張宏宏 林洋 許文雅 郁蕉竹 劉瀛 王韻

【摘要】本文選用汽水、果凍、糖果、糕點(diǎn)彩妝四類(lèi)食品為研究對(duì)象，應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)建立食品中甜菜紅色素的檢驗(yàn)方法，并對(duì)所建立方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限、回收率、精密度等特性參數(shù)的方法學(xué)驗(yàn)證，以期為甜菜紅色素的國(guó)家食品安全檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法；甜菜紅；pH值；回收率

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.04.022

Determination of Beet Red Pigment in Food by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Honghong， LIN Yang， XU Wenya， YU Jiaozhu， LIU Ying， WANG Yun

（Shenyang Institute of Food and Drug Inspection， Shenyang 110122， China）

Abstract： This article selects four types of food， namely soda， jelly， candy， and makeup on pastries， as the research objects. High performance liquid chromatography technology is used to establish an inspection method for beet red pigment in food. The established method is validated with specific parameters such as standard curve， detection limit， quantitative limit， recovery rate， and precision， in order to provide scientific basis for the establishment of national food safety detection standards for beet red pigment.

Key words： high performance liquid chromatography； beet red pigment； pH value； recovery rate

甜菜紅色素是一種水溶性含氮類(lèi)色素，主要存在于紅甜菜（俗稱紫菜頭）、商陸、火龍果、紫茉莉、雞冠花及仙人掌屬的某些植物體中，是優(yōu)良的食用紅色色素和黃色色素來(lái)源[1]。

甜菜紅色素作為一種天然的食用色素，具有著色力強(qiáng)、安全無(wú)毒、對(duì)人體無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)[2]。此外，甜菜紅還具有抗氧化和清除自由基的生理功能[3-4]。由此可見(jiàn)，甜菜紅色素是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的天然紅色素，未來(lái)天然甜菜紅色素是不可或缺的純綠色食品添加劑。

目前，我國(guó)對(duì)甜菜紅色素的常用檢測(cè)方法主要是分光光度法、薄層色譜法（TCL）等。分光光度法操作較簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是不能排除復(fù)雜樣品中其他色素成分的干擾，誤差較大，靈敏度較低；TCL法測(cè)定過(guò)程復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)，不易定量，精密度差[5]。高效液相色譜法（HPLC）由于其本身具有自動(dòng)化程度高、分離效能好、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)，更適合復(fù)雜成分的分離、分析。但我國(guó)對(duì)食品中甜菜紅色素含量的HPLC檢測(cè)方法尚未制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。因此，我國(guó)需建立一個(gè)檢測(cè)限低、易于操作使用并推廣、代表國(guó)家水平且與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)接軌的甜菜紅色素分析方法[6]。

采用高效液相色譜法分離測(cè)定甜菜紅色素已有報(bào)道[7-11]，但該方法存在梯度洗脫、過(guò)程煩瑣等缺點(diǎn)。本文應(yīng)用高效液相色譜儀對(duì)食品中甜菜紅色素的分析方法進(jìn)行探索研究，確定食品中甜菜紅色素的最佳提取條件及色譜條件，同時(shí)對(duì)已確立的方法進(jìn)行校準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限、回收率、精密度等特性參數(shù)的方法學(xué)驗(yàn)證，以期為建立快速、準(zhǔn)確的食品中甜菜紅色素的高效液相色譜檢測(cè)方法提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器、試劑與材料

1.1儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（配PDA2998檢測(cè)器）；BSA323S型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；渦旋混合器IKA MS3 digital；KQ250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；H750R高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；FW100不銹鋼高速攪拌器：天津市泰斯特儀器有限公司；0.45μm水相濾膜：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2試劑

乙腈（CH3CN）、甲酸（HCOOH）、磷酸（H3PO4）：色譜純，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3材料

選用市售汽水、果凍、糖果、糕點(diǎn)彩妝四類(lèi)食品為研究對(duì)象。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)品

甜菜紅：上海源葉生物科技有限公司（CAS：7659-95-2，純度≥96%），或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取甜菜紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0 mg，用水溶解并定容至10 mL，充分搖勻，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，貯存于密閉的棕色玻璃瓶中，于4℃條件下保存期為1個(gè)月。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)系列工作液

根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需要配制甜菜紅標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2樣品的制備與提取

2.2.1汽水

設(shè)置數(shù)控超聲波清洗儀溫度在25℃以下，在此條件下對(duì)汽水樣品進(jìn)行超聲處理20 min。稱取處理后的樣品1.00 g于50 mL離心管中，加入5 mL水，渦旋混勻，超聲提取10 min，于8000 r/min條件下離心3 min，取上清液。重復(fù)上述提取過(guò)程一次，合并上清液并用水定容至10 mL。提取液經(jīng)0.45μm水相濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

2.2.2果凍（含膠基果凍除外）

使用不銹鋼高速攪拌器對(duì)果凍樣品粉碎處理后進(jìn)行目標(biāo)物質(zhì)提取，提取操作同2.2.1。

2.2.3糖果（含膠基果凍除外）

使用研缽將糖果樣品粉碎研磨處理后進(jìn)行目標(biāo)物質(zhì)提取，提取操作同2.2.1。

2.2.4糕點(diǎn)彩妝

準(zhǔn)確稱取1.00 g試樣于50 mL具塞離心管中，加入正己烷5 mL，在≤25℃超聲波清洗儀中超聲處理5 min，然后加入5 mL體積濃度為1%的氨水溶液，再加入乙醇1 mL，渦旋混勻后于≤25°C超聲波清洗儀中超聲處理5 min，然后加入亞鐵氰化鉀溶液1 mL和乙酸鋅溶液1 mL，渦旋混勻后在8000 r/min條件下離心5 min，然后棄去有機(jī)相，水相轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，殘?jiān)貜?fù)上述操作再提取一次后，合并上清液并定容至10 mL后上機(jī)測(cè)定（制備好的樣品于4℃條件下保存，保存時(shí)間不超過(guò)3 d。膠基糖果、果凍樣品的溶解溫度通常需要在50°C以上，而甜菜紅在50°C條件下易發(fā)生降解且降解程度隨著溫度的升高而增加，因此本方法不包括膠基糖果、果凍樣品的檢測(cè)）。

2.3色譜條件

1）色譜柱：Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)λ：530 nm；柱溫：35℃。

2）進(jìn)樣量：20μL；流動(dòng)相A為0.1%磷酸水溶液，B為乙腈。

3結(jié)果與分析

3.1提取條件的優(yōu)化選擇

甜菜紅色素是水溶性含氮類(lèi)色素，易溶于水，不溶于無(wú)水的有機(jī)溶劑，如乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、丙二酮、石油醚和乙酸等[12]。本文選用水作為提取溶劑，比較分析汽水、果凍、糖果、糕點(diǎn)彩妝四類(lèi)食品在不同pH值水溶液下的提取效率。具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在pH=7的中性條件下甜菜紅提取率最高。汽水、果凍、糖果、糕點(diǎn)彩妝四類(lèi)食品在此條件下的提取率分別為：101.6%、106.8%、101.7%、99.9%。目標(biāo)物質(zhì)提取較完全，滿足實(shí)驗(yàn)要求，因此選擇水作為提取溶劑。

3.2色譜條件的優(yōu)化選擇

比較分析梯度洗脫及等度洗脫條件下甜菜紅的譜圖特征。梯度洗脫條件見(jiàn)表2。此條件下甜菜紅（0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液）色譜圖（λ=530 nm）見(jiàn)圖1。等度洗脫條件為流動(dòng)相A（0.1%磷酸水溶液）+流動(dòng)相B（乙腈）=92+8，此條件下甜菜紅（0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液）色譜圖（λ=530 nm）見(jiàn)圖2。

由圖1、圖2色譜圖可以看出：在梯度洗脫及等度洗脫條件下，甜菜紅及其異構(gòu)體均能達(dá)到很好的分離度，均能滿足實(shí)驗(yàn)條件要求。但梯度洗脫較為煩瑣，因此本實(shí)驗(yàn)選用等度洗脫的色譜分離條件。

3.3線性關(guān)系考察及檢出限、定量限測(cè)定

3.3.1線性關(guān)系

配制甜菜紅標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。甜菜紅及其異構(gòu)體分別表示為甜菜紅1、甜菜紅2。首先采用面積歸一化法確定兩個(gè)峰的百分比，再根據(jù)百分比計(jì)算兩個(gè)峰對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)濃度。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，在0.05～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，甜菜紅1的線性回歸方程為：Y=1.86e2X+9.92e，線性相關(guān)系數(shù)r為0.9998；甜菜紅2的線性回歸方程為：Y=1.92e2X-1.22e2，線性相關(guān)系數(shù)r為0.9999。甜菜紅1、甜菜紅2線性相關(guān)系數(shù)均≥0.99，線性關(guān)系良好，滿足標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》[13]對(duì)校準(zhǔn)曲線的要求。

3.3.2方法檢出限與定量限

1）方法檢出限。在空白汽水、果凍、糖果、糕點(diǎn)彩妝四類(lèi)食品基質(zhì)中添加不同量的甜菜紅標(biāo)準(zhǔn)品，按2.2方法進(jìn)行樣品制備及前處理，并對(duì)上述加標(biāo)樣品進(jìn)行HPLC測(cè)定。信噪比（S/N）約為3時(shí)測(cè)得的四類(lèi)樣品中目標(biāo)物質(zhì)濃度分別為：15.006、14.626、14.825、14.887 mg/L，對(duì)應(yīng)到四類(lèi)樣品中甜菜紅質(zhì)量濃度分別為：0.150、0.146、0.148、0.149 g/kg，因此以0.15 g/kg來(lái)作為方法檢出限。

2）定量限。在空白汽水、果凍、糖果、糕點(diǎn)彩妝四類(lèi)食品基質(zhì)中添加不同量的甜菜紅標(biāo)準(zhǔn)品，按2.2方法進(jìn)行樣品制備及前處理，并對(duì)上述加標(biāo)樣品進(jìn)行HPLC測(cè)定。信噪比（S/N）約為10時(shí)測(cè)得四類(lèi)樣品中目標(biāo)物質(zhì)濃度分別為：49.079、48.632、48.631、49.055 mg/L，對(duì)應(yīng)到四類(lèi)樣品中甜菜紅質(zhì)量濃度分別為：0.491、0.486、0.486、0.491 g/kg，因此以0.50 g/kg來(lái)作為定量限。

3.4回收率及精密度試驗(yàn)

3.4.1回收率

分別稱取飲料、果凍、糖果、糕點(diǎn)彩妝空白基質(zhì)1.00 g，添加甜菜紅標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中目標(biāo)物質(zhì)含量分別為0.5、1.0、5.0 g/kg，每類(lèi)食品進(jìn)行三水平六平行的加標(biāo)試驗(yàn)。按2.2方法進(jìn)行樣品制備、前處理后進(jìn)行HPLC測(cè)定。

3.4.2精密度

選用3.4.1回收率試驗(yàn)中的加標(biāo)樣品進(jìn)行精密度試驗(yàn)，每個(gè)濃度進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定。三水平加標(biāo)樣品測(cè)得的回收率平均值及精密度結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出：三個(gè)加標(biāo)水平下，四類(lèi)樣品所得回收率均在95%～105%之間；添加濃度為0.5 g/kg時(shí)測(cè)得精密度均<5.3%；添加濃度為1.0 g/kg及5.0 g/kg時(shí)測(cè)得精密度均<3.8%。綜上，四類(lèi)樣品的三水平加標(biāo)試驗(yàn)所得回收率及精密度均滿足GB/T 27404—2008對(duì)回收率及精密度的要求。

4討論

4.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在紫外-可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)，每種物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光線具有不同的吸收能力。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)主成分在流動(dòng)相中的紫外吸收譜圖來(lái)確定檢測(cè)波長(zhǎng)。甜菜紅及其異構(gòu)體在530 nm處有最大吸收峰，且無(wú)溶劑干擾（甲醇的紫外吸收波長(zhǎng)在205 nm以下），故選擇530 nm作為甜菜紅的檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2提取試劑及色譜條件的選擇

本研究比較分析了不同pH（1、3、5、7、9、11）條件下目標(biāo)物質(zhì)的提取率。測(cè)試結(jié)果表明：采用中性水溶液提取時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)提取率最高，提取較完全，故選水作為最終的提取溶劑。同時(shí)，比較分析了梯度洗脫及等度洗脫條件下目標(biāo)物質(zhì)的色譜特征。測(cè)試結(jié)果表明：兩種色譜條件均可達(dá)到試驗(yàn)要求，但考慮試驗(yàn)的簡(jiǎn)便性，故采用等度洗脫方法。

4.3方法學(xué)驗(yàn)證

本研究的方法學(xué)驗(yàn)證參照GB/T 27404—2008附錄F檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求進(jìn)行，內(nèi)容包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性、方法檢測(cè)限、定量限、精密度、準(zhǔn)確度（回收率）。結(jié)果表明：所建立的高效液相色譜分析方法準(zhǔn)確性高，適合于食品中甜菜紅的定性及定量檢測(cè)。

5結(jié)論

本方法在進(jìn)行甜菜紅色素檢測(cè)時(shí)在曲線的線性、方法檢出限、定量限、精密度，準(zhǔn)確度等方面均能滿足日常檢測(cè)工作的需要。該方法前處理簡(jiǎn)單、試劑易得，且采用了等度洗脫方法，分析時(shí)間短、靈敏度高，可用于食品中甜菜紅含量的測(cè)定。同時(shí)，高效液相色譜法還具有自動(dòng)化程度高、樣品用量小、分離效能高、無(wú)熱分解的危險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)，能較好地分離檢測(cè)熱不穩(wěn)定的甜菜紅色素。該方法適合在日常檢測(cè)工作中推廣應(yīng)用。

【參考文獻(xiàn)】

[1]藺定運(yùn).食用色素的識(shí)別與應(yīng)用[M].北京：中國(guó)食品出版社，1987.

[2]熊勇.甜菜紅色素的制備及其穩(wěn)定性的研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2011.

[3]PEDRENO M A，ESCRIBANO J.Studying the oxidation and the antiradical activity of betalain from beetroot[J]. Journal of Biological Education，2000，35（1）：49-51.

[4]KANNER J，HAREL S，GRANIT R. Betalains-A New Class of Dietary Cationized Antioxidants[J]. Agricultural and Food Chemistry，2001，49（11）：5178-5185.

[5]孫世萍，代斌，洪成林.高效液相色譜法測(cè)定甜菜紅色素[J].食品科學(xué)，2006（2）：215-217.

[6]孫世萍.高效液相色譜法檢測(cè)甜菜紅色素的方法研究[D].石河子：石河子大學(xué)，2006.

[7]JOSE A. FERNANDEZ L A，LUIS A B. Application of high-performanceliquidchromatographytothe characterization of the betalain pigments in prickly pear fruits-ScienceDirect[J]. Journal of Chromatography A，2001，913（1/2）：415-420.

[8]SCHLIEMANN W，CAI Y，DEGENKOLB T，et al. Betalains of Celosia argentea[J].Phytochemistry，2001，58（1）：159-165.

[9]CAI Y，SUN M，SCHLIEMANNET W，et al. Chemical stability and colorant properties of betaxanthin pigments from Celosia argentea[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2001（9）：49.

[10] SCHOEFS B.Determination of pigments in vegetables[J]. Journal of chromatographyA，2004，1054（1/2）：217-226.

[11] STRACK D，VOGT T，SCHLIEMANN W. Recent Advances in Betalain Research[J].Phytochemistry，2003，62（3）：247-269.

[12]郝秀梅.甜菜紅色素的分離純化及抗氧化與抗疲勞活性的研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2011.

[13]實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)：GB/T27404—2008[S].

【作者簡(jiǎn)介】

張宏宏，女，1987年出生，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)。

（編輯：李加鵬）