郝穎艷 靳玉川 張 建 杜 鵑 張展翅 耿丹丹 韓 碩 黃玉哲 李 媛□ 樊 平△

（1 唐山市工人醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，唐山 063000；2 河北醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，石家莊 050017）

運(yùn)動(dòng)衰退是機(jī)體衰老的標(biāo)志性事件之一[1-2]。黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能體系（nigrostriatal dopaminergic system，NSDAs）衰退與運(yùn)動(dòng)功能衰退密切相關(guān)[3-4]。衰老伴隨NSDAs酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（dopamine transport，DAT）表達(dá)下降[5-6]，同時(shí)，衰老過(guò)程中NSDAs中多巴胺（dopamine，DA）的含量也下降[7]。近年來(lái)的研究顯示，紋狀體、黑質(zhì)區(qū)DA 的含量，也能很好反映機(jī)體的運(yùn)動(dòng)功能狀態(tài)[8-9]。有報(bào)道指出，帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）患者在紋狀體DA 完全耗竭的情況下，運(yùn)動(dòng)行為缺陷仍在持續(xù)進(jìn)展，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)的衰退與黑質(zhì)DA 的含量下降密切相關(guān)[10-11]。表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）是一個(gè)包含53 個(gè)氨基酸的多肽，是DA 神經(jīng)元的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[12-14]。研究報(bào)道，剛出生大鼠給予外源性EGF 可使NSDAs 中TH 和DAT 的表達(dá)升高[13，15]；給予新生大鼠EGF 受體抑制劑，可減少NSDAs 中TH 和DAT 的表達(dá)[13]。本課題組之前的研究顯示，EGF 可提高中年大鼠紋狀體DA 的含量[16]，但對(duì)老年大鼠TH 和DAT 的表達(dá)以及DA 含量的影響未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)皮給予老年大鼠EGF，探討EGF對(duì)老年大鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性，NSDAs 中TH 和DAT的表達(dá)以及DA 含量的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠抗 TH 單克隆抗體（Sigma，T2928），小鼠抗 β-actin 單克隆抗體（Santa Cruz，CA；sc-47778）多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品（DA，H8502-5G，純度＞98%，批號(hào)BCBG8676V），二羥基苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（DOPAC，850217-1G，純度＞99%，批號(hào)1451791V），高香草酸標(biāo)準(zhǔn)品（HVA，H1252-250MG，純度＞98%，批號(hào)061M1233V），均購(gòu)自Sigma 公司；對(duì)乙酰氨基酚（內(nèi)標(biāo)，IS，純度＞99%，批號(hào)：100018-200408，中國(guó)食品藥品檢定所）；乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）、乙酸銨（色譜純）均購(gòu)自迪馬公司。健康雄性SD 大鼠36 只，鼠齡分別為6 月齡和24 月齡，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為成年組（6 月組）、老年組（24月組）和老年EGF 處理組（24 月-EGF 組），每組12只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食水，室溫恒定（22℃±2℃），12 h 亮黑（早6 點(diǎn)開燈）循環(huán)。

1.3 經(jīng)皮給予外源性 EGF

實(shí)驗(yàn)方法參照Iwakura 等方法[13]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉，常規(guī)碘伏消毒背部皮膚，做2 cm寬橫切口。將EGF（0.1 mg/mL；HigetaSyoyu，Chiba，Japan）的Azlet 真空泵（model 2002；AzlaCoip.Palo Alto，CA，USA）沿背部皮膚切口送至肩部皮下并埋于其中，縫合傷口，碘伏消毒。將含0.9%生理鹽水的真空泵埋入肩部皮下作為對(duì)照。所有動(dòng)物7 d 后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.4 曠場(chǎng)試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法參照本課題組前期的方法[16]，將大鼠放置由長(zhǎng)×寬×高為 100 cm×100 cm×40 cm的無(wú)蓋立方形裝置中，記錄大鼠靜止聞嗅行為、探索行為、運(yùn)動(dòng)行為和理毛行為參數(shù)。

1.5 取材

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠斷頸處死，迅速取出腦組織，并參照以前文獻(xiàn)取出黑質(zhì)和紋狀體（尾殼核）[17]。將各組分別取出6 個(gè)腦組織的黑質(zhì)用于實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)。剩下的6 個(gè)腦組織，左側(cè)黑質(zhì)和紋狀體（尾殼核）用于免疫印跡檢測(cè)，右側(cè)黑質(zhì)和紋狀體（尾殼核）用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)TH mRNA 和DAT mRNA 的表達(dá)

TRIzol 一步法提取RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度和A260/280 比值。TH 上游引物5′-CCCC ACCTGGAGTATTTTGTG-3′，下游引物5′-ATCAC GGGCGGACAGTAGACC-3′；DAT 上游引物5′-AG CTACCATGCCCTATGTGG-3′，下游引物5′-ATCC ACACAGATGCCTCACA-3′；內(nèi)參β-actin 上游引物5′-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3′，下游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGA TG-3′。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件95℃，10 min；95℃，15 s；58℃，20 s；72℃，27s。擴(kuò)增產(chǎn)物由融合曲線分析確認(rèn)。

1.7 免疫印跡檢測(cè)TH 和DAT 的表達(dá)

將黑質(zhì)和紋狀體（尾殼核）組織塊置于RIPA裂解液中，4℃冰上裂解2 h；4℃離心，12 000 r/min，20 min，取上清液測(cè)蛋白濃度；等量總蛋白上樣，4%濃縮膠恒壓90 V、10%分離膠恒壓120 V 電泳，恒流300 mA 轉(zhuǎn)膜1 h；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 稀釋小鼠抗TH 單克隆抗體（1∶1 000，Sigma；T2928）、兔抗 DAT 多克隆抗體（1∶1 000，Millipore，Temecula，CA；AB2231）、小鼠抗 β-actin 單克隆抗體（1∶1 000，Santa Cruz，CA；sc-47778），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 清洗3 次，IRDye800CW 熒光素表達(dá)的二抗（1∶10 000；Rockland）室溫孵育1 h，Odyssey 雙色紅外激光成像儀掃描。以β-actin 作為內(nèi)參，用目的蛋白與內(nèi)參條帶的吸光度比值進(jìn)行結(jié)果分析。

1.8 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析DA 的含量

將取出的黑質(zhì)和紋狀體（尾殼核）組織塊按5 μL/mg 加入80%乙腈（含0.1%甲酸）溶液，勻漿，冰水浴超聲5 min，4℃離心（14 000 r/min）10 min，取上清液100 μL 至離心管中，依次加入20 μL 內(nèi)標(biāo)（對(duì)乙酰氨基酚，400 μg/mL），20 μL 80%乙腈（0.1%甲酸），渦流混旋2 min，14 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液100 μL 至自動(dòng)進(jìn)樣小瓶，進(jìn)樣20 μL 進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）分析，記錄色譜圖。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有參數(shù)以±s表示。采用SPSS 12.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，首先通過(guò)Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)和Levene's 檢驗(yàn)方法分別檢驗(yàn)正態(tài)性和方差齊性。如果正態(tài)性（P＞0.1）和方差齊性（P＞0.1）均滿足時(shí)，采用單因素方差分析，兩組之間多重比較采用Student-Newman-Keuls 檢驗(yàn)。如果正態(tài)性（P＞0.1）和（或）方差齊性（P＞0.1）不滿足，采用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05 后兩組之間多重比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGF 對(duì)老年大鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)行為參數(shù)的影響

2.1.1 靜止聞嗅行為 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6 月、24 月和24 月-EGF 3 組間大鼠靜止聞嗅行為存在明顯不同（P＜0.01）。與 6 月組相比，24 月組老年大鼠靜止聞嗅行為降低了51.90%（P＜0.01），EGF 處理使老年大鼠靜止聞嗅行為上升47.37%（P＜0.01），但沒(méi)有達(dá)到6 月組水平（P＜0.01）（圖1）。

圖1 EGF 對(duì)老年大鼠靜止聞嗅行為的影響

2.1.2 探索行為 大鼠的探索行為包括行走中間聞嗅行為、前腿倚靠四壁直立行為、前腿未倚靠四壁直立行為和聞嗅行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6 月、24月和24 月-EGF 3 組間行走中間聞嗅行為（P＜0.01）、前腿倚靠四壁直立行為（P＜0.01）、前腿未倚靠四壁直立行為（P＜0.01）和聞嗅行為（P＜0.01）4 種行為的次數(shù)存在顯著差異。與 6 月組相比，24 月組老年大鼠行走中間聞嗅行為、前腿倚靠四壁直立行為、前腿未倚靠四壁直立行為和聞嗅行為分別降低了73.20%（P＜0.01）、59.42%（P＜0.01）、62.86%（P＜0.01）、55.04%（P＜0.01），EGF 處理使老年大鼠上述4 種行為的次數(shù)上升119.23%（P＜0.01）、71.43%（P＜0.01）、76.92%（P＜0.01）、46.55%（P＜0.01），但未達(dá)到6 月組水平（P＜0.01）（圖2）。

圖2 EGF 對(duì)老年大鼠探索行為的影響

2.1.3 運(yùn)動(dòng)行為 大鼠的運(yùn)動(dòng)行為參數(shù)包括垂直運(yùn)動(dòng)、水平運(yùn)動(dòng)和總徑長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6 月、24 月和24 月-EGF 3 組間大鼠垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)（P＜0.01）、水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)（P＜0.01）和總徑長(zhǎng)（P＜0.01）存在顯著差異。與 6 月組相比，24 月 組老年大鼠垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)、水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)和總徑長(zhǎng)分別降低了56.98 %（P＜0.01）、51.70%（P＜0.01）、58.32%（P＜0.01），EGF 處理使老年大鼠上述指標(biāo)分別上升62.34 %（P＜0.01）、42.72%（P＜0.01）、33.91%（P＜0.01），但沒(méi)有達(dá)到6 月組水平（圖3）。

圖3 EGF 對(duì)老年大鼠運(yùn)動(dòng)行為的影響

2.1.4 理毛行為 大鼠的理毛行為包括理毛潛伏期、理毛次數(shù)和理毛持續(xù)時(shí)間。6 月、24 月和24月-EGF 3 組間大鼠間理毛潛伏期（P＜0.01）、理毛次數(shù)（P＜0.01）和理毛持續(xù)時(shí)間（P＜0.01）存在顯著差異。與 6 月組相比，24 月組老年大鼠理毛潛伏期上升了312.50%（P＜0.01），理毛次數(shù)和理毛持續(xù)時(shí)間分別降低了62.96%（P＜0.01）和51.57%（P＜0.01）。EGF 處理后理毛潛伏期下降了18.42%（P＜0.01），理毛次數(shù)和理毛持續(xù)時(shí)間分別上升了31.25%（P＜0.01）和30.51%（P＜0.01），但未達(dá)到6 月組水平（P＜0.01）（圖4）。

圖4 EGF 對(duì)老年大鼠理毛行為的影響

2.2 EGF 對(duì)老年大鼠NSDAs 中TH 和DAT 表達(dá)的影響

2.2.1 TH mRNA和DAT mRNA的表達(dá) 6月、24月和24月-EGF 3組間TH mRNA（P＜0.01）和DAT mRNA（P＜0.01）存在顯著差異。與6月組相比，24月組老年大鼠黑質(zhì)處TH mRNA和DAT mRNA的相對(duì)表達(dá)降低了48.53%（P＜0.01）和51.81%（P＜0.01），EGF處理后 TH mRNA和DAT mRNA的表達(dá)分別上升27.18%（P＜0.01）和38.30%（P＜0.01），但未達(dá)到6月組水平（P＜0.01）（圖5A、圖5B）。

圖6 EGF 對(duì)老年大鼠黒質(zhì)和尾殼核內(nèi)DA 含量的影響

2.2.2 老年大鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元TH 和DAT 表達(dá) 6 月、24 月和24 月-EGF3 組大鼠間黑質(zhì)處TH（P＜0.01）和DAT（P＜0.01）以及紋狀體（尾殼核）處TH（P＜0.01）和DAT （P＜0.01）與β-actin 免疫印跡條帶相對(duì)吸光度比值均存在顯著差異。24 月組老年大鼠黑質(zhì)處的TH 和DAT 的相對(duì)表達(dá)與6 月組相比分別降低了57.80%（P＜0.01）和59.02%（P＜0.01），尾殼核處TH 和DAT 的相對(duì)表達(dá)與6月組相比分別降低了53.45%（P＜0.01）和60.73%（P＜0.01）。EGF 處理后，24 月-EGF 組大鼠黑質(zhì)處TH 和DAT 的相對(duì)表達(dá)比24 月組提高了63.85%（P＜0.01）和91.53%（P＜0.01）；紋狀體（尾殼核）處TH 和DAT 的相對(duì)表達(dá)比24 月組提高了66.89%（P＜0.01）和50.45%（P＜0.01），但均未恢復(fù)到6 月組水平（P＜0.01）（圖5C～圖5F）。

2.3 EGF 對(duì)老年大鼠NSDAs 中DA 含量的影響

6 月、24 月和24 月-EGF3 組大鼠間黑質(zhì)處DA含量（P＜0.01）和紋狀體（尾殼核）處DA 含量（P＜0.01）存在顯著差異。24 月組老年大鼠黑質(zhì)處DA的含量比6 月組降低了41.85%（P＜0.01）。EGF 處理后，24 月-EGF 組黑質(zhì)處DA 的含量與24 月組相比提高了47.78%（P＜0.01），但未恢復(fù)到6 月水平（P＜0.01）。24 月組老年大鼠紋狀體（尾殼核）處DA 的含量比6 月組降低了47.60%（P＜0.01）。EGF處理后，24 月-EGF 組紋狀體（尾殼核）處DA 的含量與24 月組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

研究表明，衰老常表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的運(yùn)動(dòng)行為衰退[1]。曠場(chǎng)試驗(yàn)是檢測(cè)DA 能神經(jīng)元功能活動(dòng)的敏感方法[18]，能反映動(dòng)物的自發(fā)運(yùn)動(dòng)行為活性。以往的研究顯示，老年大鼠曠場(chǎng)行為中的靜止聞嗅行為、探索行為、運(yùn)動(dòng)行為和理毛行為均顯著衰退[4，19]，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前相符。EGF 處理后，老年大鼠的上述曠場(chǎng)均顯著改善，理毛潛伏期也恢復(fù)到接近正常水平，說(shuō)明EGF 可以改善老年大鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性衰退。

在NSDAs 中，TH 是DA 合成的限速酶[20]，由TH 的活性變化導(dǎo)致DA 合成或信號(hào)改變被認(rèn)為與PD 或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)[21-22]。DAT 是突觸前膜蛋白，通過(guò)重?cái)z取突觸間隙的DA，調(diào)節(jié)DA 的可用性[23]。研究表明DAT 敲除鼠NSDAs 中DA 的水平下降[24]。在大鼠NSDAs 中，黑質(zhì)是DA 神經(jīng)元胞體和樹突聚集的部位，尾殼核是DA 神經(jīng)元投射的重要靶區(qū)。現(xiàn)有研究表明，衰老過(guò)程中黑質(zhì)和尾殼核處TH 和DAT 的表達(dá)均下降，并且與運(yùn)動(dòng)行為衰退密切相關(guān)[5-6，22-24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，老年大鼠黑質(zhì)和尾殼核處TH 和DAT 的mRNA 和蛋白表達(dá)均較成年大鼠顯著下降，與前人研究結(jié)果相符。給予EGF 后，黑質(zhì)和尾殼核處TH 和DAT 的mRNA和蛋白表達(dá)均升高，表明EGF 改善老年大鼠運(yùn)動(dòng)衰退與提高NSDAs 中TH 和DAT 的表達(dá)有關(guān)。有報(bào)道指出，PD 出現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)缺陷伴隨紋狀體處DA的含量下降達(dá)80%以上[25-27]，但正常衰老過(guò)程中出現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)衰退，紋狀體DA 含量的下降通常不超過(guò)50%[9，28-29]。此外，即便紋狀體DA 耗竭，PD 患者的運(yùn)動(dòng)缺陷仍會(huì)繼續(xù)加重[10-11]。因此，紋狀體DA 的含量下降不是唯一反映運(yùn)動(dòng)衰退的指標(biāo)。有報(bào)道指出，黑質(zhì)處DA 的含量在衰老或PD 時(shí)，有20%～40%的下降[8，30-32]。衰老或PD 模型鼠補(bǔ)充外源性膠質(zhì)源性生長(zhǎng)因子可引起自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性、黑質(zhì)處TH 的表達(dá)以及DA 的含量上升[33]。給予中年大鼠熱量限制干預(yù)，可改善自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性衰退伴有黑質(zhì)（而非尾殼核）處DA 的含量上升[9，28]。因此，黑質(zhì)處DA 的含量也是反映運(yùn)動(dòng)功能的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，老年大鼠黑質(zhì)處和尾殼核處DA 含量與成年大鼠相比均顯著下降。給予EGF處理后，黑質(zhì)處DA 的含量顯著上升，而尾殼核處DA 的含量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示EGF 改善老年大鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性衰退與黑質(zhì)（而非尾殼核）處DA的含量升高有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)之所以會(huì)出現(xiàn)尾殼核處DA 的含量在EGF 處理后未升高，考慮與DAT 的表達(dá)在黑質(zhì)處和尾殼核處上升程度不同有關(guān)。EGF 處理后，DAT 在黑質(zhì)處上升91.53%，在尾殼核處上升50.45%，導(dǎo)致DA 在尾殼核處突觸間隙未被重?cái)z取的多，而突觸間隙未被重?cái)z取的DA 會(huì)被兒茶酚胺-O-甲基轉(zhuǎn)移酶降解，因此DA 在尾殼核處被降解的多，導(dǎo)致DA 的總量沒(méi)有升高。

綜上，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGF 可改善老年大鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性衰退與提高黑質(zhì)（而非尾殼核）處DA 的含量有關(guān)。