李巖松 王 凱 李鐘鳴 劉先玲 丁胤彰 孫 燕 馬文杰 許 迪

急性心肌梗死作為一種缺血性心臟病,具有極高的致殘率和病死率。每年全球大約有1600萬人死于急性心肌梗死引起的心力衰竭[1]。目前,我國心血管病發(fā)生率正處于持續(xù)上升階段。據(jù)推算,全國約有3.3億人患有心臟病,其中冠心病患病人數(shù)達(dá)到了1139萬。自2005年以來,我國急性心肌梗死病死率呈快速上升趨勢,2005年我國城鄉(xiāng)地區(qū)急性心肌梗死病死率分別為42.1/10萬和22.2/10萬,而2018年我國城鄉(xiāng)地區(qū)急性心肌梗死病死率則達(dá)到了120.18/10萬和128.24/10萬[2]。吸煙、肥胖、高血壓、高血脂、糖尿病等作為急性心肌梗死的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素,已被廣大群眾所重視。近些年,越來越多的研究表明,腸道菌群在人類心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[3]。良好的腸道菌群環(huán)境不僅可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝、抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激、調(diào)控免疫應(yīng)答等途徑緩解動(dòng)脈粥樣硬化,有效降低急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn),減少急性心肌梗死后不良事件的發(fā)生,還可以通過改善血壓、抑制心肌纖維化、改善心臟重構(gòu)發(fā)揮心臟保護(hù)作用[3～5]。

Klotho(KL)是一種抗衰老基因,最早于1997年在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[6]。研究表明,小鼠體內(nèi)KL水平升高可以延長小鼠壽命,改善認(rèn)知功能,同時(shí)能有效預(yù)防心臟病、腎臟病、血管鈣化、氧化應(yīng)激,而KL缺乏的小鼠則表現(xiàn)出明顯的衰老體征,如壽命短、生長發(fā)育遲緩、脊柱后凸、血管鈣化、骨質(zhì)疏松、認(rèn)知障礙、多器官萎縮等[6,7]。人類的KL基因位于13號染色體上,長約50kb,由5個(gè)外顯子組成,在預(yù)防心血管疾病,特別是維持心臟和血管功能方面發(fā)揮著重要作用。KL能預(yù)防心肌肥大,改善心肌重塑,防止血管鈣化和動(dòng)脈粥樣硬化。因此調(diào)節(jié)血漿中KL水平及其在心肌細(xì)胞中的表達(dá)對于改善細(xì)胞代謝、維持心功能和預(yù)防某些疾病至關(guān)重要[8]。但KL對急性心肌梗死后小鼠腸道菌群及心功能的影響目前鮮有報(bào)道。本研究通過建立小鼠急性心肌梗死模型,應(yīng)用16S rDNA測序技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技術(shù),比較分析了KL治療的急性心肌梗死后小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化及相關(guān)心力衰竭指標(biāo)的差異。

材料與方法

1.動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):本實(shí)驗(yàn)方案按照美國國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health, NIH)指南進(jìn)行,并經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號:IACUC-2102002)。24只體質(zhì)量為20～25g的6周齡雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠重組Klotho蛋白(貨號:1819-KL-050)購自美國R&D Systems公司。所有動(dòng)物均在22～24℃溫度下飼養(yǎng),每天光暗循環(huán)12h,能自由飲食飲水。適應(yīng)1周后,7只小鼠接受假急性心肌梗死手術(shù),17只小鼠接受急性心肌梗死手術(shù)。急性心肌梗死手術(shù)按如下方法進(jìn)行:用戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉小鼠,在第2、3肋間打開胸腔,暴露心臟,用7-0縫合線結(jié)扎左前降支(left anterior descending artery, LAD)。假手術(shù)組小鼠進(jìn)行相同操作,但不結(jié)扎LAD。術(shù)后第2天,假手術(shù)組小鼠全部存活,手術(shù)組小鼠存活14只。將小鼠分為以下3組:假手術(shù)組小鼠為對照組,手術(shù)組小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為心梗組和KL組,每組各7只。KL組小鼠每兩天腹腔注射1次KL(20ng/kg),對照組和心梗組小鼠按相同方法腹腔注射0.9%氯化鈉溶液(15ml/kg),共計(jì)4周[9]。4周后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。

2.樣本收集及16S rDNA測序:術(shù)后第30天每組均存活7只小鼠,處死小鼠,收集1粒腸道內(nèi)糞便置于凍存管,-80℃冰箱保存,隨后進(jìn)行測序(由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成)。收取小鼠心臟,剪去心房及右心室,收集心梗組與KL組梗死周圍區(qū)域心肌組織及對照組左心室心肌組織置于4℃ 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)中清洗,后置于-80℃冰箱凍存[10]。選取E.Z.N.A.?StoolDNA提取試劑盒,按照試劑盒說明書提取糞便DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量,同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對DNA進(jìn)行定量。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)對序列進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物由AMPure XT beads (美國Beckman Coulter Genomics公司)純化,Qubit(美國Invitrogen公司)定量,擴(kuò)增子文庫的大小和數(shù)量分別在Agilent2100生物分析儀(美國Agilent公司)和Illumina(Kapa Biosciences,美國Woburn公司)的文庫定量試劑盒上進(jìn)行評估。在NovaSeq PE250平臺上對庫進(jìn)行測序。

3.生物信息分析:樣品在Illumina NovaSeq平臺上按照制造商的建議進(jìn)行測序,由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司提供。根據(jù)樣品獨(dú)特的條形碼,將配對端序列分配給樣品,并將建庫引入的barcode和引物序列去除。使用FLASH合并匹配端序列并讀取。根據(jù)fqtrim(v0.94),在特定的過濾條件下對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾,以獲得高質(zhì)量的clean標(biāo)簽。使用Vsearch軟件(v2.3.4)對嵌合序列進(jìn)行過濾。利用DADA2進(jìn)行解調(diào),得到特征表和特征序列。使用SILVA以及NT-16S數(shù)據(jù)庫做物種分類及后續(xù)分析,根據(jù)feature注釋結(jié)果和各樣品feature特征表,獲得界、門、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表,本研究主要在門、屬兩個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)分析菌群結(jié)構(gòu)。

4.BNP、TNF-α和TGF-β1mRNA表達(dá)水平的測定:將凍存的心肌組織置于組織研磨器中,加入500μl TRIzol提取總RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技術(shù)檢測。使用RT-qPCR引物,引物序列依次為:BNP上游引物:5′-GAGGTCACTCCTATCCTCTGG-3′,下游引物:5′-GCCATTTCCTCCGACTTTTCTC-3′;TNF-α上游引物:5′-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3′,下游引物:5′-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3′;TGF-β1上游引物:5′-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3′,下游引物:5′-CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC-3′;GAPDH上游引物:5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游引物:5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′[11]。

結(jié) 果

1. α多樣性分析:α多樣性是指一個(gè)特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的物種多樣性情況,主要用來反映物種豐富度、均勻度以及測序深度。本實(shí)驗(yàn)主要選取了Chao1、Shannon、Simpson等指數(shù)來反映各個(gè)樣本菌群的豐富度和均勻度。在本實(shí)驗(yàn)中,各樣本的稀釋曲線趨于平緩,說明測序深度已足夠(圖1)。對組間α多樣性指數(shù)Chao1、Shannon、Simpson進(jìn)行比較,繪制小提琴圖,進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn),結(jié)果顯示,各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖1 各樣本的稀釋曲線

圖2 α多樣性指數(shù)Chao1、Shannon、Simpson的小提琴圖

2.β多樣性分析:β多樣性是指不同環(huán)境群落之間的物種差異性。本實(shí)驗(yàn)通過主成分分析(principal component analysis, PCA)對3組小鼠進(jìn)行了β多樣性分析,從圖中可以看出心梗組與KL組在菌群結(jié)構(gòu)上存在明顯的差異(圖3)。二維未加權(quán)主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA)則表明心梗組與另外兩組菌群輪廓存在明顯分離(圖4)。

圖3 3組間主成分分析(PCA)

圖4 3組間二維未加權(quán)PCoA分析

3.物種分析:在門水平上,3組小鼠菌群主要由擬桿菌門、厚壁菌們、變形菌門、Epsilonbacteraeota菌門和疣微菌門組成,其中擬桿菌門和厚壁菌門所占比例較大。與對照組比較,心梗組小鼠厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)豐度值降低,兩組間Epsilonbacteraeota菌門相對豐度比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.826)。與心梗組比較,KL組小鼠F/B豐度值升高,Epsilonbacteraeota菌門相對豐度增高。本實(shí)驗(yàn)中,3組間變形菌門和疣微菌門相對豐度比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5、表1)。在屬水平上,各組小鼠主要菌群為Muri菌、毛螺菌科NK4A136菌屬、杜氏桿菌、幽門螺桿菌等。從圖6中可以看出,與對照組比較,心梗組小鼠Muri菌相對豐度增高,毛螺菌科NK4A136菌屬相對豐度降低。與心梗組比較,KL組小鼠Muri菌明顯減少,毛螺菌科NK4A136菌屬略微增加。與另外兩組比較,KL組小鼠杜氏桿菌、幽門螺桿菌和乳酸桿菌相對豐度明顯增高,3組小鼠嗜黏蛋白阿克曼菌屬、嗜膽菌屬、Muribaculum菌、擬桿菌屬和另枝菌屬相對豐度比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 小鼠腸道菌群門水平主要物種豐度差異情況(相對豐度

表2 小鼠腸道菌群屬水平主要物種豐度差異情況(相對豐度

4.心力衰竭相關(guān)指標(biāo)分析:與對照組比較,心梗組小鼠BNP、TNF-α和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平明顯升高,左心室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)降低(P<0.05);與心梗組比較,KL組小鼠BNP、TNF-α和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平明顯降低,左心室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)升高(P<0.05),詳見圖7。

討 論

目前,腸道菌群和急性心肌梗死間的關(guān)系受到人們廣泛關(guān)注。有研究認(rèn)為,急性心肌梗死后由于腸道灌注不足、腸道屏障功能受損以及通透性增加,導(dǎo)致腸道細(xì)菌及其代謝物移位進(jìn)入體循環(huán),從而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)最終促進(jìn)不良心血管事件的發(fā)生[12,13]。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組大鼠比較,急性心肌梗死的大鼠回腸微絨毛排列雜亂、粗糙、無光澤,腸絨毛上皮細(xì)胞廣泛脫落,小腸Chiu評分明顯高于假手術(shù)組。近年來,應(yīng)用抗生素、益生菌、微生物酶抑制劑等調(diào)節(jié)腸道菌群、保護(hù)腸黏膜已逐漸成為治療急性心肌梗死后心力衰竭的新方向[15]。KL作為一種抗衰老蛋白,對心臟的保護(hù)作用已被越來越多的研究證實(shí),而其對腸道菌群的影響至今仍無相關(guān)報(bào)道。本研究基于16S rDNA測序技術(shù),探討了KL對急性心肌梗死小鼠腸道菌群的影響,為KL的臨床應(yīng)用提供了新的思路。

許多疾病都可以對腸道菌群產(chǎn)生影響,其共同特點(diǎn)是條件致病菌增加而益生菌減少[16,17]。在本研究中,3組小鼠腸道菌群均以擬桿菌門和厚壁菌門為主,而發(fā)生急性心肌梗死后,擬桿菌門的相對豐度顯著提高,厚壁菌門的相對豐度則明顯減少,這一結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致[14,18]。有研究表明,厚壁菌能將食物中纖維轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸,后者是腸黏膜細(xì)胞主要的能量來源之一。厚壁菌相對豐度的提高有利于腸黏膜細(xì)胞的能量供應(yīng),保護(hù)腸道屏障功能,阻止菌群移位及機(jī)體炎性反應(yīng)的發(fā)生[19]。杜氏桿菌是近些年才被鑒定并命名的一種新菌屬,近年來有研究提出,杜氏桿菌擁有調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、降低肥胖小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇、提高腸道免疫力和提高機(jī)體抗炎能力的功效,這一發(fā)現(xiàn)或?qū)?yīng)用于疾病的預(yù)防和治療[20,21]。乳酸桿菌是一種常見的益生菌,動(dòng)物研究表明,乳酸桿菌可以顯著縮小冠脈結(jié)扎大鼠的心肌梗死面積,改善心功能[22]。近年來,一項(xiàng)針對15例冠心病患者的研究發(fā)現(xiàn),額外補(bǔ)充乳酸桿菌不僅能有效改善血管內(nèi)皮功能,并且具有良好的抗炎作用,其主要降低了血漿中瘦素、IL-8、IL-12水平[23]。在本研究中,KL組厚壁菌、杜氏桿菌和乳酸桿菌相對豐度明顯高于心梗組,雖然3組間乳酸桿菌相對豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但其在熱圖上已呈現(xiàn)出明顯差異,這可能與樣本量不足有關(guān),后續(xù)研究會(huì)加大樣本量。

另外,本研究結(jié)果顯示,KL組幽門螺桿菌(屬Epsilonbacteraeota門)相對豐度顯著高于另外兩組。近年來,幽門螺桿菌對心血管疾病的影響成為研究熱點(diǎn)。盡管目前有研究表明幽門螺桿菌感染可能是心肌梗死的危險(xiǎn)因素之一,但兩者之間的關(guān)系仍存在爭議,有Meta分析否認(rèn)了兩者間的關(guān)聯(lián)[24～26]。一項(xiàng)大型前瞻性研究表明,幽門螺桿菌感染和缺血性心臟病病死率之間亦無明顯聯(lián)系。本研究比較了3組小鼠相關(guān)心力衰竭指標(biāo),發(fā)現(xiàn)KL可以有效降低急性心肌梗死后BNP、TNF-α和TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平,逆轉(zhuǎn)急性心肌梗死后左心室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)的降低。上述結(jié)果表明,經(jīng)過KL治療,急性心肌梗死小鼠的心功能得到了一定的改善。因此,KL組小鼠幽門螺桿菌的改變是否會(huì)對小鼠的心功能產(chǎn)生遠(yuǎn)期影響仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,KL能顯著改善急性心肌梗死小鼠的腸道菌群紊亂,促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌的生長,同時(shí)能改善心功能,這為KL的應(yīng)用提供了新的思路和依據(jù)。