周賢豪 謝幼專

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨礦物質(zhì)密度降低和骨微結(jié)構(gòu)退化為特征的骨病,導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)提高,由骨吸收和骨形成不平衡導(dǎo)致[1]。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要見于絕經(jīng)后女性,約占2/3,因卵巢功能退化,雌激素分泌減少引起;65歲以上人群,由衰老相關(guān)引起[2]。在未來20年里,隨著人口老齡化,世界上65歲以上的人口將超過4.5億,骨質(zhì)疏松癥特別是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的患病率將進(jìn)一步擴(kuò)大,其社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響已引起廣泛關(guān)注[3]。雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松以高骨量轉(zhuǎn)化為特點(diǎn),破骨活性顯著增加,成骨活性減弱,骨吸收超過骨形成,導(dǎo)致凈骨丟失[4]。目前臨床上用于治療骨質(zhì)疏松的常用藥物,如雙膦酸鹽只能單純抑制破骨吸收,無法促進(jìn)成骨,而特立帕肽主要用于促進(jìn)成骨活性,無破骨抑制功能,且長(zhǎng)期使用這些藥物不良反應(yīng)較大,如高鈣血癥、惡性腫瘤等[5]。因此尋找既能促進(jìn)成骨,又能抑制破骨的安全有效藥物是目前抗骨質(zhì)疏松治療的研究重點(diǎn)。

尿石素A是一種天然化合物,由腸道菌群通過代謝鞣花單寧和鞣花酸產(chǎn)生,鞣花酸是石榴、漿果和堅(jiān)果等食物中富含的復(fù)合多酚且生物利用度很低[6]。尿石素A作為一種具有有益作用的強(qiáng)效藥劑而備受關(guān)注。既往研究發(fā)現(xiàn),尿石素A具有減輕結(jié)腸炎、心肌損傷、神經(jīng)保護(hù)等抗炎、抗氧化、抗凋亡作用[7～9]。近年來研究表明,尿石素A能增強(qiáng)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,促進(jìn)骨缺損修復(fù)[10]。越來越多的證據(jù)也表明,腸道菌群的代謝調(diào)節(jié)與骨穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)[11]。然而目前缺乏尿石素A對(duì)于破骨細(xì)胞的研究。因此,本研究擬探討尿石素A對(duì)骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow derived macrophages, BMMs)體外破骨細(xì)胞分化的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:尿石素A購(gòu)自美國(guó)Selleck公司;胎牛血清購(gòu)自澳大利亞VWR公司;α-MEM培養(yǎng)基和胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)購(gòu)自美國(guó)R&D公司;CCK-8試劑盒和2×SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX)購(gòu)自美國(guó)Bimake公司;TRAP染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;4%多聚甲醛和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司、胰蛋白酶購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司;PrimeScriptTMRT Master Mix購(gòu)自日本TaKaRa公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

2.BMMs細(xì)胞提取:4 ～ 6周齡C57BL/6J雄性小鼠,購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬) 2013-0016;使用許可證號(hào):SYXK(滬) 2018-0026]。麻醉處死小鼠后浸泡于75%乙醇中消毒15min。在超凈工作臺(tái)中剔除軟組織分離得到股骨和脛骨,減去骨組織兩端暴露骨髓腔,1ml注射器吸取含30ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔至發(fā)白,收集于10cm培養(yǎng)皿中,37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天全換液,棄去未貼壁細(xì)胞和殘留組織,即為原代BMMs細(xì)胞。之后2天換液1次,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%左右時(shí),胰酶消化并重懸用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖毒性:將BMMs以8×103個(gè)/孔的密度種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后,加入含M-CSF(30ng/ml)和濃度梯度的尿石素A(0、4、8、16、32、64μmol/L)培養(yǎng)基,分別在培養(yǎng)48、96h后。每孔替換成含10μl CCK-8試劑的110μl培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱避光孵育2h后,使用酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值,650nm為參照。計(jì)算相對(duì)增殖率,將48h的對(duì)照組細(xì)胞設(shè)為100%。

4.抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色:將BMMs以1×104個(gè)/孔的密度種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后。替換為含M-CSF(30ng/ml)、RANKL(50ng/ml)和不同濃度尿石素A(0、4、8μmol/L)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化,每2天換1次液,至第5天鏡下觀察到多核破骨細(xì)胞形成時(shí)。棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基,PBS洗滌3遍,加入4%多聚甲醛固定15min后,棄去固定液,PBS洗滌3遍。加入TRAP染色液37℃避光染色1h,棄去染色液,PBS洗滌。使用光學(xué)顯微鏡拍照,Image J軟件計(jì)數(shù),細(xì)胞核大于3個(gè)的TRAP陽性細(xì)胞為破骨細(xì)胞。

5.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量:將BMMs以2×105個(gè)/孔的密度種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,加入含M-CSF(30ng/ml)、RANKL(50ng/ml)和不同濃度尿石素A(0、4、8μmol/L)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)破骨分化。5天后使用Trizol法提取總RNA。Nanodrop測(cè)定RNA濃度,使用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將得到的cDNA 2μl和2×SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) 5μl、引物每個(gè)0.4μl、ddH2O 2.2μl充分混合后,在QuantStudio 6熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。以β-actin作為參照,用法來計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平,引物序列詳見表1。

6.DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞活性氧:將BMMs以1×105個(gè)/孔的密度種于共聚焦皿中,待細(xì)胞貼壁后,加入含M-CSF(30ng/ml)、RANKL(50ng/ml)和不同濃度尿石素A(0、4、8μmol/L)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)24h后,棄去培養(yǎng)基,每個(gè)皿中加入1∶1000無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA溶液,培養(yǎng)箱避光孵育20min,無血清培養(yǎng)基洗滌3次。在共聚焦顯微鏡下觀察熒光情況并拍照。

結(jié) 果

1.尿石素A對(duì)BMMs的增殖毒性:CCK-8法分別檢測(cè)不同濃度尿石素A孵育48h和96h后的BMMs細(xì)胞活性,結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,當(dāng)尿石素A在高濃度(32、64μmol/L)時(shí),對(duì)BMMs細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用(100.0%±5.0% vs 82.4%±1.6%,P=0.005,100.0%±5.0% vs 79.8%±4.1%,P=0.006,圖1),低濃度下則沒有明顯的細(xì)胞毒性。因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中擬用最高的尿石素A濃度為8μmol/L,不會(huì)對(duì)BMMs產(chǎn)生細(xì)胞毒性而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 不同濃度尿石素A對(duì)BMMs的增殖毒性A.B分別為小鼠BMMs 48h和96h的CCK-8活性檢測(cè)(相對(duì)于48h的0μmol/L組)。與0μmol/L組比較,*P<0.01

2.尿石素A抑制BMMs向破骨細(xì)胞形成:TRAP染色可見BMMs在RANKL作用下分化形成紫紅色、體積大的多核破骨細(xì)胞(圖2A)。而在不同濃度的尿石素A(4、8μmol/l)作用下,誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞受到抑制(圖2中B、C),且TRAP染色陽性的成熟破骨細(xì)胞數(shù)目(28.333±3.786個(gè) vs 12.333±1.528個(gè),P=0.002,28.333±3.786個(gè) vs 8.000±2.000個(gè),P=0.001,圖2D)與面積(1.000±0.207 vs 0.031±0.007,P=0.001,1.000± 0.207 vs 0.017±0.003,P=0.001,圖2E)均顯著下降,高濃度8μmol/L組較低濃度4μmol/L組抑制效果更為明顯(12.333±1.528個(gè) vs 8.000±2.000個(gè),P=0.041,0.031±0.007 vs 0.017±0.003,P=0.025,圖2中D、E)。

3.尿石素A能抑制破骨分化相關(guān)基因表達(dá):RT-qPCR法檢測(cè)BMMs在RANKL和不同濃度尿石素A培養(yǎng)5天后的破骨基因分化情況,結(jié)果顯示,在尿石素A作用下,破骨分化相關(guān)基因組織蛋白酶K(cathepsin K, CTSK)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9, MMP9)等基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著下降(圖3,P<0.01),但無明顯濃度相關(guān)性。

圖3 BMMs在RANKL和不同濃度尿石素A誘導(dǎo)后的基因相對(duì)表達(dá)量A.C-FOS;B.CTSK;C.MMP9;D.ACP5。與0μmol/L組比較,*P<0.01。C-FOS. 原癌基因Fos; ACP5. 耐酒石酸酸性磷酸酶5

4.尿石素A抑制分化過程中活性氧產(chǎn)生:在RANKL誘導(dǎo)分化下,DCFH-DA檢測(cè)BMMs顯示,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了大量ROS(圖4A),適當(dāng)水平的ROS有利于破細(xì)胞骨形成。在尿石素A的作用下,ROS表達(dá)水平明顯下降(圖4中B、C),且高濃度8μmol/L組較低濃度4μmol/L組抑制效果更好。

圖4 DCFH-DA檢測(cè)RANKL和不同濃度尿石素A處理后BMMs的ROS表達(dá)情況(×100)A.RANKL+尿石素A 0μmol/L;B.RANKL+尿石素A 4μmol/L;C.RANKL+尿石素A 8μmol/L

結(jié) 果

破骨細(xì)胞骨吸收增強(qiáng),成骨活性減弱是絕經(jīng)后導(dǎo)致骨質(zhì)快速流失的主要原因。因此,抑制破骨細(xì)胞分化從而抑制骨吸收,同時(shí)能促進(jìn)成骨活性增加是一種有效的骨質(zhì)疏松治療方法。破骨細(xì)胞來源于造血干細(xì)胞,在M-CSF和RANKL的共同作用下從前體細(xì)胞分化為多核的成熟破骨細(xì)胞,進(jìn)一步分泌CTSK、MMP和H+吸收降解骨基質(zhì)[12]。多項(xiàng)研究表明,ROS在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成過程中產(chǎn)生,并參與破骨細(xì)胞分化和骨吸收[13]。ROS和破骨細(xì)胞生成的異常參與了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展。許多抗氧化劑,如乙酰半胱氨酸、番茄紅素和姜黃素,已被證明可以通過降低ROS來抑制破骨細(xì)胞的形成和骨吸收[12, 13]。通過調(diào)節(jié)不平衡的ROS產(chǎn)生可能成為未來治療破骨細(xì)胞相關(guān)疾病的目標(biāo)。

既往研究發(fā)現(xiàn),尿石素A具有促進(jìn)成骨活性功能,本實(shí)驗(yàn)使用了具有破骨分化潛力的小鼠BMMs,CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),尿石素A具有良好的生物相容性,在安全劑量范圍內(nèi)(8μmol/L)對(duì)BMMs無明顯細(xì)胞毒性[10]。進(jìn)一步用RANKL誘導(dǎo)BMMs向破骨細(xì)胞分化,并使用尿石素A處理,TRAP染色基本沒有觀察到成熟的破骨細(xì)胞形成,提示尿石素A能明顯抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化。通過RT-qPCR法檢測(cè)破骨相關(guān)基因C-FOS、CTSK、MMP9、ACP5在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá),進(jìn)一步從分子水平上證實(shí)了尿石素A對(duì)破骨分化的抑制作用。ROS在破骨細(xì)胞分化過程中起到第二信使作用[13]。尿石素A處理可以明顯降低RANKL誘導(dǎo)分化過程中的ROS水平升高。而氧化應(yīng)激是激活破骨細(xì)胞增強(qiáng)骨吸收的機(jī)制之一[14]。綜上所述,體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了尿石素A抑制破骨細(xì)胞分化的作用,為其治療骨質(zhì)疏松提供了理論依據(jù)。

然而破骨細(xì)胞分化過程中涉及多種通路,其中MAPKs、NF-κB通路是RANKL誘導(dǎo)破骨分化的主要信號(hào)通路[15]。ROS也能進(jìn)一步激活核因子κB(nuclear factor-κB ligand, NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MPAKs)通路,隨后活化的T淋巴細(xì)胞胞質(zhì)核因子1(nuclear factor of activated t-cells, cytoplasmic 1, NFATc1)的轉(zhuǎn)錄被上調(diào),TRAP和CTSK等酶的表達(dá)增加,促進(jìn)了破骨細(xì)胞的形成,并最后發(fā)生骨吸收[12, 14]。尿石素A能抑制破骨細(xì)胞分化,但其具體機(jī)制和作用靶點(diǎn)本研究未開展,也缺乏體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),這是本研究的不足之處。

綜上所述,本研究證實(shí)了尿石素A可在無細(xì)胞毒性的情況下有效抑制體外BMMs向破骨細(xì)胞分化,這可能是通過調(diào)控ROS水平來實(shí)現(xiàn)的。后續(xù)擬將進(jìn)一步研究尿石素A作用于NF-κB等信號(hào)通路的情況,并在動(dòng)物水平驗(yàn)證尿石素A對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用,為其作為潛在的治療藥物提供理論依據(jù)。