4 ℃冰箱中過夜（12 h）浸提酚類物質(zhì)。提取液于4 ℃、12000×g 離心15 min，上清液用于總酚含量的測定。反應(yīng)體系包括：0.2 mL提取液、1.8 mL 蒸餾水、1 mL Folin-Ciocalteu 試劑和1 mL 7.5% Na2CO3溶液。反應(yīng)液于25 ℃水浴溫育2 h 后，在765 nm 處測定其吸光值，總酚含量以每克鮮重中沒食子酸當(dāng)量表示。

1.2.3 苯丙烷代謝相關(guān)酶活性測定 PAL 活性的測定參照Zhou 等[22]的方法。取20.0 g 甜瓜冷凍樣品進(jìn)行研磨，然后取甜瓜粉末2.0 g，加入5 mL 50 mmol/L 預(yù)冷的硼酸-硼砂緩沖液（pH8.8，內(nèi)含5 mmol/Lβ-巰基乙醇、2 mmol/L EDTA 和40 g/L PVP），充分混勻4 ℃浸提10 min。浸提液于4 ℃、12000×g 離心15 min，上清液用于PAL 活性測定。反應(yīng)體系包括：1 mL 酶粗提液、2 mL 50 mmol/L 硼酸-硼砂緩沖液（pH8.8，內(nèi)含5 mmol/Lβ-巰基乙醇和2 mmol/L EDTA）和0.5 mL 20 mmol/L 苯丙氨酸溶液。反應(yīng)體系于37 ℃水浴中溫育1 h 后，立即加入0.2 mL 6 mol/L 鹽酸溶液終止反應(yīng)，于290 nm 處測定反應(yīng)前后吸光度值。一個(gè)PAL 活性單位（U）定義為在A290吸光度每分鐘變化0.01，并基于鮮重含量表示為U/g。

肉桂酸4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）活性的測定參照Zhou 等[22]的方法。取20.0 g 甜瓜冷凍樣品進(jìn)行研磨，然后取甜瓜粉末2.0 g，加入5 mL 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH8.9，含有10 μmol/L亮抑肽酶、1 mmol/L PMSF、4 mmol/L MgCl2、5 mmol/L AsA、15 mmol/Lβ-巰基乙醇、0.15% PVP（m/v）和10%丙三醇（v/v）），混勻4 ℃浸提10 min。浸提液于4 ℃、12000×g 離心15 min，上清液用于C4H 活性測定。反應(yīng)體系包括：0.5 mL 酶粗提液和1.0 mL 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH8.9，內(nèi)含2 mmol/L 反式肉桂酸、5 μmol/L 葡萄糖-6-磷酸鈉鹽和2 mmol/L NADP）。反應(yīng)體系在25 ℃孵育30 min，立即加入0.1 mL 6 mol/L 鹽酸溶液終止反應(yīng)，分別在340 nm 處測量孵育前后的吸光值。一個(gè)C4H 活性單位（U）定義為在A340吸光度每分鐘變化0.01，并基于鮮重含量表示為U/g。

4-香豆酸-CoA 連接酶（4-coumarate: CoA ligase，4CL）活性的測定參照Zhou 等[22]的方法。取20.0 g甜瓜冷凍樣品進(jìn)行研磨，然后取甜瓜粉末2.0 g，加入5 mL 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH8.0），混勻4 ℃浸提10 min。浸提液于4 ℃、12000×g 離心15 min，上清液用于4CL 活性測定。反應(yīng)體系包括：2 mL 5 mmol/L MgCl2，0.5 mL 5 mmol/L ATP，0.05 mL 0.6 mmol/Lp-香豆酸，0.05 mL 0.4 mmol/L 輔酶A 和0.5 mL 酶粗提液。反應(yīng)體系于40 ℃孵育30 min。分別在333 nm 處測量孵育前后的吸光值。以在A333每分鐘變化0.01 吸光值為一個(gè)4CL酶活力單位（U），并基于鮮物質(zhì)含量表示為U/g。

1.2.4 苯丙烷代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)分析 從葫蘆科植物基因網(wǎng)站CuGenDB 通過酶名稱搜索鑒定關(guān)鍵基因，并根據(jù)課題組先前的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出15 個(gè)苯丙烷代謝關(guān)鍵基因。參照Wu 等[23]的方法，使用RNAprep Pure Plant Kit 試劑盒（DP441，天根生化）按照試劑盒說明書從每個(gè)樣品中提取總RNA。采用凝膠電泳實(shí)驗(yàn)確定RNA 完整性。提取的RNA 立即使用PrimeScript TM RT Master Mix 試劑盒（RR036A，TaKaRa）反轉(zhuǎn)成cDNA，反轉(zhuǎn)生成的cDNA 使用SYBR?PremixEx Taq?（RR420A，TaKaRa）試劑和Applied Biosystems 7500 PCR 系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量分析。qRT-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火34 s，循環(huán)40 次。特異性引物利用Primer 6.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物序列如表1 所示，熔解曲線用于判定引物的特異性。

表1 鮮切甜瓜苯丙烷代謝關(guān)鍵基因qRT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of genes involved in phenylpropanoid pathway for qRT-PCR in fresh-cut melon

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 25.0 進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），采用鄧肯多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05 為差異顯著。利用Origin 8.5 軟件進(jìn)行繪圖。同一貯藏時(shí)間點(diǎn)，不同厚度誤差線上所標(biāo)注的小寫字母不同表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA 處理對(duì)鮮切甜瓜總酚含量的影響

如圖1 所示，鮮切甜瓜總酚含量隨著貯藏時(shí)間的延長而增加。與對(duì)照組相比，MeJA 處理組鮮切甜瓜總酚含量在第0 d 無顯著差異；在貯藏的第2～8 d，MeJA 處理組鮮切甜瓜的總酚含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。在貯藏第6 d 時(shí)，MeJA 處理組總酚含量達(dá)到1.38 mg/g，比對(duì)照組高14.36%，兩組總酚含量出現(xiàn)最大差值。由此可見，切分前MeJA 處理能夠有效增加貯藏期間鮮切甜瓜總酚含量；這可能是由于MeJA 處理能啟動(dòng)鮮切甜瓜的防御反應(yīng)，誘導(dǎo)酚類物質(zhì)積累，以抵御其受到的切分損傷[24]。

圖1 MeJA 處理對(duì)貯藏期間鮮切甜瓜總酚含量的影響Fig.1 Effect of methyl jasmonate treatment on the content of total phenolic compounds in fresh-cut melon during storage

2.2 MeJA 處理對(duì)苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性的影響

PAL、C4H 和4CL 是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，其活性的大小與酚類物質(zhì)、木質(zhì)素合成等密切相關(guān)[25]。在貯藏期間，兩組鮮切甜瓜PAL 活性均呈增加趨勢，且MeJA 處理組鮮切甜瓜的PAL 活性一直顯著高于對(duì)照組（P<0.05），在第8 d 時(shí)，MeJA 處理組鮮切甜瓜PAL 活性為2.56 U/g，比對(duì)照組高出31.63%；與對(duì)照組相比，盡管第2 d MeJA 處理組鮮切甜瓜PAL 活性增加較小，但其高出39.86%。這意味著MeJA 處理能夠迅速提高鮮切甜瓜PAL 活性，且在貯藏期間一直具有促進(jìn)作用。

與PAL 類似，鮮切甜瓜C4H 和4CL 的活性在貯藏期間也呈現(xiàn)增加趨勢，且MeJA 處理組鮮切甜瓜的C4H 和4CL 活性在貯藏期間一直顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。在貯藏結(jié)束時(shí)，MeJA 處理組鮮切甜瓜的C4H 和4CL 活性分別為1.63 和2.69 U/g，分別比對(duì)照組高出9.23%和34.63%。這說明甜瓜切分前MeJA 處理可提高貯藏期間的C4H 和4CL活性。這可能是因?yàn)镸eJA 作為一種信號(hào)分子，可通過調(diào)節(jié)PAL、C4H 和4CL 活性，促進(jìn)苯丙烷代謝途徑，增強(qiáng)果實(shí)組織對(duì)切分損傷的適應(yīng)性[13,26]。

2.3 MeJA 處理對(duì)苯丙烷代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

根據(jù)課題組先前的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出9 個(gè)PAL基因（圖3），貯藏期間其表達(dá)量均比第0 d 高。與對(duì)照組相比，MeJA 處理組鮮切甜瓜的CmPAL1表達(dá)水平在貯藏前2 d 無顯著差異；從第4 d 開始到貯藏結(jié)束，MeJA 處理組鮮切甜瓜的CmPAL1表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。鮮切甜瓜CmPAL2/6的表達(dá)水平在貯藏期間表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，MeJA 處理能顯著提高貯藏期間鮮切甜瓜CmPAL2的表達(dá)，但MeJA 處理組鮮切甜瓜CmPAL6的表達(dá)水平只在第2 d 和第4 d 比對(duì)照組高（P<0.05）。鮮切甜瓜CmPAL3/5/7/8表達(dá)水平與貯藏時(shí)間呈正相關(guān)，除了第8 d，兩組鮮切甜瓜CmPAL3的表達(dá)水平無顯著性差異外，MeJA 處理組鮮切甜瓜的CmPAL3/5/7/8表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。盡管鮮切甜瓜CmPAL4的表達(dá)水平在貯藏期間也隨著貯藏時(shí)間的增加而增加，貯藏結(jié)束時(shí)MeJA 處理組和對(duì)照組鮮切甜瓜CmPAL4的表達(dá)量分別比第0 d 提高了19.09 和17.12 倍，但貯藏期間兩組鮮切甜瓜CmPAL4表達(dá)量無顯著差異。對(duì)照組鮮切甜瓜CmPAL9的表達(dá)量在貯藏的第2 d 急劇增加（與第0 d 相比，增加了14.17 倍），然后保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，同時(shí)MeJA 處理組鮮切甜瓜CmPAL9表達(dá)量的變化與對(duì)照組變化相同，除第4 d 外，MeJA 處理組鮮切甜瓜CmPAL9表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這些結(jié)果表明，甜瓜切分前MeJA 處理能顯著提高貯藏期間鮮切甜瓜CmPAL1/2/3和CmPAL5-9的表達(dá)，增強(qiáng)苯丙烷代謝，以緩解其受到的切分損傷[27]。

如圖4 所示，鮮切甜瓜貯藏期間有4 個(gè)C4H 基因和2 個(gè)4CL 基因差異表達(dá)。通過qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，貯藏期間鮮切甜瓜C4H 基因表達(dá)量均隨著貯藏時(shí)間的延長而增加；且MeJA 處理組鮮切甜瓜的CmC4H1/2/4表達(dá)量在整個(gè)貯藏期間均顯著高于對(duì)照組。與CmC4H1/2/4不同，MeJA 處理組鮮切甜瓜CmC4H3表達(dá)量只在貯藏前4 d 顯著高于對(duì)照組，在貯藏后期（第6～8 d）保持與對(duì)照組相似的基因表達(dá)水平。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)MeJA 處理也可增強(qiáng)鮮切甜瓜Cm4CL1/2的表達(dá)，只有MeJA 處理組鮮切甜瓜Cm4CL1在貯藏的第4 d 保持著與對(duì)照組相似的表達(dá)水平。兩組甜瓜Cm4CL1表達(dá)量在貯藏第4 d 無顯著差異，可能是由于第4 d 取樣果實(shí)中基因的差異表達(dá)導(dǎo)致的。綜上，甜瓜切分前MeJA 處理能提高貯藏期間鮮切甜瓜苯丙烷代謝途徑相關(guān)酶的基因表達(dá)。

3 討論

植物受到機(jī)械損傷等非生物脅迫時(shí)，機(jī)體本身會(huì)觸發(fā)自身防御機(jī)制來抵御來自外界的傷害，甚至還可以通過正常的生理代謝修復(fù)機(jī)械損傷帶來的傷害。MeJA 已經(jīng)在火龍果[7]、馬鈴薯[22]和草莓[16]等果蔬中應(yīng)用以促進(jìn)果蔬的酚類物質(zhì)積累。綜合前人的研究成果，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究表明，果蔬發(fā)生切分會(huì)導(dǎo)致酚類物質(zhì)在果蔬體內(nèi)累積，而甜瓜切分前MeJA處理可以促進(jìn)鮮切甜瓜酚類物質(zhì)的積累[26,28]。

鮮切甜瓜總酚含量在貯藏期間隨著貯藏時(shí)間延長而增加，切分前MeJA 處理能夠促進(jìn)鮮切甜瓜貯藏期間酚類物質(zhì)的積累（圖1）。PAL 是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它也是植物體內(nèi)合成酚類物質(zhì)的限速酶[29]。研究表明，MeJA 可通過激活果實(shí)防御系統(tǒng)，激活PAL 和過氧化物酶等植物抗性酶[24,30]。這些防御酶可通過誘導(dǎo)組織中酚類物質(zhì)、木質(zhì)素等次生代謝產(chǎn)物合成，間接提高果蔬對(duì)生物和非生物脅迫的耐受性。通過本研究發(fā)現(xiàn)，鮮切甜瓜PAL 活性隨著貯藏時(shí)間的延長呈現(xiàn)出持續(xù)增加的趨勢，且MeJA處理顯著增加鮮切甜瓜PAL 活性（圖2）；這與MeJA處理在鮮切火龍果[26]和鮮切馬鈴薯[22]貯藏研究中得到的結(jié)論一致，說明MeJA 可以通過提高PAL 活性增強(qiáng)苯丙烷代謝，導(dǎo)致果蔬酚類物質(zhì)積累。MeJA還可以通過激活PAL 等酶的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)果蔬組織中的苯丙烷代謝[13,31?32]。為了更進(jìn)一步揭示切分前MeJA 處理對(duì)鮮切甜瓜貯藏期間酚類物質(zhì)積累的分子機(jī)理，借助于課題組先前的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，探究甜瓜貯藏期間差異表達(dá)的15 個(gè)基因。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，MeJA 處理可以提高貯藏期間鮮切甜瓜8 個(gè)PAL 基因（CmPAL1/2/3和CmPAL5-9）的表達(dá)水平（圖3），這在基因水平上也驗(yàn)證了上述結(jié)論。這與Li 等[26]發(fā)現(xiàn)切分前MeJA 處理可以增加鮮切火龍果貯藏前期的HuPAL的表達(dá)水平保持一致。PAL基因在植物中的表達(dá)具有明顯組織特異性，植物體內(nèi)PAL 基因普遍由小的多基因家族組成，擬南芥PAL 亞型由AtPAL1-4基因家族編碼[33?36]。本研究發(fā)現(xiàn)貯藏期間鮮切甜瓜不同PAL 基因?qū)eJA 處理具有不同程度的響應(yīng)，也證實(shí)了PAL 可能具有多樣化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。

圖2 MeJA 處理對(duì)貯藏期間鮮切甜瓜PAL、C4H 和4CL 活性的影響Fig.2 Effect of methyl jasmonate treatment on the activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL),cinnamate 4-hydroxylase(C4H) and 4-coumarate: CoA ligase (4CL) in fresh-cut melon during storage

圖3 MeJA 處理對(duì)貯藏期間鮮切甜瓜PAL 基因表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of methyl jasmonate treatment on the gene expression level of phenylalanine ammonia-lyase in fresh-cut melon during storage

C4H 催化肉桂酸羥化作用產(chǎn)生4-香豆酸鹽，是苯丙烷途徑中繼PAL 之后的第二個(gè)關(guān)鍵酶，最近的研究表明植株受到外界刺激時(shí)能夠促進(jìn)C4H 基因的表達(dá)[37]。4CL 是苯丙烷代謝途徑流向下游的關(guān)鍵酶，在生成不同的產(chǎn)物過程中起轉(zhuǎn)折作用[38]。在鮮切火龍果[26]和鮮切馬鈴薯[22]中，均發(fā)現(xiàn)切分和MeJA處理可以協(xié)同調(diào)控PAL、C4H 和4CL 活性，誘導(dǎo)酚類物質(zhì)積累。與鮮切甜瓜貯藏期間PAL 活性變化相似，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MeJA 處理能夠顯著提高貯藏期間鮮切甜瓜C4H 和4CL 活性（圖2）。這可能是因?yàn)樵谥参锉奖榇x途徑中，C4H、4CL 可與PAL 相互協(xié)同表達(dá)，完成苯丙烷代謝后續(xù)反應(yīng)[39]。作為苯丙烷途徑中的關(guān)鍵酶，PAL、C4H 和4CL 被認(rèn)為在植物組織受到脅迫誘導(dǎo)中起重要作用，起到防御反應(yīng)并直接參與植物受傷部位酚類物質(zhì)的生物合成，以保護(hù)和治愈致傷性損傷[40]。水楊酸處理可提高金刺梨果實(shí)中苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL 和4CL 的活性，促進(jìn)金刺梨果實(shí)總酚和木質(zhì)素的積累[29]。Zhou 等[22]采用250 μmol/L MeJA 浸泡鮮切馬鈴薯塊15 min，發(fā)現(xiàn)切分后MeJA 處理也可提高PAL、C4H 和4CL 的酶活性和基因表達(dá)量，誘導(dǎo)鮮切馬鈴薯塊酚類物質(zhì)的積累。相比于PAL，C4H 在植物的不同組織中均具有較高表達(dá)量。與PAL 類似，C4H 的基因拷貝數(shù)在不同植物中也不盡相同，在擬南芥中只有1 個(gè)拷貝[41]，而苜蓿中有2 個(gè)[42]。本研究發(fā)現(xiàn)MeJA 處理刺激了貯藏期間鮮切甜瓜CmC4H1/2/4和Cm4CL1/2的表達(dá)（圖4）。這意味著C4H 和4CL 基因可以響應(yīng)MeJA 信號(hào)，在鮮切甜瓜響應(yīng)脅迫和激素信號(hào)中具有重要作用，MeJA 處理增加了鮮切甜瓜果實(shí)總酚含量也證實(shí)了這一結(jié)論。Cheng 等[43]發(fā)現(xiàn)銀杏GbC4H基因可響應(yīng)水楊酸和脫落酸信號(hào)，增加其表達(dá)量以提升銀杏抵御脅迫的能力。不同的4CL 同系物對(duì)羥基肉桂酸衍生物的偏好不同，同時(shí)4CL 基因表達(dá)模式也具有明顯差異?；蚬脖磉_(dá)分析結(jié)果顯示，擬南芥At4CL1/2/4參與木質(zhì)素合成，而At4CL3參與黃酮類物質(zhì)合成[44?45]。盡管上述鮮切甜瓜苯丙烷代謝基因表達(dá)水平與酚類物質(zhì)呈正相關(guān)，苯丙烷代謝基因如何精準(zhǔn)調(diào)控酚類物質(zhì)積累，還需進(jìn)一步探究。Li 等[26]也發(fā)現(xiàn)MeJA 可以增加鮮切火龍果HuPAL、HuC4H和Hu4CL的表達(dá)量，啟動(dòng)防御反應(yīng)，誘導(dǎo)酚類物質(zhì)積累，這一結(jié)論與本研究保持一致。汪開拓等[46]也發(fā)現(xiàn)MeJA 可誘導(dǎo)草莓PAL、4CL 和C4H活性的上升，從而有效延緩其酚類和花色苷類物質(zhì)含量的下降。結(jié)合上述研究成果，推斷鮮切甜瓜中MeJA 激活苯丙烷途徑的代謝與防御反應(yīng)的啟動(dòng)有關(guān)，而不是直接誘導(dǎo)[26]。然而MeJA 是如何啟動(dòng)果蔬防御反應(yīng)，以及和切分損傷誘導(dǎo)的ROS 等信號(hào)是如何相互作用的還需要探究[28]。

圖4 MeJA 處理對(duì)貯藏期間鮮切甜瓜C4H 和4CL 基因表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of methyl jasmonate treatment on the gene expression level of cinnamate 4-hydroxylase and 4-coumarate: CoA ligase in fresh-cut melon during storage

4 結(jié)論

綜上所述，MeJA 處理通過提高鮮切甜瓜CmPAL1/2/3、CmPAL5-9、CmC4H1/2/4和Cm4CL1/2的表達(dá)量，增加PAL、C4H 和4CL 活性，增強(qiáng)苯丙烷代謝，啟動(dòng)其防御反應(yīng)，誘導(dǎo)鮮切甜瓜貯藏期間酚類物質(zhì)的增加。但是MeJA 是如何調(diào)控這些基因的表達(dá)量，以及它們在時(shí)空表達(dá)的先后順序還未可知；這需要進(jìn)一步采用其它分子手段探究MeJA 誘導(dǎo)鮮切甜瓜酚類物質(zhì)積累的分子機(jī)理。