貟志強(qiáng) 姚婷婷 李 濤 衣雪潔

（1）沈陽體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，沈陽 110115；2）沈陽體育學(xué)院實(shí)驗(yàn)室管理中心，沈陽 110115；3）沈陽體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)與健康研究中心，沈陽 110115）

隨著肥胖的流行，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率逐年增加，目前被認(rèn)為是全球最普遍的慢性肝病之一［1-2］。NAFLD是一種進(jìn)展性肝病，最初的特點(diǎn)是單純的脂肪變性，進(jìn)而發(fā)展成非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化甚至肝細(xì)胞癌［3］。全球約25% 的成年人患有NAFLD，中國NAFLD 的總體患病率約為30%［4］。由于高發(fā)病率和潛在的嚴(yán)重危害，NAFLD 已成為重要的公共健康問題之一。但是NAFLD的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明?！岸未驌魧W(xué)說”是NAFLD 發(fā)病的經(jīng)典機(jī)制，目前將胰島素抵抗引起的肝臟脂肪變性認(rèn)為是“第一次打擊”；而活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆積導(dǎo)致的炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激被認(rèn)為是“第二次打擊”，氧化應(yīng)激在其中起著關(guān)鍵作用［5-7］。巧合的是，鐵死亡的重要特征之一也是脂質(zhì)過氧化物堆積以及抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）減少。為此一些學(xué)者開始探究鐵死亡與NAFLD的關(guān)系及其作用的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)引起鐵死亡的多種機(jī)制，也參與了NAFLD 的發(fā)生發(fā)展［3，8-9］。其中，核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2） 在鐵死亡參與NAFLD 的發(fā)展中扮演重要的角色［9-11］，本文對(duì)Nrf2、鐵死亡和NAFLD 的關(guān)系進(jìn)行梳理，總結(jié)Nrf2 通過鐵死亡調(diào)控NAFLD 的可能機(jī)制，并提出目前研究可能存在的問題，為防治NAFLD 提供了新的視野。

1 非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD） 與鐵死亡

2012 年Dixon 等［12］首次提出鐵死亡是一種新型程序性死亡，它是指由于鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化物堆積而導(dǎo)致的非凋亡形式的細(xì)胞死亡。其形態(tài)學(xué)特征區(qū)別于凋亡、壞死和自噬，主要表現(xiàn)為線粒體體積減小、膜密度增加、線粒體嵴減少或消失。已有研究表明，過度的鐵死亡與神經(jīng)退行性疾?。?3］、缺血/再灌注誘導(dǎo)的器官損傷［14］、心肌梗塞［15］和NAFLD［16］有因果關(guān)系，抑制鐵死亡可能對(duì)這些疾病起到改善效果。另外，抑制鐵死亡有助于抑制多種癌癥的發(fā)展［17］。

肝臟是鐵儲(chǔ)存、脂質(zhì)代謝的重要器官，肝細(xì)胞中鐵代謝異常和脂質(zhì)過氧化物的過度積累都會(huì)引起鐵死亡［18］。2019 年日本Minoru Tanaka 研究小組［19］首次發(fā)現(xiàn)，NASH 模型小鼠肝細(xì)胞中鐵死亡先于其他的細(xì)胞死亡。特異性抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可抑制鐵死亡的發(fā)生，減緩肝臟損傷。之后的學(xué)者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，GPX4、鐵代謝、脂質(zhì)過氧化以及一些其他途徑參與了肝臟鐵死亡的調(diào)控，改善肝臟過度鐵死亡可能成為防治NAFLD的重要方法之一。

1.1 NAFLD與鐵死亡的GPX4途徑

脂質(zhì)過氧化物堆積以及GPX4減少是鐵死亡的主要特征之一［20-21］。在正常狀態(tài)下，GPX4可通過其輔因子谷胱甘肽（glutathione，GSH），將有毒的脂質(zhì)氫過氧化物（L-OOH）轉(zhuǎn)化為無毒的脂質(zhì)醇（L-OH），從而清除脂質(zhì)過氧化物［22］。因此，抑制GPX4會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物積累，這也是鐵死亡的標(biāo)志之一［23］。但在NAFLD 的不同發(fā)展階段GPX4的變化不盡相同。

近幾年的研究顯示，肝臟單純性脂肪變性不僅有GPX4 的表達(dá)下降，同時(shí)伴隨著鐵死亡的發(fā)生，在這時(shí)增加GPX4 的表達(dá)不僅可以負(fù)向調(diào)節(jié)鐵死亡，對(duì)NAFLD 的發(fā)展也可以起到有效的抑制作用［9］。高脂飲食（HFD）的NAFLD模型或棕櫚酸/油酸（PA/OA）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞變性模型中均顯示GPX4表達(dá)降低，且發(fā)生鐵死亡［3］。肝細(xì)胞中沉默GPX4 后脂質(zhì)變性加劇，通過激活胸腺肽β4（thymosin beta 4，Tβ4）來增加GPX4 表達(dá)可抑制鐵死亡，改善NAFLD［8］。

NAFLD 得不到有效的控制，可進(jìn)展為危害性更大的NASH，但是NAFLD 如何發(fā)展為NASH 尚不清楚。不同于NAFLD，在NASH 階段，GPX4表達(dá)量顯著升高。對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行3周蛋氨酸/膽堿缺乏飲食（MCD）飲食干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟GPX4 表達(dá)顯著增加，并伴隨著鐵死亡，ROS、肝Fe（II）和總鐵增加，脂質(zhì)過氧化物合成酶酰基輔酶A 合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4 （acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）和脂氧合酶（lipoxygenase，ALOX）顯著增加，同時(shí)發(fā)生NASH［24］。另一篇使用C57BL/6 小鼠通過MCD 干預(yù)10 d 制備小鼠NASH 模型，同樣出現(xiàn)了GPX4表達(dá)量顯著升高和鐵死亡加劇的現(xiàn)象［25］。這提示，GPX4 在NASH 中升高，這與單純性脂肪肝中GPX4 下降剛好相反?？梢酝茰y(cè)，隨著NAFLD病程的加劇，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，機(jī)體為了保護(hù)細(xì)胞免受危害會(huì)做出應(yīng)激反應(yīng)，這可能是NASH中GPX4表達(dá)上升的原因，但上升的GPX4并不能完全清除過多的脂質(zhì)過氧化物，從而發(fā)生鐵死亡。

然而，造模時(shí)間的不同可能對(duì)GPX4 在NASH中的功能產(chǎn)生影響。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行MCD 飲食干預(yù)4、8、12 周，NASH 嚴(yán)重程度隨著時(shí)間的增加而增加，同時(shí)伴有GPX4的持續(xù)上升， 不同的是 GSH 升高和丙二醛（malondialdehyde，MDA）持續(xù)下降，提示鐵死亡可能受到抑制。這與之前研究中鐵死亡促進(jìn)NASH進(jìn)展相悖。作者認(rèn)為，防治NASH的進(jìn)展中，鐵死亡可能作為一種修復(fù)或抵抗調(diào)節(jié)劑來減輕NASH中的肝損傷。離體實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)人正常肝細(xì)胞（LO2）給予高游離脂肪酸（HFFA）72 h 建造的NASH 模型，在過表達(dá)GPX4 時(shí)，LO2 細(xì)胞脂質(zhì)積累增加，在使用RSL3后脂質(zhì)積累減輕，這與之前研究結(jié)果相反［26］。推測(cè)，早期NASH 中，增加GPX4 表達(dá)可抑制鐵死亡改善NASH。但這篇文章對(duì)C57BL/6小鼠MCD飲食干預(yù)4、8、12周顯著高于其他研究報(bào)道的3周和10 d，并且離體實(shí)驗(yàn)中通過HFFA對(duì)LO2細(xì)胞進(jìn)行72 h NASH造模，也顯著高于24 h PA 處理的LO2 細(xì)胞［8］。長(zhǎng)時(shí)間的NASH造?？赡軐?dǎo)致肝炎達(dá)到不可逆的程度，造成脂質(zhì)堆積持續(xù)性增加。并且文章只對(duì)離體實(shí)驗(yàn)中GPX4表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，無法驗(yàn)證在體實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)時(shí)間NASH造模后，增加GPX4 表達(dá)是否也發(fā)揮脂質(zhì)沉積的作用。這一結(jié)果需要后續(xù)研究驗(yàn)證不同造模時(shí)間對(duì)GPX4 與脂質(zhì)積累的影響。且在NASH 模型中，過表達(dá)烯醇化酶3（ENO3）會(huì)引起GPX4 表達(dá)增加，同時(shí)脂質(zhì)積累加重。有學(xué)者已證明，ENO3可加速膽固醇酯合成引起肝臟膽固醇酯積累［27］。提示ENO3 可能通過GPX4 調(diào)控了肝臟的膽固醇合成與積累，但相關(guān)研究尚淺，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

上述研究結(jié)果雖然不盡一致，但大多結(jié)果表明，GPX4 下降與鐵死亡和NAFLD 有關(guān)，升高GPX4 能抑制鐵死亡，改善NAFLD。但在不同程度的NASH狀態(tài)下，肝細(xì)胞GPX4表達(dá)增加與鐵死亡和NASH 病程的關(guān)系結(jié)果并不一致，鐵死亡在NASH發(fā)展中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

1.2 NAFLD與鐵死亡的鐵代謝途徑

鐵穩(wěn)態(tài)失衡不僅是許多疾?。▌?dòng)脈粥樣硬化、心肌病、腎缺血再灌注和神經(jīng)退行性疾病）的誘發(fā)因素之一［28］，也是NAFLD 的病因之一［29］。肝臟是機(jī)體鐵儲(chǔ)存的主要器官，對(duì)于維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)十分重要。膳食鐵在腸細(xì)胞中被血紅素加氧酶（hemeoxygenase，HO-1）降解，分解為Fe（II）、膽綠素和膽紅素。Fe（II）通過細(xì)胞膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）轉(zhuǎn)運(yùn)入血液，通過血液循環(huán)維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)。在肝細(xì)胞中，血液中的鐵通過與肝細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）結(jié)合，內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。Fe（III）在酸性環(huán)境中從轉(zhuǎn)鐵蛋白中釋放出來，通過前列腺六跨膜上皮抗原3 （six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3，STEAP3）還原為不穩(wěn)定的高反應(yīng)性Fe （II），一部分通過二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）和瞬時(shí)受體電位陽離子通道黏脂蛋白1/2（transient receptor potential mucolipin 1/2，TRPML1/2）轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體膜中，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池（labile iron pool，LIP），另一部分Fe（II）可被鐵蛋白吸收。另外，肝細(xì)胞還可以通過分泌鐵調(diào)素負(fù)反饋調(diào)節(jié)FPN 阻止鐵流出細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)中，以維持機(jī)體整體鐵穩(wěn)態(tài)。

當(dāng)機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)受到破壞時(shí)，過量的Fe（II）會(huì)導(dǎo)致鐵過載的發(fā)生，這不僅是鐵死亡的誘發(fā)因素之一，也是NAFLD的發(fā)病原因之一［29］。研究人員為證明過量的鐵離子在NAFLD中的作用，通過HFD建立NAFLD小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在小鼠肝臟中總鐵濃度無顯著變化，但Fe（II）濃度升高［9］。值得注意的是，由LIP 釋放的Fe（II）是鐵過載和芬頓反應(yīng)發(fā)生的原因之一。在發(fā)生NAFLD條件下，過量的鐵會(huì)產(chǎn)生具有氧化還原活性的非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵（nontransferrin-binding iron，NTBI），其攝取由金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（metal transporter Zip14，SLC39A14）介導(dǎo)。通常情況下，鐵儲(chǔ)存在肝臟鐵蛋白中，而鐵過載時(shí)核受體共激活因子4 （nuclear receptor coactivator，NCOA4）與鐵蛋白結(jié)合，將其輸送至溶酶體，導(dǎo)致LIP中鐵積累加劇，最終釋放大量的Fe （II）［30］。Fe （II） 與過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）反應(yīng)生成Fe（III）與羥基自由基（HO·），發(fā)生芬頓反應(yīng)［31-32］。芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的HO·攻擊膜上的多不飽和脂肪酸導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的生成增加，進(jìn)而引發(fā)鐵死亡。這提示NAFLD 中Fe（II）的增多可能是鐵死亡的重要原因［9］（圖1）。同樣Li等［24］發(fā)現(xiàn)，NASH 小鼠肝臟同樣出現(xiàn)鐵過載，通過鐵螯合劑DFO 緩解了這一現(xiàn)象，并且抑制鐵死亡，改善了NASH。以上結(jié)果表明，鐵過載引發(fā)的脂質(zhì)過氧化物增加以及鐵死亡的發(fā)生可能是導(dǎo)致小鼠發(fā)生NAFLD的重要原因，降低鐵過載可能對(duì)NAFLD的治療起到重要作用。

Fig.1 Iron metabolism in hepatocytes圖1 肝細(xì)胞中的鐵代謝

相反，有研究顯示未出現(xiàn)鐵過載情況下，也會(huì)發(fā)生鐵死亡與肝損傷。多聚胞嘧啶RNA結(jié)合蛋白1（polyr（C）binding protein 1，PCBP1）是一種多功能蛋白質(zhì)，可作為胞質(zhì)鐵伴侶，與鐵結(jié)合并轉(zhuǎn)移至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的受體蛋白［33］。LIP中95%是由PCBP1 與Fe-GSH 復(fù)合物組成，而Fe-GSH 是由GSH 通過其游離巰基直接配位Fe（II）形成［34］。有研究報(bào)道，在PCBP1 敲除小鼠中肝細(xì)胞鐵水平降低，而LIP中的具有高反應(yīng)性的鐵含量增加，其中未與PCBP1 結(jié)合的Fe（II）導(dǎo)致ROS 產(chǎn)生，在不出現(xiàn)鐵過載的情況下導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物增加，加劇脂質(zhì)變性。輔酶Q10 可逆轉(zhuǎn)PCBP1 敲除引起的ROS 增加以及肝脂肪變性［35］。因此，在肝臟中PCBP1 可能通過調(diào)控LIP，從而抑制鐵死亡改善NAFLD。

綜上所述，鐵過載是NAFLD 發(fā)生的重要原因，也是引發(fā)鐵死亡的關(guān)鍵因素。因此降低鐵過載抑制鐵死亡對(duì)于NAFLD 的發(fā)展可能起到緩解作用。另外，PCBP1 可能成為降低鐵過載的可行靶標(biāo)。

1.3 NAFLD與鐵死亡的脂質(zhì)過氧化途徑

NAFLD 的發(fā)病機(jī)制中，脂質(zhì)過氧化物積累引起的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是一個(gè)重要的因素［36］，而脂質(zhì)過氧化物積累也是鐵死亡發(fā)生的原因之一［3］。因此，脂質(zhì)過氧化可能是引發(fā)鐵死亡，導(dǎo)致NAFLD發(fā)展的關(guān)鍵因素。

脂質(zhì)過氧化物的生成是由包括花生四烯酸（arachidonic acid，AA）在內(nèi)的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs），通過ACSL4的催化下生成多不飽和脂肪酸- 輔酶A（polyunsaturated fatty acid，PUFA-CoA），隨后在溶 磷 脂 酰 膽 堿 酰 基 轉(zhuǎn) 移 酶 3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）催化下形成多不飽和脂肪酸-磷脂酰乙醇胺 （poly-unsaturated fatty acid-phosphatidyl ethanolamine，PUFA-PE），最終通過酶促或非酶促（芬頓反應(yīng)）生成脂質(zhì)過氧化物［37］。近來報(bào)道，HFD 誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠中發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 以及Fe（II）含量顯著增加，同時(shí)引發(fā)鐵死亡［9］。在NASH小鼠中，脂質(zhì)過氧化底物AA的上升是最明顯的過程之一。并在小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)鐵過載、MDA 增加以及脂質(zhì)堆積的現(xiàn)象，使用鐵死亡抑制劑后脂質(zhì)堆積與鐵過載得到改善，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 下降，NASH 程度下降［24］。上文討論過，在鐵過載時(shí)，過多的Fe（II）可能引發(fā)芬頓反應(yīng)，參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。因此，參與脂質(zhì)過氧化物生成的AA 與Fe（II）在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中可能存在協(xié)同關(guān)系，共同增加鐵死亡的發(fā)生，加速NAFLD的進(jìn)展。

ACSL4 是PUFA 生成脂質(zhì)過氧化物的關(guān)鍵酶，可將PUFA 氧化為5- 羥基二十碳四烯酸（5-hydroxyeicosatetraenoic acid， 5-HETE）。 Wei等［38］將大鼠暴露于砷，建立NASH 以及鐵死亡模型，結(jié)果顯示ACSL4 和MDA表達(dá)明顯升高。抑制ACSL4 表達(dá)后，由砷誘導(dǎo)的大鼠NASH 中5-HETE含量下降，抑制鐵死亡，緩解NASH。該研究指出，線粒體融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）在砷暴露誘導(dǎo)的肝鐵死亡上游發(fā)揮作用，同時(shí)Mfn2 可與肌醇需要酶1α （inositol-requiring enzyme 1 alpha，IRE1α）結(jié)合促進(jìn)5-HETE 產(chǎn)生，引發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致鐵死亡發(fā)生、加劇NASH。因此Mfn2/IRE1α 可能通過ACSL4 正向調(diào)控鐵死亡，加劇砷誘導(dǎo)的NASH。

綜上所述，通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和鐵死亡，可能是治療NAFLD的可行方法。

1.4 NAFLD與鐵死亡的其他誘發(fā)途徑

線粒體氧化應(yīng)激可能通過正向調(diào)控鐵死亡參與NAFLD 的進(jìn)展。線粒體氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致其功能障礙，其特征是三羧酸循環(huán)流量以及線粒體ROS 增加，增強(qiáng)的線粒體ROS 可加速肝脂肪變性，補(bǔ)充輔酶Q10 可以逆轉(zhuǎn)線粒體ROS 增加和肝脂肪變性［35］。膳食鐵過載的情況下，黃鯰魚肝臟中氧化應(yīng)激增加，脂質(zhì)過氧化物堆積，并出現(xiàn)了鐵死亡。通過MitoTEMPO（線粒體超氧化物清除劑）處理顯著降低黃鯰魚肝細(xì)胞線粒體以及細(xì)胞質(zhì)中的MDA 以及ROS，并增加Nrf2、GPX4 和GSH 等鐵死亡中抗氧化酶的活性。之后通過溴化乙錠（ethidium bromide，EB）消融肝細(xì)胞中的線粒體，在鐵過載的條件下消融線粒體，細(xì)胞ROS 并未增加，鐵死亡受到抑制［39］。這說明，鐵過載誘導(dǎo)的肝臟鐵死亡是通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致的，且線粒體氧化應(yīng)激占主要地位。 二氫乳清酸脫氫酶（dihydroorate Dehydrogenase，DHODH）是一種線粒體內(nèi)膜酶，可降低線粒體氧化應(yīng)激［40］。據(jù)報(bào)道，在GPX4 過表達(dá)或敲低的癌細(xì)胞中，抑制DHODH都可增強(qiáng)鐵死亡誘導(dǎo)劑對(duì)其的作用［41］。在線粒體中，DHODH 與GPX4 平行發(fā)揮抗氧化作用，獨(dú)立于胞質(zhì)中的GPX4［40］，這可能在NAFLD 中的鐵死亡發(fā)揮作用。綜上所述，線粒體氧化應(yīng)激對(duì)于肝臟中的鐵死亡發(fā)生十分重要，通過消除線粒體中的ROS來抑制鐵死亡可能是防治NAFLD的新手段。

近幾年的研究顯示，Nrf2 通過調(diào)控下游鐵死亡相關(guān)因子改善NAFLD中發(fā)揮重要的作用。

2 Nrf2在鐵死亡調(diào)控NAFLD中的作用

轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 是一種堿性亮氨酸拉鏈蛋白，是許多抗氧化蛋白的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。正常狀態(tài)下，Nrf2 與Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECHassociated protein 1-nuclear factor，KEAP1）結(jié)合，通過泛素-蛋白酶體途徑不斷降解，當(dāng)處于親電和氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，KEAP1 上的半胱氨酸殘基被修飾，引起KEAP1 的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，破壞了KEAP1與Nrf2 的結(jié)合，抑制了Nrf2 降解，Nrf2 進(jìn)入到細(xì)胞核中與小肌肉腱膜纖維肉瘤（small musculoaponeurotic fibrosarcoma，MAF）蛋白二聚化，促進(jìn)下游細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄［42］。

Nrf2 的下游因子已被報(bào)道在NAFLD 和鐵死亡中起到關(guān)鍵作用［43］，最新研究顯示，激活Nrf2 可以抑制NAFLD 小鼠的鐵死亡［3，9］。因此，本文重點(diǎn)討論Nrf2、鐵死亡與NAFLD 之間的聯(lián)系，探討激活Nrf2 抑制鐵死亡影響NAFLD 的發(fā)生與發(fā)展（圖2）。

Fig. 2 The mechanism of ferroptosis regulated by Nrf2 in NAFLD圖2 非酒精性脂肪肝中Nrf2調(diào)控鐵死亡的機(jī)制

2.1 Nrf2與抗氧化

Nrf2 是抗氧化系統(tǒng)中的重要轉(zhuǎn)錄因子，可靶向一系列氧化還原相關(guān)基因，對(duì)鐵死亡起到調(diào)控作用。

GPX4已被確立為Nrf2重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)靶標(biāo)［44］，在多種細(xì)胞中沉默Nrf2 均可降低GPX4的表達(dá)［45-46］。除了直接調(diào)控GPX4轉(zhuǎn)錄外，Nrf2還可以通過調(diào)控GSH 的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)GPX4 的活性。由上文可知，GPX4依靠GSH發(fā)揮抗氧化功能，因此GSH 是GPX4 的限速底物。由于參與GSH 的從頭合成的胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體（system X C-，又名SLC7A11）、γ 谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamyl cysteine synthetase，γ-GCS）和谷氨酸-半胱氨酸連接酶（glutamate-cysteine ligase，GCL）均受到Nrf2 調(diào)控。因此，Nrf2 是GSH 從頭合成的重要的調(diào)控因子［47-48］?？赏ㄟ^調(diào)控GSH 合成間接影響GPX4的抗氧化功能。在結(jié)腸炎繼發(fā)的肝損傷小鼠和四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠中，均可以通過激活Nrf2-GPX4 軸抑制肝臟鐵死亡［49-50］。且在6 周的MCD 飲食后，與野生型小鼠相比，Nrf2敲除小鼠肝臟的脂肪變性、炎癥和纖維化更為嚴(yán)重。同時(shí)Nrf2敲除小鼠肝臟中GSH水平明顯下調(diào)、脂質(zhì)過氧化物過度堆積［51］。這表明，Nrf2 可能直接或間接影響GPX4，從而抑制鐵死亡改善NASH。除此之外，Nrf2還可以通過調(diào)控鐵死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein1，F(xiàn)SP1）的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)抗氧化功能。FSP1 是一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性強(qiáng)鐵死亡抑制劑，它執(zhí)行氧化還原酶的作用通過減少輔酶Q10 增加鐵死亡抗性［52］。在鐵死亡中，F(xiàn)SP1與GPX4 平行發(fā)揮抗氧化功能［53］。有研究表明，在KEAP1 KO的肺癌細(xì)胞中，GPX4表達(dá)下降，而FSP1 表達(dá)增加，并表現(xiàn)出了鐵死亡抗性。通過染色質(zhì)免疫沉淀發(fā)現(xiàn)FSP1 的啟動(dòng)子中含有兩個(gè)Nrf2的抗氧化反應(yīng)原件（ARE）位點(diǎn)，在KEAP1 KO細(xì)胞中的Nrf2 缺失消除了KEAP1 KO 誘導(dǎo)的FSP1啟動(dòng)子-熒光素酶活性和FSP1 表達(dá)，并使KEAP1 KO 細(xì)胞對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的鐵死亡重新敏感。這表明FSP1 是Nrf2 轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，并且在GPX4 降低的情況下，Nrf2 可以通過上調(diào)FSP1 的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抗氧化功能，從而產(chǎn)生鐵死亡抗性［54］。另外，HFD誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠Nrf2 與FSP1 表達(dá)降低，ROS、MDA 和鐵離子水平升高［3］。Nrf2 通過相互獨(dú)立的GPX4 和FSP1 兩種途徑，協(xié)調(diào)發(fā)揮抗氧化、抗鐵死亡的作用。這些可能為治療NAFLD提供了一種啟示。

除上述因子外Nrf2 還可通過影響HO-1［55］或Sestrin2（Sesn2）［56］發(fā)揮抗氧化功能。由上文可知，HO-1可產(chǎn)生膽綠素/膽紅素和一氧化碳等代謝產(chǎn)物，這些代謝物可清除脂質(zhì)過氧化物使細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的攻擊［57］。目前多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明通過增加NRF2/HO-1途徑可以減緩NAFLD的發(fā)展［58-60］。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，DA 通過與NRF2 競(jìng)爭(zhēng)KEAP1，激活NRF2 下游HO-1 以及GSH 可以抗鐵死亡，改善HFD 誘導(dǎo)的NAFLD［3］。提示，Nrf2 可通過激活HO-1 發(fā)揮抗氧化作用，抑制鐵死亡改善NAFLD。Sesn2 是一種保守的抗氧化蛋白，響應(yīng)于基因毒性、代謝和氧化應(yīng)激等各種刺激，起到恢復(fù)機(jī)體平衡的作用［56］。研究表明，Nrf2可通過與Sesn2啟動(dòng)子中的ARE抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合刺激其轉(zhuǎn)錄［61-63］。Park 等［64］對(duì)原代肝細(xì)胞施加erastin（鐵死亡誘導(dǎo)劑）誘導(dǎo)其發(fā)生鐵死亡，發(fā)現(xiàn)Sesn2mRNA表達(dá)增加。為探討在鐵死亡中Sesn2升高是否由于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，作者敲除Nrf2 后發(fā)現(xiàn)鐵死亡誘導(dǎo)劑引起的Sesn2 升高消失。在刪除Sesn2啟動(dòng)子上的ARE 反應(yīng)原件后，Sesn2 表達(dá)下降。在鐵過載誘導(dǎo)的肝損傷模型中過表達(dá)Sesn2 后，Sesn2 通過降低鐵離子水平以及清除脂質(zhì)過氧化物，抑制了鐵死亡緩解肝損傷。利拉魯肽（liraglutide，LG）可通過激活Sesn2、Nrf2/HO-1 改善肥胖誘導(dǎo)的NAFLD［65］。這些結(jié)果表明，Nrf2可能通過下游HO-1、Sesn2發(fā)揮抗氧化功能，抑制鐵死亡改善NAFLD。

總而言之，Nrf2的抗氧化功能對(duì)于抑制鐵死亡起到關(guān)鍵作用，它不僅可通過直接或間接調(diào)控GPX4活性，還可以在GPX4失活時(shí)刺激FSP1轉(zhuǎn)錄或直接刺激HO-1 和Sesn2 轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抗氧化作用。因此，靶向Nrf2 可通過其抗氧化功能成為未來防治NAFLD的可行方法。

2.2 Nrf2與鐵代謝

肝臟是鐵儲(chǔ)存的重要器官，Nrf2通過調(diào)控鐵儲(chǔ)存及轉(zhuǎn)運(yùn)控制鐵代謝。鐵積累增加導(dǎo)致鐵代謝受損是鐵死亡發(fā)生的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，在NASH模型中Nrf2 敲除小鼠體內(nèi)鐵積累比正常小鼠更加明顯［51］。

肝臟中鐵主要儲(chǔ)存在鐵蛋白中，鐵蛋白重鏈（ferritin heavy chain， FTH1） 和鐵蛋白輕鏈（ferritin light chain，F(xiàn)TL）是鐵蛋白組成的一部分［66］，F(xiàn)TH1含有一個(gè)亞鐵氧化物酶活性位點(diǎn)，可以將Fe（II）氧化為Fe（II）儲(chǔ)存在鐵蛋白中，F(xiàn)TL可以控制鐵蛋白的穩(wěn)定［67］。FTH1和FTL都是已知的Nrf2 的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)［68-69］。Nrf2 可以通過促進(jìn)鐵蛋白（FTL 和FTH1）的表達(dá)來調(diào)節(jié)鐵的儲(chǔ)存，以減少鐵積累，從而減輕鐵死亡［69］。在肝癌細(xì)胞中激活Nrf2 核易位可抑制肝癌細(xì)胞的鐵死亡，沉默F(xiàn)TH1可增加肝癌細(xì)胞鐵死亡［70］。在鐵過載誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21 （fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21） 可激活Nrf2 及其下游靶基因GPX4、HO-1、FTH1 和FTL增加，通過增加抗氧化以及鐵代謝功能抑制鐵死亡，改善鐵過載誘導(dǎo)的肝損傷［71］。銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）可激活Nrf2 通過抗氧化以及鐵代謝抑制鐵死亡，改善HFD誘導(dǎo)的NAFLD，但是在激活Nrf2后FTH1表達(dá)下調(diào)［9］。究其原因，一方面可能是由激活Nrf2 的物質(zhì)（FGF21、GB）所決定，另一方面可能是由于鐵蛋白自噬導(dǎo)致。上文了解鐵蛋白自噬是維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制［72］。NCOA4 作為自噬貨物受體可以選擇性地與FTH1相互作用，將其輸送到溶酶體進(jìn)行降解，最終導(dǎo)致FTH1 結(jié)合的鐵釋放，引起細(xì)胞內(nèi)游離鐵增加［73-74］。研究報(bào)道，鐵蛋白在低鐵條件下通過自噬降解，釋放鐵離子［75］，因此HFD 可能導(dǎo)致鐵蛋白自噬，F(xiàn)TH1 降低，當(dāng)鐵過載條件下，鐵蛋白不發(fā)生自噬［75］，F(xiàn)TH1為了降低鐵過載，恢復(fù)機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)從而導(dǎo)致其表達(dá)增加?？傊?，Nrf2 可轉(zhuǎn)錄FTH1和FTL調(diào)控鐵存儲(chǔ)，改善肝臟中鐵積累，抑制鐵死亡，最終對(duì)NAFLD起到防治作用。

Nrf2不僅可以調(diào)控鐵儲(chǔ)存，還可以通過調(diào)控鐵輸出來調(diào)控鐵代謝。FPN1 可將鐵從細(xì)胞運(yùn)輸?shù)窖貉h(huán)中，以維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)［76］。FPN1的轉(zhuǎn)錄已被證明受Nrf2調(diào)控，Nrf2可通過調(diào)節(jié)FPN1的表達(dá)來影響細(xì)胞鐵流量和細(xì)胞鐵含量［77-78］。有研究表明，Nrf2/FPN1 通路通過介導(dǎo)鐵穩(wěn)態(tài)和鐵死亡發(fā)揮改善疾病的作用［79］。并且女性NAFLD 患者中FPN1 增加［80］。因此，肝臟中Nrf2/FPN1 通路可能也會(huì)通過增加鐵輸出，抑制鐵死亡達(dá)到改善NAFLD的作用。

總而言之，激活Nrf2 有望通過控制鐵儲(chǔ)存和鐵輸出降低鐵過載引起的鐵死亡，最終改善NAFLD。但目前研究多集中于Nrf2 影響鐵儲(chǔ)存改善NAFLD，而通過鐵輸出降低鐵死亡改善NAFLD尚未見報(bào)道，需要后續(xù)研究證明。

2.3 Nrf2與脂質(zhì)過氧化

抑制Nrf2 可以調(diào)控鐵死亡過程中的脂質(zhì)過氧化影響NAFLD。PUFA 既可由環(huán)境和飲食產(chǎn)生，還可通過（acetyl CoA carboxylase，ACC）產(chǎn)生，且ACC受Nrf2調(diào)控［81］。ACC是一種參與脂肪酸合成的酶，可催化乙酰輔酶A（acetyl-CoA）轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A（malonyl-CoA），而丙二酰輔酶 A是PUFA合成所必需的。研究表明，腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）可介導(dǎo)ACC 的磷酸化和失活負(fù)調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，在AMPK 基因缺失的細(xì)胞中施加ACC 抑制劑可消除AMPK 失活引起的鐵死亡［82］。另外，Nrf2 敲除小鼠的肝臟中AMPK 水平下降［83］。與之一致的，在Keap1敲除小鼠的肝臟中AMPK水平升高［84］。這說明肝臟AMPK 可能受到Nrf2 調(diào)控，且Nrf2 可能通過AMPK 間接參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，調(diào)控鐵死亡。

Nrf2 通過調(diào)控過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）參與鐵死亡過程。PPARγ對(duì)脂質(zhì)代謝至關(guān)重要［85-86］，且PPARγ 由Nrf2 轉(zhuǎn)錄［87］。鐵死亡中除ACSL4外，環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX2）同樣可催化AA生成脂質(zhì)過氧化物。在神經(jīng)元細(xì)胞中鐵死亡誘導(dǎo)劑可降低PPARγ表達(dá)，升高COX2的表達(dá)，激活PPARγ后可通過抑制COX2的表達(dá)，減弱脂質(zhì)過氧化物生成，抑制鐵死亡［88］。在原代神經(jīng)元細(xì)胞中PPARγ 激活劑增加Nrf2 與PPARγ 的表達(dá)，抑制鐵死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的鐵死亡［89］。且在HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠中，Nrf2敲除小鼠與正常小鼠相比，脂質(zhì)堆積減少，PPARγ 水平降低［90］。這說明，受Nrf2 所調(diào)控的PPARγ 可能通過參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)調(diào)控鐵死亡，影響NAFLD的進(jìn)展。

綜上所述，Nrf2 有望通過直接影響PPARγ 或通過節(jié)間影響AMPK，調(diào)控脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制鐵死亡。

2.4 Nrf2其他機(jī)制

上文可知，線粒體功能紊亂參與NAFLD 與鐵死亡中。在線粒體功能紊亂的疾病中，Nrf2 也受到抑制［91］。據(jù)報(bào)道，Nrf2 敲除小鼠的線粒體ROS明顯高于WT 小鼠［92］。而且，線粒體是細(xì)胞ROS的主要來源，同時(shí)線粒體也是產(chǎn)生腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的主要細(xì)胞器。然而，當(dāng)線粒體障礙能量代謝受損時(shí)，會(huì)激活受Nrf2 調(diào)控的AMPK，它通過限制ACC 參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，調(diào)控鐵死亡。且AMPK 失活會(huì)激活鐵死亡［82］。蘿卜硫素（glucoraphanin）［93］或一氧化碳釋放分子A1 （Carbon monoxide releasing molecule-A1，CORM-A1）［94］可激活Nrf2通過影響線粒體功能障礙改善NAFLD。這提示在NAFLD中激活Nrf2 可能通過調(diào)節(jié)線粒體功能障礙抑制鐵死亡改善NAFLD。

3 結(jié)論與展望

NAFLD 因其高發(fā)病率和潛在的危害受到廣泛關(guān)注，并與鐵死亡高度相關(guān)［19］。本文討論了鐵死亡在NAFLD 中的機(jī)制，鐵死亡通過GPX4 途徑、鐵代謝途徑、脂質(zhì)代謝途徑以及一些其他途徑參與到NAFLD 的進(jìn)程中。此外，多項(xiàng)研究表明Nrf2、鐵死亡和NAFLD存在一定聯(lián)系，Nrf2通過抑制鐵死亡可改善NAFLD［10-11］。

針對(duì)目前鐵死亡改善NAFLD 的研究，本文提出以下幾點(diǎn)思考。在NAFLD 的進(jìn)展中，GPX4 的表達(dá)在NAFLD 與NASH 中出現(xiàn)相反的結(jié)果，本文猜測(cè)這可能是機(jī)體對(duì)于升高炎癥或脂質(zhì)過氧化反應(yīng)做出的應(yīng)激反應(yīng)。而FSP1 與GPX4 均通過抗氧化功能，達(dá)到抵抗鐵死亡的目的。但FSP1在NAFLD中的研究尚淺。GPX4 與FSP1 可能均受到Nrf2 的調(diào)控。探討在NAFLD 中靶向Nrf2、GPX4 與FSP1分別有什么影響，以及是否可同時(shí)激活這兩種抗氧化途徑，以在NAFLD 中共同發(fā)揮抑制鐵死亡的功能，具有重要的意義。

由于肝臟在鐵儲(chǔ)存中的重要性，鐵過載又是NAFLD 與鐵死亡發(fā)生的重要原因，了解何種途徑降低鐵過載，抑制鐵死亡，可能會(huì)對(duì)NAFLD 的防治具有極大的幫助。但由于肝臟鐵代謝的復(fù)雜性，目前研究尚不全面，仍需進(jìn)一步的探索。例如，肝臟線粒體中鐵代謝是否參與NAFLD 的鐵死亡，鐵過載與脂質(zhì)過氧化的復(fù)雜關(guān)系，Nrf2 調(diào)控的FTH1在鐵過載以及HFD 小鼠中的表達(dá)，受Nrf2 調(diào)控的FPN1 作為人體內(nèi)唯一的鐵輸出蛋白，在NAFLD中也起到調(diào)控鐵代謝功能，但是FPN1如何通過調(diào)節(jié)鐵死亡從而調(diào)控NAFLD，對(duì)于上述問題的研究均未見報(bào)道。

另外，目前研究較少將鐵死亡中脂質(zhì)過氧化途徑的一些重要酶與NAFLD 建立關(guān)聯(lián)，如將游離不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)移到磷脂中的LPCAT3及合成脂質(zhì)過氧化物的關(guān)鍵酶等。因此，需要后續(xù)研究證明這些參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的因子是否可影響NAFLD 的進(jìn)程。

總體而言，通過Nrf2 抑制鐵死亡改善NAFLD是可行的。望后續(xù)發(fā)現(xiàn)更多與Nrf2 相關(guān)的途徑，為改善NAFLD提供幫助。