安清明 楊馳 宋興超 趙園園 陳敏 申建江 高偉

摘要：篩選貴州白山羊FHL3基因單核苷酸變異位點（SNPs），并分析基因多態(tài)性與生長性狀的關聯(lián)性，為培育貴州白山羊優(yōu)良品系提供參考依據，也為進一步研究FHL3基因生物學功能奠定基礎。通過混合池測序對116只不同地區(qū)貴州白山羊FHL3基因進行SNPs鑒定，以188只貴州白山羊進行關聯(lián)性分析。采用PopGene32.0軟件計算等位基因頻率、基因型頻率、遺傳純合度（Ho）、期望雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne），應用PIC軟件計算群體多態(tài)性信息含量（PIC），以卡方（χ2）檢驗分析基因Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；應用MINTAB軟件中的一般線性混合效應模型分析核苷酸變異與生長性狀關聯(lián)性。結果表明，貴州白山羊FHL3基因的6個檢測區(qū)域中，僅在P3區(qū)域檢測到1個核苷酸變異位點g.215 C/T，且該位點的Ho低于He，PIC檢測為中度多態(tài)，χ2檢驗結果表明，該位點偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P<0.05）。關聯(lián)分析結果表明，貴州白山羊FHL3基因g.215 C/T位點變異構成的不同等位基因和基因型在體高、體長和胸圍方面表現(xiàn)出顯著差異性（P<0.05），存在等位基因C的群體和CC基因型群體具有更高的生長優(yōu)勢。貴州白山羊FHL3基因具有一定的多態(tài)性，且g.215 C/T位點變異與體高、體長和胸圍具有顯著相關性，可作為培育貴州白山羊優(yōu)良品系的候選基因分子標記。

關鍵詞：貴州白山羊；FHL3基因；生長性狀；關聯(lián)分析

中圖分類號：S827.2? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）13-0049-05

LIM是3種轉錄因子Lin-11、Lsl-1和Mec-3的縮寫，是一類富含特征性氨基酸保守序列的蛋白超家族，該家族基因中含有一類介導轉錄因子、信號通路蛋白及細胞骨架相關蛋白之間相互作用的一個重要區(qū)域，是LIM蛋白與其他蛋白互作調節(jié)胚胎發(fā)育、細胞分化和細胞骨架形成等重要生物學功能的結構基礎［1-3］。4個半LIM結構域蛋白3基因（FHL3）屬于FHL（Four and a half LIM domain）基因家族，該家族共有5個成員，即FHL1、FHL2、FHL3、FHL4、FHL5/ACT［4］。FHL3基因的cDNA序列全長為843 bp，共編碼281個氨基酸，相對分子質量為31 181.92 ku，F(xiàn)HL3基因位于人1號染色體短臂的末端，包含6個外顯子和5個內含子［5］。FHL家族在不同組織中存在表達特異性，如FHL1在骨骼肌中表達水平最高，并參與肌球蛋白絲的合成以及肌小結的排列，F(xiàn)HL2在心臟中表達量最高，但在骨骼肌中微表達，F(xiàn)HL4和FHL5目前僅在睪丸組織中發(fā)現(xiàn)具有一定表達量［6］。較長時間，學者將研究目標主要集中于FHL1和FHL2基因上，對FHL3基因的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3也主要在骨骼肌中表達，但在心肌中表達匱乏［7］。FHL3蛋白可通過和肌動蛋白（actin）結合負向調控肌動蛋白成束，且在遷移的成肌細胞中，過表達FHL3可增加并誘導應力纖維解聚［8］。Han等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3是衛(wèi)星細胞向成肌細胞肌管分化和融合的負調控因子，Cottle等研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3可負向調控肌肉發(fā)育、損害MYOD基因的轉錄活性，從而抑制肌細胞分化過程［9-10］。Zhang等研究也發(fā)現(xiàn)，在生肌過程中FHL3蛋白能與CREB蛋白互作形成復合體，通過介導CREB基因的轉錄促進MyHCⅡα的表達，進而抑制MyoD基因的轉錄活性［11］。以上研究表明，F(xiàn)HL3是調節(jié)骨骼肌分化、生成及細胞結構的重要調控基因。

在畜牧生產中，研究發(fā)現(xiàn)豬FHL3基因在第2外顯子處第313堿基處存在1個A/G錯意突變，且該突變與豬的肉質性狀和眼肌面積具有顯著相關［12-13］。亦有研究表明，F(xiàn)HL3基因表達量與豬肉的肉質評價指標具有一定關聯(lián)性，如豬肉的肌肉色澤、吸水力、pH值、肌肉嫩度、肌內脂肪含量等［14-15］。在羊中，張鑫通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因是影響寒泊羊肉品質和產肉量的重要候選基因［16］。課題組前期通過轉錄組測序也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因是影響貴州白山羊生長和產肉量的重要候選基因［17］。但目前，在畜牧生產中關于FHL3基因變異與生產性狀關聯(lián)分析的研究極少，山羊中更鮮見研究報道，鑒于FHL3基因是動物生產性狀關聯(lián)的重要候選基因，因此，本研究擬分析FHL3基因的核苷酸變異及其與貴州白山羊生長性狀的關聯(lián)性，以期能夠篩選出可用于指導貴州白山羊生長性狀遺傳改良的分子標記位點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年2—6月在銅仁學院貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室完成。課題組2021年6月至2022年2月收集貴州白山羊試驗數(shù)據，其中，貴州省銅仁市德江縣2家養(yǎng)殖合作社36只、沿河縣2家養(yǎng)殖合作社42只、遵義市務川縣3家養(yǎng)殖合作社38只，共116只白山羊血液用于多態(tài)性檢測，以銅仁市沿河縣、遵義市務川縣2家養(yǎng)殖合作社的188只貴州白山羊（2周歲齡及以上）作為研究對象用于生長性狀關聯(lián)分析。所有山羊頸靜脈采血約5.0 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用于測定生長性狀的所有羊在禁食24 h后，測定個體的生長性狀數(shù)據，包括體質量、體高、體長、胸圍。采用試劑盒提?。ū本┨旄萍加邢薰荆〥NA，所有DNA -20 ℃保存?zhèn)溆?。其中，用于多態(tài)性檢測的116個樣本DNA用TE調整至相同濃度，每管DNA取5 μL制成混合DNA，以備后續(xù)PCR混合池測序篩選核苷酸變異位點。

1.2 引物的設計與PCR擴增

根據GenBank山羊的FHL3基因序列（登錄號：NC_030810.1），采用Primer Premier 5.0軟件設計6對引物，包括FHL3基因的5′UTR區(qū)，外顯子區(qū)、內含子區(qū)和3′UTR區(qū)，引物位置詳見圖1，不同引物序列信息見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應體系為25.0 μL，其中，DNA模板1.0 μL，上下游引物各1.25 μL，2 Master Mix試劑12.5 μL，滅菌超純水9.0 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（各引物退火溫度見表1），72 ℃延伸60 s，37 個循環(huán)；最后延伸10 min。待反應結束后，4 ℃冰箱保存。PCR產物上樣于1.5%的瓊脂糖凝膠，120 V電壓條件下電泳15 min，在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察試驗結果。將目的條帶清晰的PCR產物樣品純化后送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 數(shù)據統(tǒng)計及分析

利用Lasergene中的MegAlign程序進行序列比對并判定基因型；利用PopGene 32.0計算等位基因頻率、基因型頻率、遺傳純合度（Ho）、期望雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne），平衡χ2檢驗；利用PIC軟件計算群體多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）。應用MINTAB（Version 16，Minitab Inc.，Pennsylavania）一般線性混合效應模型（General Liner Mixed-effect Models，GLMMs）評估特定等位基因的存在/缺失、基因型是否對貴州白山羊生長性狀存在影響。

對某一特定基因性狀進行存在、缺失分析模型中，等位基因或基因型、性別、年齡為固定因素，遵從下列模型進行最小二乘方差分析：

Yijmn=μ+Gi+Cj+Fm+Xn+eijmn。

其中，Y為相應性狀，μ為群體均值，Gi為年齡效應，Cj為性別效應，F(xiàn)m為基因型、等位基因效應，Xn為因素間互作效應，eijknm為隨機誤差。所有結果均采用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 貴州白山羊FHL3基因核苷酸變異分析

以貴州白山羊混合DNA為模板擴增6段FHL3基因片段，由測序結果（圖2）可知，引物P1、P2、P4、P5和P6擴增目的片段基因中未發(fā)現(xiàn)核苷酸變異位點，但在P3引物擴增片段中發(fā)現(xiàn)1處變異，為g.215 C/T突變。

2.2 貴州白山羊FHL3基因多態(tài)性分析

對188份貴州白山羊進行多態(tài)性分析，結果（表2）表明，F(xiàn)HL3基因P3片段中g.215處存在1處核苷酸變異位點，形成等位基因T和C，其頻率分別為47.07%、52.93%；構成3種基因型，分別是TT、CT、CC，其頻率分別21.28%、51.60%、27.13%；多態(tài)信息含量表明，該位點雜合度高于純合度，且屬于中度多態(tài)（0.25

2.3 山羊FHL3基因變異與生長性狀關聯(lián)性分析

在FHL3基因P3片段上鑒定出的2個等位基因C和T，兩者頻率均>5%，可用于生長性狀關聯(lián)分析。等位基因存在與缺失分析結果（表3）表明，等位基因對成年白山羊體質量影響不顯著（P>0.05），而對白山羊體高、體長和胸圍均有顯著影響（P<0.05），且存在等位C的群體生長性狀均顯著高于缺失群體；基因型關聯(lián)分析結果（表4）表明，CC基因型的群體在體高、體長和胸圍3個生長性狀中均顯著高于TT型群體，因此等位基因C可作為貴州白山羊生長性狀的優(yōu)勢標記基因。

3 討論

貴州白山羊是著名的地方白山羊品種之一，是貴州當前群體數(shù)目最大的山羊品種，是發(fā)展貴州畜牧業(yè)的重要種質資源。但存在個體小、生長速度慢、飼料轉化率低缺點，嚴重限制了白山羊產業(yè)的發(fā)展，因此，本研究以前期轉錄組測序篩選出與貴州白山羊生長相關候選基因FHL3為研究對象，分析其遺傳變異及對貴州白山羊生長性能的影響。目前，已有部分學者對FHL3進行了一定的研究，如Cottle等研究表明，F(xiàn)HL3基因在骨骼肌中表達最為顯著［10］。李文濤采用轉基因小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因對不同肌纖維類型形成的存在一定影響［18］。許海洋對轉FHL3基因小鼠骨骼肌進行分析，結果表明高度表達FHL3基因能夠促進肌肉量增多，且FHL3基因可能對肌肉損傷修復、肌萎縮造成的肌肉消瘦起到一定的修復作用［19］。Meeson等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3能夠協(xié)助性調節(jié)肌原細胞群和骨骼肌再生，且發(fā)現(xiàn)FHL3和SOX15在調節(jié)肌肉的數(shù)量和骨骼肌的再生中共同發(fā)揮作用［20］。從已有研究來看，F(xiàn)HL3能與其他基因互作參與肌細胞的分化調節(jié)、骨骼肌的形成等相應的生物學過程，而骨骼肌是影響動物生長性狀的一個重要因素，因此本研究針對FHL3基因變異對山羊生長性狀的影響具有理論支持。

本研究采用PCR擴增直接測序法，在不同群體白山羊中篩選FHL3基因變異位點，在所選取的6個目的片段中僅發(fā)現(xiàn)1個變異位點，且該位點PIC為中度多態(tài)水平，表明該基因在群體內的多態(tài)水平具有進一步提升的空間。家畜的遺傳多態(tài)性是長期選擇與進化的結果，豐富的多態(tài)性有利于進化的多向性，是人工選擇和育種的基因基礎。已有研究表明，貴州白山羊在多種與生長相關的基因中均有不同程度的多態(tài)性，表明貴州白山羊具有很好的選育潛能［21-24］。χ2檢驗結果表明，該位點處于 Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)，這可能是群體在養(yǎng)殖過程中，自然或人工選擇導致的結果。而貴州白山羊在養(yǎng)殖過程中自繁自育情況較嚴重，這也是可能是導致群體多態(tài)性不高，變異位點處于偏離 Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)的一個原因。

在家畜生產中，有關FHL3基因的研究報道較少，僅有報道主要針對豬的生產性狀。Zuo等研究發(fā)現(xiàn)，豬FHL3基因第2外顯子上存在的A/G突變對眼肌面積和肉質性狀具有重要影響［12-13］。亦有研究發(fā)現(xiàn)FHL3基因與豬肉的色澤、吸水力、嫩度、肌內脂肪含量等性狀具有一定影響［14-15］。但目前在山羊中未見相關報道，筆者所在研究團隊前期對不同體質量的貴州白山羊進行轉錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因是影響山羊生長的重要候選基因。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因g.215 C/T突變白山羊體高、體長和胸圍均有顯著影響，但未發(fā)現(xiàn)與體質量具有顯著相關。研究發(fā)現(xiàn)，胸圍是影響山羊體質量的直接因素，體高、體長是影響山羊體質量的間接因素［25］。本研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因核苷酸變異對胸圍、體高和體長均有顯著影響，但卻對體質量影響差異不顯著，在生產實際中，體尺和胸圍性狀通常與群體體質量呈正相關，而在本研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因變異與體質量相關性不顯著，但在不同基因型分析中發(fā)現(xiàn)，CT型群體的體質量值最高，因此推測，等位基因C和T可能在體質量上存在互作影響，雜合型群體的體質量較純合型高。另外本研究選取研究對象均為成年個體，體尺指標在后續(xù)養(yǎng)殖過程中變化不大，貴州牧區(qū)的白山羊養(yǎng)殖主要以半舍飼為主，且白山羊的生長速度較為緩慢，本研究結果表明，F(xiàn)HL3基因變異對體質量影響不顯著，可能是觀測群體育肥效應還未達期望值，表明后期養(yǎng)殖群體還具有很好的育肥增質量空間。但在FHL3基因不同基因型關聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)，基因型CC的群體在體高、體長和胸圍3個體尺性狀中均顯著高于TT型群體，因此FHL3基因可作為貴州白山羊生長性狀的遺傳標記基因，值得進一步擴大樣本進行深入研究。

4 結論

本研究在不同地區(qū)貴州白山羊FHL3基因中6個不同區(qū)域發(fā)現(xiàn)，1個核苷酸變異位點g.215 C/T，且該變異位點與貴州白山羊的體高、體長和胸圍生長特征顯著相關，存在等位基因C的群體和CC基因型群體具有更好的生長優(yōu)勢。

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