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        基于UPLC指紋圖譜結(jié)合色度值的槐花炮制前后變化規(guī)律研究

        2023-08-12 02:27:42黃瑤陳巧華方朝纘鄧怡芳王文麗胡懿張志鵬
        關(guān)鍵詞:生品樣量色度

        黃瑤,陳巧華,方朝纘,鄧怡芳,王文麗,胡懿,張志鵬

        (廣東一方制藥有限公司,廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 佛山 528244)

        槐花為豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花及花蕾,夏季采收,花開放時(shí),稱為“槐花”,花未開放時(shí),稱為“槐米”,味苦,性微寒,歸肝、大腸經(jīng),具有清肝瀉火,涼血止血的功效[1]。2020年版《中國藥典》中收載的槐花炮制品有炒槐花和槐花炭[1]。生品槐花性寒,多用于治療肝熱目赤,頭痛眩暈,炒黃后的槐花苦寒之性減弱,炒炭后的槐花則澀性增強(qiáng),多用于出血證的治療。槐花主要含有的蘆丁、槲皮素等黃酮類化學(xué)成分[2]是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)?;被ㄅ谥七^程中藥效的變化通常伴隨著化學(xué)成分的改變,馬艷琴等[3]發(fā)現(xiàn)不同槐花炮制品中總黃酮提取率有明顯的不同,炒制槐花最高(14.23%),其次為生品槐花(13.17%),最后是槐花炭(9.31%)。朱洪劍等[4]對(duì)比了槐花炮制前后蘆丁、槲皮素以及鞣質(zhì)的含量變化,發(fā)現(xiàn)蘆丁和鞣質(zhì)的含量高低順序?yàn)?炒槐花>槐花生品>槐花炭,而槲皮素的含量高低順序則為:槐花炭>槐花生品>炒槐花。研究發(fā)現(xiàn),中藥飲片炮制過程中飲片的外觀色澤與內(nèi)在化學(xué)成分的變化存在一定關(guān)聯(lián)性[5-6]?;被ǔ粗坪?顏色亦發(fā)生了明顯的變化,槐花生品呈黃綠色,炒槐花呈深黃色,槐花炭則呈焦褐色[1]。可見,研究槐花炮制過程中整體化學(xué)成分與飲片外觀顏色的變化規(guī)律對(duì)指導(dǎo)槐花的炮制與鑒別具有重要意義。中藥指紋圖譜是能夠呈現(xiàn)中藥整體化學(xué)組分的一種綜合、可量化的鑒定手段,主要用于評(píng)價(jià)中藥及其制劑的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性[7]。本研究擬建立槐花炮制前后的UPLC指紋圖譜,并結(jié)合多模式識(shí)別分析方法對(duì)槐花生品、炒槐花及槐花炭化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)的分析;采用分光測色儀采集槐花生品、炒槐花及槐花炭飲片粉末的色度值;同時(shí)分析槐花炮制過程中指紋圖譜與色度值的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,以期為槐花生品及其炮制品的鑒別以及炮制工藝研究提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器

        C21-WK2102型多功能電磁爐(美的集團(tuán)有限公司);H-Class型超高效液相色譜儀(美國沃特世公司);MilliQDirect型超純水系統(tǒng)(德國默克公司);ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);111B型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)(浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司);TS7700型分光測色儀(深圳市三恩時(shí)科技有限公司)。

        1.2 試劑與藥材

        5-羥甲基糠醛(批號(hào):111626-202215,純度為98.7%)、原兒茶酸(批號(hào):110809-201906,純度為97.7%)、蘆丁(批號(hào):100080-202012,純度為92.2%)、異槲皮苷(批號(hào):111809-201804,純度為97.2%)、水仙苷(批號(hào):111997-201501,純度為93.1%)、槲皮素(批號(hào):100081-201610,純度為99.1%)、山柰素(批號(hào):110861-202013,純度為93.2%)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號(hào):112007-202103,純度為100%)均購自中國食品藥品檢定研究院;色譜級(jí)乙腈(德國默克公司);色譜級(jí)磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);其余試劑均為分析純,水為超純水。

        16批槐花藥材(編號(hào)H1~H16)經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定,均為豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花。16批炒槐花飲片(編號(hào)C1~C16)和16批槐花炭飲片(編號(hào)T1~T16)均為廣東一方制藥有限公司技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室自制?;被▉碓淳唧w信息見表1。

        表1 16批槐花生品來源信息

        2 方法與結(jié)果

        2.1 炒槐花、槐花炭飲片的制備

        炒槐花:分別取編號(hào)H1~H16的槐花生品藥材,按2020年版《中國藥典》通則0213清炒法炒至表面深黃色,得編號(hào)為C1~C16的炒槐花飲片。

        槐花炭:分別取編號(hào)H1~H16的槐花生品藥材,按2020年版《中國藥典》通則0213炒炭法炒至表面焦褐色,得編號(hào)為T1~T16的槐花炭飲片。

        2.2 色譜條件

        采用Agilent ZORBA XRRHD StableBond C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)為色譜柱;以乙腈為流動(dòng)相A,以0.1%的磷酸水溶液為流動(dòng)相B,梯度洗脫(0~5 min,12%~18%A;5~9 min,18%~19%A;9~21 min,19%~35%A;21~22 min,35%~90%A;22~23 min,90%~12%A;23~30 min,12%A);柱溫:40 ℃;流速:0.20 mL·min-1;檢測波長:257 nm;進(jìn)樣量:1 μL。

        2.3 對(duì)照品溶液的制備

        分別取5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇溶解,制成質(zhì)量濃度分別為25.68、36.11、62.75、25.08、25.40、28.77、36.47、31.32 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液,即得。

        2.4 供試品溶液的制備

        取樣品粉末(過2號(hào)篩)約0.1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放至室溫,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

        2.5 方法學(xué)考察

        2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取編號(hào)H16的樣品粉末1份,按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次,以8號(hào)峰(蘆丁)為參照峰S,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.02%~0.24%,相對(duì)峰面積的RSD值為0.14%~2.74%,說明儀器精密度良好。

        2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取編號(hào)H16的樣品粉末6份,按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,以8號(hào)峰(蘆丁)為參照峰S,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.04%~0.26%,相對(duì)峰面積的RSD值為0.75%~2.54%,說明該方法重復(fù)性良好。

        2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取編號(hào)H16的樣品粉末1份,按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件,分別于0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測定,以8號(hào)峰(蘆丁)為參照峰S,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.04%~0.90%,相對(duì)峰面積的RSD值為0.43%~2.77%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.6 UPLC指紋圖譜研究

        2.6.1 UPLC指紋圖譜的生成 取16批槐花生品、炒槐花及槐花炭樣品粉末,按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,采集色譜圖,將所得色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》分析軟件,分別以編號(hào)H1的槐花生品、編號(hào)C1的炒槐花、編號(hào)T1的槐花炭色譜圖為參照?qǐng)D譜,時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 min,通過多點(diǎn)校正對(duì)16批槐花生品、炒槐花及槐花炭的色譜圖進(jìn)行全譜峰匹配,對(duì)照?qǐng)D譜生成方法選擇中位數(shù)法,生成槐花生品、炒槐花及槐花炭的對(duì)照?qǐng)D譜。16批槐花生品、炒槐花及槐花炭UPLC指紋圖譜見圖1~3。16批槐花生品標(biāo)定了15個(gè)共有峰,16批炒槐花標(biāo)定了16個(gè)共有峰,16批槐花炭標(biāo)定了14個(gè)共有峰,其中:峰1和峰2(5-羥甲基糠醛)在槐花生品中均未檢出,在炒槐花中均能檢出;峰1在部分批次槐花炭中能檢出,峰2(5-羥甲基糠醛)在槐花炭中均能檢出;峰17在槐花生品中均能檢出,但在炒槐花和槐花炭中均未檢出。由此說明槐花生品、炒槐花、槐花炭3者的化學(xué)成分組成差異較大,且峰1、峰2(5-羥甲基糠醛)和峰17可用于區(qū)分3者。

        圖1 16批槐花生品UPLC指紋圖譜

        圖2 16批炒槐花UPLC指紋圖譜

        圖3 16批槐花炭UPLC指紋圖譜

        2.6.2 色譜峰指認(rèn) 取“2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,采集色譜圖。通過與對(duì)照品色譜圖的對(duì)比,指認(rèn)了峰2、峰3、峰8、峰9、峰10、峰11、峰14、峰15分別為5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素?;被ㄉ?、炒槐花及槐花炭的對(duì)照?qǐng)D譜見圖4,對(duì)照品圖譜見圖5。

        圖4 槐花生品(H-R)、炒槐花(C-R)和槐花炭(T-R)對(duì)照?qǐng)D譜

        注:2.5-羥甲基糠醛;3.原兒茶酸;8.蘆丁;9.異槲皮苷;10.山柰酚-3-O-蕓香糖苷;11.水仙苷;14.槲皮素;15.山柰素

        2.6.3 相似度評(píng)價(jià) 分別以槐花生品、炒槐花及槐花炭的對(duì)照?qǐng)D譜為參照,計(jì)算16批槐花生品、炒槐花及槐花炭的相似度,結(jié)果見表2。16批槐花生品的相似度范圍為0.996~1.000,16批炒槐花的相似度范圍為0.999~1.000,16批槐花炭的相似度范圍為0.979~1.000,表明槐花樣品批間質(zhì)量差異較小,且炮制后的樣品批間質(zhì)量也較穩(wěn)定。

        表2 16批槐花生品、炒槐花及槐花炭的UPLC指紋圖譜相似度

        2.7 槐花生品與炮制品的色度值測定

        采用分光測色儀對(duì)16批槐花生品與炮制品的樣品粉末色度值進(jìn)行測定,光源設(shè)置為D65,視場選擇10度視角,測定孔徑4 mm,進(jìn)行儀器黑白校正后,分別取16批槐花生品、炒槐花、槐花炭粉末適量,均勻平鋪于載玻片上,平鋪的厚度約為1 mm,測定粉末色度值L*、a*、b*,平行測定3 次,取平均值。16批槐花生品、炒槐花及槐花炭樣品粉末色彩圖像見圖6,色度值結(jié)果見表3。

        圖6 16批槐花生品、炒槐花及槐花炭樣品粉末色彩圖像

        表3 16批槐花生品與炮制品的色度值結(jié)果

        表4 16批槐花生品到炮制品色度值變化結(jié)果

        2.8 槐花生品與炮制品的多元統(tǒng)計(jì)分析

        2.8.1 單因素方差分析 將16批槐花生品及炮制品UPLC指紋圖譜的17個(gè)共有峰的峰面積(缺失的色譜峰峰面積以0計(jì))按峰面積/稱樣量/1 000計(jì)算比值后與色度值(L*、a*、b*)導(dǎo)入SPSS20.0軟件,進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果見表5。結(jié)果表明,與槐花生品相比,炒槐花中的峰1、2、3、7、8、9、10、12、13、14、16、17的峰面積/稱樣量/1 000比值及色度值(L*、a*)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與槐花生品相比,槐花炭中的峰1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、15、17的峰面積/稱樣量/1 000比值及色度值(L*、a*、b*)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與炒槐花相比,槐花炭中的峰1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16的峰面積/稱樣量/1 000比值及色度值(L*、a*、b*)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),這說明槐花生品經(jīng)炮制后其內(nèi)在質(zhì)量與外在顏色均發(fā)生了較大的變化,其中炒炭后變化較為明顯。

        表5 槐花生品與炮制品共有峰的峰面積/稱樣量/1 000比值及色度值方差分析結(jié)果

        2.8.2 聚類分析及主成分分析 將16批槐花生品及炮制品UPLC指紋圖譜的17個(gè)共有峰的峰面積(缺失的色譜峰峰面積以0計(jì))按峰面積/稱樣量/1 000計(jì)算比值后與色度值(L*、a*、b*)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件,進(jìn)行聚類分析和主成分分析。結(jié)果提取到3個(gè)特征值大于1的主成分,其中主成分1的方差貢獻(xiàn)率為51.629%,主成分2的方差貢獻(xiàn)率為27.095%,主成分3的方差貢獻(xiàn)率為11.456%,3個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為90.179%,說明提取到的3個(gè)主成分即可反映槐花生品、炒槐花及槐花炭UPLC指紋圖譜90.179%的信息,結(jié)果見表6。

        表6 特征值、方差貢獻(xiàn)率及累積方差貢獻(xiàn)率

        聚類分析樹狀圖(圖7)和主成分分析二維得分圖(圖8)均可明顯區(qū)分槐花生品、炒槐花和槐花炭。

        圖7 16批槐花生品及炮制品聚類分析樹狀圖

        圖9 16批槐花生品及炮制品的OPLS-DA得分圖

        圖10 16批槐花生品及炮制品VIP值圖

        2.9 槐花炒制過程指紋圖譜與色度值動(dòng)態(tài)變化分析

        2.9.1 槐花炒制過程飲片樣品的制備 取槐花藥材(H1),按2020年版《中國藥典》槐花炮制項(xiàng)下規(guī)定,除去雜質(zhì)及灰屑,得槐花飲片。將電磁爐溫度加熱至160 ℃左右時(shí),投入槐花飲片,自0 min起,每間隔2 min取樣1次(共炒制46 min),放冷,得24份不同取樣時(shí)間點(diǎn)的槐花炒制的飲片樣品。

        2.9.2 指紋圖譜的采集 分別取上述24份不同取樣時(shí)間點(diǎn)槐花炒制的飲片樣品粉末,按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄每份樣品的色譜圖和17個(gè)色譜峰的峰面積,缺失的色譜峰峰面積以0計(jì),所得峰面積按峰面積/稱樣量/1 000計(jì)算比值,結(jié)果見表7。24份不同取樣時(shí)間點(diǎn)的樣品UPLC指紋圖譜見圖11。

        圖11 槐花炒制過程不同取樣時(shí)間點(diǎn)飲片樣品UPLC指紋圖譜

        由表7可知,峰1~2在0 min時(shí)峰面積/稱樣量/1 000比值為0,炒制2 min時(shí)該比值分別為10、4,由此推測峰1和峰2為炒制過程中新增的化合物。在46 min內(nèi),隨著炒制時(shí)間的延長,峰1~峰16峰面積/稱樣量/1 000比值整體上均呈現(xiàn)先增大后減小的規(guī)律,峰17則呈現(xiàn)一直減小的規(guī)律,其中有7個(gè)色譜峰(峰1、4、5、6、7、13、17)分別在炒制18、46、32、44、32、30、10 min時(shí)峰面積/稱樣量/1 000比值下降為0,其余色譜峰在炒制一段時(shí)間后峰面積/稱樣量/1 000比值也發(fā)生了不同程度的下降,表明槐花在炒制過程中其化學(xué)成分受熱極不穩(wěn)定,同時(shí)也說明了控制炮制時(shí)間對(duì)化學(xué)成分的保留至關(guān)重要,以保證臨床用藥的有效性。

        由“2.6.2”項(xiàng)下結(jié)果可知,峰2、峰3、峰8、峰9、峰10、峰11、峰14、峰15分別指認(rèn)為5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素,其中蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素,均為黃酮類成分。研究表明,黃酮類成分具有抑菌抗炎、抗自由基、抗氧化等多種生物活性,是槐花生品及其炮制品的主要藥效成分。峰8(蘆丁)、峰10(山柰酚-3-O-蕓香糖苷)和峰11(水仙苷)的峰面積/稱樣量/1 000比值在炒制0~8 min內(nèi)均變化不大,在2 min左右均處于最大值,與0 min時(shí)相比,炒至46 min時(shí)該比值分別下降了99%、99%、97%;峰15(山柰素)在6 min左右峰面積/稱樣量/1 000比值達(dá)到最大值,其中0~8 min內(nèi)變化不明顯;峰14(槲皮素)在8 min左右峰面積/稱樣量/1 000比值達(dá)到最大值,其中4~8 min內(nèi)變化不明顯,與0 min時(shí)相比,炒至46 min時(shí)該比值下降了74%;峰9(異槲皮苷)在10 min左右峰面積/稱樣量/1 000比值達(dá)到最大值。表明槐花主要黃酮類成分在炒制10 min內(nèi)含量可達(dá)到最大值,峰8(蘆丁)為槐花最主要的有效成分,其峰面積/稱樣量/1 000比值最大,在炒制2 min左右該比值已達(dá)到最大。

        峰2(5-羥甲基糠醛)為炒制2 min內(nèi)新產(chǎn)生的化合物,在12 min左右峰面積/稱樣量/1 000比值達(dá)到最大值,峰3(原兒茶酸)在8 min左右峰面積/稱樣量/1 000比值達(dá)到最大值。相關(guān)藥理研究表明,5-羥甲基糠醛具有雙向的作用,在具有較好的抗氧化、抗炎、抗過敏、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用的同時(shí),也具有刺激眼睛、黏膜、皮膚,神經(jīng)毒性等毒副作用[9-11]。因此,在炮制過程中控制5-羥甲基糠醛的含量對(duì)臨床用藥的安全性亦不可忽視。

        圖12 槐花炒制過程不同取樣時(shí)間點(diǎn)飲片樣品粉末色彩圖像

        圖13 槐花炒制過程中色度值的變化情況

        結(jié)果顯示,槐花炒制過程中,0~46 min內(nèi)明度值L*、黃藍(lán)色值b*以及總色值E*總體均呈現(xiàn)下降趨勢,其中下降最明顯的為明度值L*,下降幅度為54,下降了約84%,黃藍(lán)色值b*在0~8 min變化不大,8~46 min下降明顯,0~46 min下降幅度為26,下降了約81%,紅綠色值a*則先增大后減小,但整體變化不明顯,表明樣品明度由亮變暗,顏色由黃色到焦黑色轉(zhuǎn)變。色差ΔE*隨著炒制時(shí)間的延長呈現(xiàn)不斷升高的趨勢,其值越大,代表與參照樣品色值相差越大,當(dāng)炒制2 min時(shí)樣品ΔE*=8,大于3.5[6],表明炒制2 min時(shí)飲片顏色變化即可被肉眼識(shí)別。炒制4~6 min時(shí),飲片的色度值L*、a*、b*、E*基本落在“2.7”項(xiàng)下炒槐花的色度值浮動(dòng)范圍內(nèi),故以飲片色澤為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí),在160 ℃的炒制溫度下,炒槐花的炒制時(shí)間以4~6 min為宜。炒制14~18 min時(shí),飲片的色度值L*、a*、b*、E*基本落在“2.7”項(xiàng)下槐花炭的色度值浮動(dòng)范圍內(nèi),故以飲片色澤為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí),在160 ℃的炒制溫度下,槐花炭的炒制時(shí)間以14~18 min為宜。

        2.10 槐花炒制過程關(guān)鍵指標(biāo)成分的相對(duì)含量與色度值的相關(guān)性分析

        “2.8.3”項(xiàng)下結(jié)果表明,蘆丁和槲皮素的相對(duì)含量是槐花生品、炒槐花、槐花炭差異的關(guān)鍵指標(biāo)。此外,5-羥甲基糠醛也是炮制后新增的化學(xué)成分。因此,為驗(yàn)證槐花炮制過程中,上述指標(biāo)成分相對(duì)含量與飲片色度值的關(guān)聯(lián)性,本研究采用SPSS20.0對(duì)槐花炒制過程關(guān)鍵指標(biāo)成分5-羥甲基糠醛、蘆丁、槲皮素的相對(duì)含量與色度值進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果見表8。結(jié)果顯示,槐花炮制過程中,5-羥甲基糠醛的相對(duì)含量與色度值a*及色差值Δa*呈顯著正相關(guān);蘆丁和槲皮素的相對(duì)含量與色度值L*、a*、b*、E*及色差值ΔL*、Δa*、Δb*呈顯著正相關(guān),與色差值ΔE*呈顯著負(fù)相關(guān)。

        圖14 槐花炒制過程中色差值的變化情況

        表8 槐花炒制過程中關(guān)鍵指標(biāo)成分的相對(duì)含量與色度值的相關(guān)性

        3 討論

        3.1 槐花生品、炒槐花及槐花炭的指紋圖譜與色度值分析

        傳統(tǒng)的飲片炮制主要是依賴于人的感官與經(jīng)驗(yàn),通過判斷飲片的外觀顏色從而決定飲片的炮制終點(diǎn),這存在一定的主觀性和模糊性。1976年由照明委員會(huì)(CIE)提出的CIELAB均勻顏色空間理論,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)顏色的準(zhǔn)確描述,使樣品顏色可以量化表達(dá),已廣泛應(yīng)用于印染顏料制造、涂料、塑料著色等領(lǐng)域中[12]。近年來,基于該理論,不少學(xué)者利用色差儀測定中藥的外觀顏色以獲取樣品的色度值,從而對(duì)樣品顏色進(jìn)行客觀量化,用于彌補(bǔ)傳統(tǒng)中藥鑒別中對(duì)顏色判斷的不足。

        本研究根據(jù)現(xiàn)行版《中國藥典》槐花項(xiàng)下規(guī)定,對(duì)炒槐花和槐花炭進(jìn)行了炮制,并基于CIELAB均勻顏色空間理論,采用分光測色儀對(duì)槐花生品、炒槐花以及槐花炭的顏色進(jìn)行量化。在炒槐花和槐花炭炮制過程中,不僅存在顏色的變化,同時(shí)也會(huì)伴隨著化學(xué)成分組成與含量的變化,外在顏色是判斷炒槐花及槐花炭炮制程度的重要參考指標(biāo),而內(nèi)在化學(xué)成分含量則是評(píng)價(jià)二者質(zhì)量的重要依據(jù)。因此,本研究基于UPLC指紋圖譜與色度值,對(duì)槐花炮制前后飲片的差異進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

        由單因素方差分析結(jié)果可知,槐花生品、炒槐花、槐花炭不僅外觀顏色有差異,化學(xué)成分的組成與含量也存在較大差異,峰1和峰2(5-羥甲基糠醛)為炒黃后產(chǎn)生的化學(xué)成分,而峰17則為炒黃和炒炭后消失的成分?;被ㄉ肪哂泻軓?qiáng)的清肝瀉火、清熱涼血作用,多用于血熱妄行,肝熱目赤,頭痛眩暈,瘡毒腫痛;炒槐花苦寒之性緩和,清熱涼血作用減弱,止血作用增強(qiáng)但弱于槐花炭,多用于脾胃虛弱的出血患者;槐花炭清熱涼血作用極弱,澀性增強(qiáng),以止血力勝,多用于咯血、便血、崩漏下血等出血證。故在臨床使用時(shí),止血多炒炭用,而清熱瀉火則生用,這可能與槐花經(jīng)過炮制后化學(xué)成分的組成與含量發(fā)生變化有關(guān)[3]。

        聚類分析、主成分分析以及OPLS-DA均可將槐花生品、炒槐花和槐花炭明顯區(qū)分,且蘆丁和槲皮素是引起槐花生品、炒槐花和槐花炭之間差異的主要成分。蘆丁為槐花生品及其炮制品中含量最高的黃酮類成分,其次是槲皮素,因此,槐花生品、炒槐花及槐花炭中蘆丁和槲皮素含量的差異可能是導(dǎo)致3者臨床療效差異的主要原因之一。

        3.2 槐花炮制過程的指紋圖譜與色度值動(dòng)態(tài)變化分析

        為了進(jìn)一步明確各色譜峰的峰面積隨炮制時(shí)間的延長其變化趨勢以及炮制過程中飲片顏色的變化情況,本研究對(duì)槐花炒制46 min內(nèi)17個(gè)色譜峰的峰面積/稱樣量/1 000比值和顏色值進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,炒制過程中峰1~16的峰面積/稱樣量/1 000比值均先增大后減小,峰17則一直減小,17個(gè)色譜峰的峰面積/稱樣量/1 000比值在炒制12 min內(nèi)均可達(dá)到最大值。在顏色變化方面,炒制過程中槐花飲片的外觀明亮度由明到暗,顏色由黃色到焦黑色轉(zhuǎn)變。5-羥甲基糠醛是葡萄糖等單糖在高溫或弱酸等條件下脫水產(chǎn)生的化合物[13],槐花炒制過程中5-羥甲基糠醛含量的升高可能是導(dǎo)致樣品顏色加深的原因。此外,蘆丁等黃酮類成分是槐花黃色素的主要成分,其在炒制一段時(shí)間后含量明顯下降,二者共同作用可能是導(dǎo)致L*和b*明顯降低的原因,故槐花炒制過程中樣品表觀顏色逐漸加深,整體從黃色到焦黑色轉(zhuǎn)變。

        綜上,本研究建立的UPLC指紋圖譜結(jié)合色度值的方法可有效區(qū)分槐花生品、炒槐花和槐花炭,同時(shí)考察了槐花隨炮制時(shí)間的延長UPLC指紋圖譜與色度值的動(dòng)態(tài)變化情況,可為槐花生品及其炮制品的鑒別以及炮制工藝研究提供參考。

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