孫志東，高佳煒，楊柳欣，張雅麗，3，袁星星，

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150006；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；3.張雅麗名老中醫(yī)藥專(zhuān)家工作室，黑龍江 哈爾濱 150006）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種由環(huán)境與遺傳等因素共同作用引起的，以胰島素分泌相對(duì)減少伴胰島素抵抗為主要病理生理特征的代謝性疾病［1］。30 多年來(lái)，我國(guó)糖尿病的患病率顯著增加，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，其中T2DM 約占我國(guó)糖尿病的90%以上，不僅給患者帶來(lái)極大的危害，也給社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。

巨噬細(xì)胞是人體重要的固有免疫細(xì)胞，在機(jī)體微環(huán)境改變的同時(shí)其功能發(fā)生變化，包括經(jīng)典激活的M1 型和交替激活的M2 型。巨噬細(xì)胞極化在包括肥胖、T2DM、非酒精性脂肪性肝病和痛風(fēng)等代謝性疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［3］。研究證實(shí)，脂肪巨噬細(xì)胞構(gòu)成的炎性浸潤(rùn)在誘導(dǎo)胰島素抵抗-T2DM 這一病理過(guò)程中的作用不容忽略［4］。因此，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化介導(dǎo)的炎癥微環(huán)境可能是改善胰島素抵抗的重要途徑。芪參湯已被證實(shí)能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗，從而促進(jìn)糖脂代謝和降低體質(zhì)量，然而具體機(jī)制仍不明確［5，6］。本研究以佛波酯誘導(dǎo)THP-1 人單核細(xì)胞株分化巨噬細(xì)胞，并采用高糖刺激構(gòu)建巨噬細(xì)胞極化模型，通過(guò)觀(guān)察芪參湯對(duì)miR-495/FTO 信號(hào)通路介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化的影響，從而闡明芪參湯改善胰島素抵抗治療T2DM 的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

20 只健康清潔級(jí)SD 大鼠（雄性，6 周齡，201～225 g）購(gòu)于北京維通利華有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：京瓦窯 SCXK（京）2021-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫20～25 ℃，循環(huán)光照，自由飲水。THP-1（人單核細(xì)胞白血?。┘?xì)胞株購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

芪參湯（生黃芪15 g、西洋參10 g、澤瀉10 g、荷葉10 g、生山楂10 g、丹參10 g、女貞子8 g、墨旱蓮8 g、絞股藍(lán)5 g、三七5 g、生甘草3 g）購(gòu)于黑龍江生中醫(yī)藥科學(xué)院中草藥局，藥物經(jīng)煎煮、過(guò)濾后制成1 g/mL 的濃縮液備用。佛波酯購(gòu)于中國(guó)Biosharp 公司（貨號(hào)：BL1127A）；RPMI-1640 培養(yǎng)液和高糖培養(yǎng)基購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號(hào)分別為PM150110B 和PM150210B）。CD86 和CD206 一抗均購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司（ab239075 和ab270647）；FTO 一抗、β-Actin 一抗、HRP 標(biāo)記的二抗、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒和BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)CST 公司（貨號(hào)分別為#31687、#93473、#7074、#6883 和#7780）。白細(xì)胞介素4（Interleukin-4，IL-4）、IL-6、IL-1β 和IL-10 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司（貨號(hào)分別為MM -0051H2、MM -0049H2、MM-0181H2 和MM-0066H2）。Lipo6000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物（貨號(hào)：C0526-10ml）；qPCR 試劑盒購(gòu)于美國(guó)Roche 公司（貨號(hào)：KK4610）。

1.3 方法

1.3.1 含藥血清制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為空白組與模型組，各10 只。參照前期研究［7］方法，芪參湯組給予芪參湯濃縮液（18.8 g/kg）灌胃治療，空白組給與等體積的生理鹽水灌胃治療，每日1次，連續(xù)7 d。于末次治療后腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血。3 500 r/min 離心10 min 后收集血清，水浴滅活30 min 后，濾膜過(guò)濾后備用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1 以RPMI-1640 培養(yǎng)液（含有10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗和β-巰基乙醇）進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞置于37 ℃和含5%CO2的培養(yǎng)箱中配，2～3 d 換液1 次。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞接種于6 孔板（1×106個(gè)/mL）。向細(xì)胞中加入佛波酯（160 nmol/L）誘導(dǎo)THP-1 向巨噬細(xì)胞分化，當(dāng)細(xì)胞以懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)為貼壁狀態(tài)，表示細(xì)胞分化成功。

1.3.3 細(xì)胞分組與藥物干預(yù) 將分化后的巨噬細(xì)胞以2.5×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔板，每孔900 μL。參照方案進(jìn)行分組并給予相應(yīng)的藥物進(jìn)行干預(yù)。（1）空白組：THP-1+正常培養(yǎng)基（5.6 mmol/L葡萄糖）+100 μL 空白血清；（2）模型組：THP-1+高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 空白血清；（3）芪參湯組：THP-1+高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L葡萄糖）+100 μL 含藥血清；（4）miR-495 抑制物組：THP-1+高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L 葡萄糖）+100 μL空白血清+miR-495 inhibitor；（5）芪參湯+miR-495抑制物組：THP-1+高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 含藥血清+miR-495 inhibitor。其中miR-495 inhibitor 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司代合成，參照Lipo6000 試劑盒說(shuō)明書(shū)將終濃度為200 nmol/L 的miR-495 inhibitor 轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞。

1.3.4 CCK8 法檢測(cè) 將分化后的巨噬細(xì)胞以2.5×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔板，參照方案進(jìn)行分組并給予相應(yīng)的藥物進(jìn)行干預(yù)，以檢測(cè)芪參湯含藥血清和轉(zhuǎn)染miR-495 inhibitor 對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性。（1）空白組：THP-1+正常培養(yǎng)基（5.6 mmol/L葡萄糖）；（2）空白血清組：THP-1+正常培養(yǎng)基（5.6 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 空白血清；（3）含藥血清組：THP-1+正常培養(yǎng)基（5.6 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 含藥血清；（4）miR-495 抑制物組：THP-1+正常培養(yǎng)基（5.6 mmol/L 葡萄糖）+miR-495 inhibitor。沒(méi)孔加入10 μL 的CCK8 溶液，于37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)4 h，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度值（A450）。

1.3.5 ELISA 法檢測(cè) 于48 h 后收集1.3.3 中各組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)各組培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-1β、IL-4 和IL-10 的含量，實(shí)驗(yàn)操作在試劑盒說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 于48 h 后收集1.3.3 中各組巨噬細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入PBS 重懸后1 000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌2 次后分為2 組。一組加入200 μL 的PBS 重懸后加入FITC 標(biāo)記的CD86 的抗體進(jìn)行孵育；另一組加入200 μL 的PBS 重懸后加入1.5 mL 破膜劑，加入FITC 標(biāo)記的CD206 的抗體進(jìn)行孵育。孵育30 min后以PBS 洗滌、重懸后上機(jī)檢測(cè)CD86 和CD206 的陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3.7 qPCR 檢測(cè) 于48 h 后收集1.3.3 中各組巨噬細(xì)胞，采用TRIzol 法提取細(xì)胞中總RNA，隨后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照qPCR 試劑盒方法進(jìn)行mRNA 的定量分析。引物序列如下：miR-495：F：5'-GCGAAACAAACATGGTGC-3'，R：5'-GCAG GGTCCGAGGTATTC-3'；U6：F：5'-CTCGCTT CGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAA TTTGCGT-3'；FTO：5'-TTCATGCTGGATG ACCTCAATG-3'，R：5'-GCCAACTGACAGCG TTCTAAG - 3'；GAPDH：F：5'- GCACCGTC AAGGCTGAGAAC-3'，R：5'-TGGTGAAGACG CCAGTGGA-3'。qPCR 的反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，58 ℃變性30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)40 次后以95 ℃終末延伸15 s，4 ℃保持。miR-495 以U6 作為內(nèi)參，F(xiàn)TO 以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-495 與FTO 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.8 Western blot 檢測(cè) 于48 h 后收集1.3.3 中各組巨噬細(xì)胞，提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后以脫脂牛奶于室溫下進(jìn)行封閉。加入FTO（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗于室溫下繼續(xù)孵育2 h。TBST 洗膜后加入ECL 顯影，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)拍照后分析FTO 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用ANOVA，組間兩兩的比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響

為了明確空白血清、芪參湯含藥血清和轉(zhuǎn)染miR-495 抑制物對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性，本研究采用CCK8 法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的活性。與本組12 h 相比，24 h 和48 h細(xì)胞的活性均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各時(shí)間段組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組相比，空白血清、芪參湯含藥血清和轉(zhuǎn)染miR-495 抑制物的巨噬細(xì)胞活性均無(wú)明顯變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響（n=3，±s，OD）Tab 1 Effect of Qishen decoction on macrophage activity（n=3，±s，OD）

表1 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響（n=3，±s，OD）Tab 1 Effect of Qishen decoction on macrophage activity（n=3，±s，OD）

注：與本組12 h 相比，*P＜0.05。

分組空白組空白血清組含藥血清組miR-495 抑制物組48 h 0.847±0.165*0.852±0.080*0.870±0.053*0.849±0.081*0.030 0.916 FP 12 h 0.633±0.013 0.634±0.040 0.627±0.075 0.627±0.044 0.022 0.995 24 h 0.740±0.021*0.747±0.020*0.750±0.020*0.746±0.035*0.086 0.966

2.2 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子含量的影響

與空白組相比，模型組IL-6 和IL-1β 的含量均顯著增加，IL-4 和IL-10 的含量均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組上清中IL-6 和IL-1β 的含量均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組上清中IL-4 和IL-10 的含量均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 和P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子含量的影響（n=3，±s，pg/mL）Tab 2 Effect of Qishen decoction on inflammatory factors in macrophages（n=3，±s，pg/mL）

表2 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子含量的影響（n=3，±s，pg/mL）Tab 2 Effect of Qishen decoction on inflammatory factors in macrophages（n=3，±s，pg/mL）

注：與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，○P＜0.05，○○P＜0.01。

分組空白組模型組芪參湯組miR-495 抑制物組芪參湯+miR-495 抑制物組IL-6 7.93±0.78 24.58±2.15**16.48±2.88○○17.99±3.29○○9.78±1.37○○IL-1β 18.04±3.35 57.66±9.69**40.25±5.63○○39.25±6.81○○22.67±1.83○○IL-4 23.23±0.93 8.91±1.26**13.69±1.87○○13.10±1.38○19.05±2.63○○IL-10 70.07±8.98 28.43±4.19**40.12±1.30○○40.22±2.06○52.60±2.48○○33.981＜0.001 FP 25.662＜0.001 20.051＜0.001 31.628＜0.001

2.3 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響

與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞CD68 的表達(dá)和CD68/CD206 的比值均顯著增加，CD206 的表達(dá)顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組巨噬細(xì)胞CD68 的表達(dá)和CD68/CD206 的比值均顯著降低，CD206 的表達(dá)均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3 和圖1。

圖1 各組巨噬細(xì)胞CD86 和CD206 表達(dá)的比較Fig 1 Comparison of CD86 and CD206 expression in macrophages

表3 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響（n=3，±s）Tab 3 Effect of Qishen decoction on macrophage phenotype（n=3，±s）

表3 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響（n=3，±s）Tab 3 Effect of Qishen decoction on macrophage phenotype（n=3，±s）

注：與空白組相比，**P＜0.01；與模型組相比，○○P＜0.01。

分組空白組模型組芪參湯組miR-495 抑制物組芪參湯+miR-495 抑制物組CD68（%）21.26±1.38 53.53±3.05**38.05±3.14○○37.61±5.73○○30.49±2.05○○CD206（%）24.01±3.16 11.20±1.69**19.64±4.15○○20.85±3.24○○29.08±1.98○○CD68/CD206 的比值0.90±0.16 4.84±0.46**2.01±0.52○○1.81±0.27○○1.05±0.06○○65.063＜0.001 FP 36.219＜0.001 14.535＜0.001

2.4 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞iNOS 和COX-2 的表達(dá)均顯著增加，Arg-1 和YM-1 的表達(dá)均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組巨噬細(xì)胞iNOS 和COX-2 的表達(dá)均顯著降低，Arg-1 和YM-1 的表達(dá)均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記分子表達(dá)的影響（n=3，±s）Tab 4 Effect of Qishen decoction on the expression of macrophage marker molecules（n=3，±s）

表4 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記分子表達(dá)的影響（n=3，±s）Tab 4 Effect of Qishen decoction on the expression of macrophage marker molecules（n=3，±s）

注：與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，○P＜0.05，○○P＜0.01。

分組空白組模型組芪參湯組miR-495 抑制物組芪參湯+miR-495 抑制物組Arg-1 1.00±0.00 0.25±0.07**0.64±0.07○○0.67±0.09○○0.93±0.05○○YM-1 1.00±0.00 0.34±0.05**0.66±0.07○○0.68±0.05○○0.88±0.04○○84.613＜0.001 FP iNOS 1.00±0.00 3.14±0.18**2.43±0.08○○2.45±0.14○○1.75±0.10○○143.029＜0.001 COX-2 1.00±0.00 2.80±0.12**2.41±0.08○○2.39±0.13○○1.45±0.09○○191.093＜0.001 64.004＜0.001

2.5 芪參湯對(duì)MiR-495 和FTO 表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞中miR-495 的表達(dá)均顯著增加，F(xiàn)TO 的表達(dá)均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組巨噬細(xì)胞中miR-495 的表達(dá)均顯著降低，F(xiàn)TO 的表達(dá)均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表5。

表5 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞miR-495 和FTO 表達(dá)的影響（n=3，±s）Tab 5 Effect of Qishen decoction on the expression of miR-495 and FTO（n=3，±s）

表5 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞miR-495 和FTO 表達(dá)的影響（n=3，±s）Tab 5 Effect of Qishen decoction on the expression of miR-495 and FTO（n=3，±s）

注：與空白組相比，**P＜0.01；與模型組相比，○○P＜0.01。

分組空白組模型組芪參湯組miR-495 抑制物組芪參湯+miR-495 抑制物組miR-495 的相對(duì)表達(dá)1.00±0.00 2.70±0.09**2.30±0.06○○2.37±0.05○○FTO 的相對(duì)表達(dá)1.00±0.00 0.21±0.03**0.49±0.03○○0.50±0.05○○1.42±0.03○○0.76±0.04○○271.386＜0.001 FP 504.084＜0.001

2.6 芪參湯對(duì)FTO 蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞中FTO 蛋白的表達(dá)均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組巨噬細(xì)胞中FTO蛋白的表達(dá)均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表6。

表6 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞FTO 蛋白表達(dá)的的影響（n=3，±s）Tab 6 Effect of Qishen decoction on FTO protein expression（n=3，±s）

表6 芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞FTO 蛋白表達(dá)的的影響（n=3，±s）Tab 6 Effect of Qishen decoction on FTO protein expression（n=3，±s）

注：與空白組相比，**P＜0.01；與模型組相比，○○P＜0.01。

FTO/β-actin 0.82±1.36 0.20±0.03**0.51±0.03○○0.50±0.06○○0.71±0.03○○128.495＜0.001分組空白組模型組芪參湯組miR-495 抑制物組芪參湯+miR-495 抑制物組FP

圖2 各組巨噬細(xì)胞中FTO 蛋白表達(dá)的比較Fig 2 Comparison of FTO protein expression in macrophages of each group

3 討論

胰島素抵抗作為T(mén)2DM 的重要病理機(jī)制，同時(shí)也被證實(shí)在代謝綜合征中發(fā)揮著重要的作用。肥胖可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的體積增大，增大的脂肪細(xì)胞引起脂肪組織的缺氧，從而誘發(fā)細(xì)胞功能障礙（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激反應(yīng)）并啟動(dòng)炎癥反應(yīng)；另一方面，肥大的脂肪細(xì)胞通過(guò)分泌的單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor- α，TNF-α）導(dǎo)致糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗［8］。除脂肪組織巨噬細(xì)胞外，在MCP-1 和B 細(xì)胞、T 細(xì)胞的趨化作用下，來(lái)自單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞在壞死脂肪細(xì)胞周?chē)?rùn)的巨噬細(xì)胞是糖尿病慢性炎癥的標(biāo)志［9］。

巨噬細(xì)胞功能存在顯著的異質(zhì)性，在局部微環(huán)境的影響下其表型發(fā)生著動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化。M1 型巨噬細(xì)胞以CD68、iNOS 和COX2 為主要標(biāo)記分子，通過(guò)分泌IL-6、IL-1β 及TNF-α 等促炎因子，發(fā)揮免疫監(jiān)控的作用。iNOS 是炎癥反應(yīng)的重要組成部分，通過(guò)下調(diào)胰島素信號(hào)分子Rab8 的表達(dá)水平參與胰島素抵抗的形成［10］。COX2 是前列腺素合成過(guò)程中的重要限速酶，其表達(dá)水平與炎癥反應(yīng)及腫瘤的形成密切相關(guān)。有研究證實(shí)，COX2 可誘導(dǎo)胰島內(nèi)的炎癥水平，進(jìn)而引起胰島β 細(xì)胞功能的損傷［11］。M2 型巨噬細(xì)胞以CD206、Arg-1 和YM-1 陽(yáng)性表達(dá)為主表標(biāo)記分子，通過(guò)分泌IL-4 及IL-10 等細(xì)胞因子，發(fā)揮抗炎的作用。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞以M1 型分化為主，并分泌大量的IL-6 和IL-1β。芪參湯含藥血清能夠顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞中CD206、Arg-1 和YM-1 的表達(dá)，并下調(diào)CD68、iNOS 和COX2 的表達(dá)水平，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M1 向M2型分化，從而發(fā)揮抗炎的作用。

微小RNA（miRNA）是真核生物內(nèi)的一類(lèi)小分子非編碼RNA，約19～25 個(gè)核苷酸大小。在Dicer酶的作用下，70～90 nt 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA 前體被加工形成miRNA，其通過(guò)識(shí)別并特異性地結(jié)合mRNA 的3'UTR，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制mRNA的翻譯或者促進(jìn)mRNA 的降解，發(fā)揮病理生理作用。越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNA 的表達(dá)通過(guò)影響胰島素抵抗或調(diào)控胰島β 細(xì)胞的功能參與葡萄糖的代謝［12］。此外，miRNA 還可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與巨噬細(xì)胞的極化，進(jìn)而對(duì)免疫反應(yīng)、胰島素抵抗與炎癥等發(fā)揮治療作用［13］。miR-495 已被證實(shí)在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并對(duì)血管再狹窄、氧化應(yīng)激的調(diào)控和巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮著積極的作用［14-16］。FTO 是miR-495 下游重要的靶基因。作為脂肪和肥胖相關(guān)基因，F(xiàn)TO 與糖尿病、脂肪肝、肥胖等代謝性疾病的發(fā)生與發(fā)展存在著密切的關(guān)系。研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)FTO 可引起體重的增加與糖尿病等［17］。然而，F(xiàn)TO 在不同細(xì)胞中的作用可能相反。研究證實(shí)，F(xiàn)TO 在通過(guò)調(diào)控肝臟中糖生成基因的表達(dá)從而參與機(jī)體糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)［18］。當(dāng)前的研究證實(shí)，在高糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞模型中miR-495 的表達(dá)水平顯著增加，通過(guò)抑制miR-495 的表達(dá)能夠顯著上調(diào)FTO 的表達(dá)，從而促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗炎的作用。

芪參湯為臨床治療代謝綜合征的經(jīng)驗(yàn)方，該方以黃芪、西洋參為君，其中黃芪具有補(bǔ)氣固表，西洋參養(yǎng)陰生津，兩者合用具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效。研究證實(shí)，黃芪中的黃芪多糖能夠通過(guò)上調(diào)骨骼肌中的PI3K 和降低血清總膽固醇和甘油三酯的水平，達(dá)到改善肥胖大鼠的胰島素抵抗的作用［19］。方中以澤瀉、荷葉入脾、腎經(jīng)，滲濕、泄熱，生山楂、丹參入肝、脾、胃經(jīng)，健脾消食、行氣散瘀，以上四藥，共為臣藥。周熠等［20］通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)表明，荷葉可通過(guò)胰島素抵抗通路、ErbB 信號(hào)通路及胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等協(xié)調(diào)發(fā)揮治療T2DM 的作用。而丹參的主要活性成分丹參酮Ⅰ可通過(guò)抑制PTP1B 的表達(dá)，從而促進(jìn)AKT 信號(hào)通路的活化，改善胰島素抵抗［21］。女貞子、墨旱蓮滋補(bǔ)肝腎，絞股藍(lán)補(bǔ)虛清熱，三七活血祛瘀，以上四藥共為佐藥。藥理學(xué)研究證實(shí)，絞股藍(lán)及其等效成分如絞股藍(lán)多糖、絞股藍(lán)皂苷等能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝、恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)、改善胰島素抵抗和抗氧化的作用，在糖尿病的治療中發(fā)揮著重要作用。甘草解毒、調(diào)和藥性，作為使藥。全方共奏益氣養(yǎng)陰、消食散瘀的功效。本研究結(jié)果證實(shí)芪參湯對(duì)巨噬細(xì)胞的活性無(wú)明顯毒副作用，該結(jié)果提示芪參湯抗炎的作用不是通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞活性實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步藥理學(xué)研究結(jié)果顯示芪參湯能夠顯著增加M2 型巨噬細(xì)胞的比例，降低M1 型巨噬細(xì)胞的比例，從而降低IL-6 和IL-1β 的水平，增加IL-4 和IL-10 的水平，發(fā)揮抗炎的作用。機(jī)制角度，芪參湯能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞中miR-495 的表達(dá)，上調(diào)FTO 的表達(dá)水平，從而巨噬巨噬細(xì)胞M1 向M2 型極化，其藥理學(xué)作用與miR-495 抑制物趨勢(shì)相同，兩者聯(lián)用和發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上所述，在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步闡明了芪參湯改善胰島素抵抗的分子機(jī)制及靶點(diǎn)。研究結(jié)果表明，芪參湯通過(guò)miR-495/FTO 通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2 型分化，從而發(fā)揮抗炎機(jī)制，達(dá)到改善胰島素抵抗的作用。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

袁星星：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；高佳煒、楊柳欣執(zhí)：行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和指標(biāo)檢測(cè)；孫志東：負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)分析和文稿撰寫(xiě)；張雅麗：進(jìn)行最后校審。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。