周成煒 王 樺 程 玲 孔嘉欣

腎細(xì)胞癌(RCC)是最常見的泌尿系惡性腫瘤之一,據(jù)最新調(diào)查顯示,腎細(xì)胞癌是男性第9位常見惡性腫瘤和女性第14位常見惡性腫瘤[1]。腎細(xì)胞癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢,每十年以2%～4%速度上升,2018年腎細(xì)胞癌新發(fā)病例超過400000例,死亡病例超過170000例[2]。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(KIRC)是腎細(xì)胞癌最常見類型,臨床上透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌占70%～80%[3]。由于缺乏早期診斷及判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物,30%以上KIRC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移性患者預(yù)后較差,5年生存率不超過10%[4]。因此本研究將探討透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌相關(guān)分子機(jī)制,以挖掘新型臨床診斷方法及提供新的治療靶點(diǎn)。MYBL1屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中一種亞型,位于染色體8q22上,編碼兩種核蛋白,主要表達(dá)于生殖細(xì)胞、乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、T細(xì)胞、B細(xì)胞中等[5]。MYBL1表達(dá)可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡,同時(shí)可與C-MYB協(xié)同調(diào)控細(xì)胞周期,從而參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展[6]。MYBL1可通過靶向TWIST1基因表達(dá)影響肝細(xì)胞癌生長及轉(zhuǎn)移[7]。MYBL1上調(diào)可導(dǎo)致膠質(zhì)瘤發(fā)生,尤其是彌漫性膠質(zhì)瘤及低級(jí)別膠質(zhì)瘤[8]。MYBL1通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞存活參與淋巴瘤形成[9]。約60%頭頸部腺樣囊性癌患者中可檢測出MYB/MYBL1-NFIB融合[10],同時(shí)MYBL1基因重排可作為乳腺腺樣囊性癌驅(qū)動(dòng)因素[11]。除了上述腫瘤,結(jié)直腸癌[12]、胰腺癌[13]、子宮內(nèi)膜癌[14]均證實(shí)MYBL1表達(dá)量升高。目前暫無報(bào)道MYBL1在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)及相關(guān)影響,本研究將通過對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者分析,研究MYBL1對(duì)其影響,探討MYBL1對(duì)于腎透明細(xì)胞癌作為預(yù)后的生物標(biāo)志物可能性,盡可能為臨床提供新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 MYBL1表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床特征的相關(guān)性

通過癌癥基因圖譜(TCGA數(shù)據(jù)庫:收錄人類36種癌癥基因序列)下載數(shù)據(jù)庫中腎透明細(xì)胞癌的RNA-seq相關(guān)臨床資料,包含539例樣本組織和72例癌旁正常組織,獲取腎透明細(xì)胞癌臨床資料包含年齡、種族、性別、腫瘤分級(jí)、TNM分期。以MYBL1-mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)將腎透明細(xì)胞癌病例分為高、低表達(dá)兩組。

1.2 MYBL1表達(dá)與腎透明細(xì)胞中表達(dá)差異及預(yù)后分析

應(yīng)用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)和R軟件Survival包分析TCGA數(shù)據(jù)庫中MYBL1在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)差異。利用Kaplan-Meier曲線進(jìn)行生存分析MYBL1表達(dá)在腎透明細(xì)胞癌患者總生存期(OS)及無進(jìn)展間隔期(DFI)之間關(guān)系,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用受試者工作特征(ROC曲線)說明MYBL1在腎透明細(xì)胞癌中診斷價(jià)值。

1.3 MYBL1相關(guān)基因篩選、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和功能富集分析

通過LimkedOmic數(shù)據(jù)庫,數(shù)據(jù)集選擇“TCGA-KIRC”,基因?yàn)椤癕YBL1”,分析正、負(fù)相關(guān)顯著基因。通過對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行GO/KEEG分析基因相關(guān)通路。

1.4 免疫浸潤相關(guān)性分析

使用腫瘤免疫評(píng)估資源(TIMER)進(jìn)行免疫浸潤分析,進(jìn)入Gene版塊,Gene Symbol為“MYBL1”,Cancer Typers為“KIRC”,獲取MYBL在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)與B細(xì)胞、CD4+、CD8+、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的浸潤程度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件R 4.0.4及繪圖軟件Graphpad8;MYBL1表達(dá)量在腎透明細(xì)胞癌臨床特征中,兩兩比較采用卡方檢驗(yàn);腎透明細(xì)胞癌生存預(yù)后使用Kaplan-Meier和Log-Rank檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;pROC包繪制ROC曲線,通過AUC值評(píng)估診斷準(zhǔn)確性,AUC值越接近1,其診斷效能越高,AUC值介于0.5～0.7之間提示具有較低準(zhǔn)確性;AUC值介于0.7～0.9之間提示具有一定診斷效能;AUC大于0.9提示具有較高準(zhǔn)確效能。

2 結(jié)果

2.1 MYBL1表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床特征的相關(guān)性

通過TCGA數(shù)據(jù)庫獲取539例具有完整臨床特征的腎透明細(xì)胞患者,以MYBL1表達(dá)中位數(shù)分界,269例為低表達(dá)組,270例為高表達(dá)組。MYBL1表達(dá)與性別(P=0.008)、腫瘤分級(jí)(P=0.001)、T分期(P=0.02)、M分期(P=0.003)具有相關(guān)性,與種族、年齡、N分期無顯著相關(guān),見表1。

表1 MYBL1表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床特征相關(guān)性(例,%)

2.2 MYBL1在兩組中表達(dá)差異及預(yù)后分析

對(duì)腎透明細(xì)胞癌及癌旁正常組織中MYBL1表達(dá)量進(jìn)行正態(tài)性分析,P均<0.05,符合正態(tài)分布。對(duì)兩組表達(dá)量進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn),結(jié)果顯示MYBL1在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)水平(1.001±0.519)顯著高于癌旁正常組織(0.414±0.167),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1A。對(duì)腫瘤組織及癌旁正常組織MY-BL1表達(dá)量采用配對(duì)t檢驗(yàn),腫瘤組織(0.997±0.589)同樣高于正常組織(0.414±0.167),P<0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖1B。

圖1 MYBL1在腎透明細(xì)胞癌和癌旁組織中表達(dá)差異

通過KM曲線獲取MYBL1表達(dá)對(duì)患者總生存期及無進(jìn)展生存期(PFI)的影響,如圖2A,MYBL1低表達(dá)組總生存(OS)明顯優(yōu)于高表達(dá)組,HR=1.51,95%CI(1.12～2.04),P<0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2B顯示MYBL1低表達(dá)組無進(jìn)展期更長,HR=1.38,95%CI(1.01～1.89),P<0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 MYBL1表達(dá)對(duì)腎透明細(xì)胞癌的診斷及預(yù)后判斷價(jià)值

如圖2C,ROC曲線下面積為0.926,可信區(qū)間為(0.89～0.926),提示標(biāo)量MYBL1在腎透明細(xì)胞癌中具有較高準(zhǔn)確性,因此,MYBL1具有作為腎透明細(xì)胞癌的診斷分子標(biāo)志物的可能。

2.3 MYBL1相關(guān)基因及GO/KEEG通路分析

正相關(guān)前50依次為E2F7(相關(guān)系數(shù)R:0.628)、CENPE(0.626)、POLQ(0.625)等等。前50負(fù)相關(guān)顯著基因,前3位分別為PINK1(-0.511)、PCCA(-0.465)、BAG1(-0.463)。對(duì)MYBL1正、負(fù)相關(guān)顯著基因進(jìn)行GO/KEEG通路分析,包含生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)、分子功能(MF)三方面,參與細(xì)胞器分裂、細(xì)胞核分裂、染色體分離以及ATP酶活性和偶聯(lián)、微管運(yùn)動(dòng)等多種細(xì)胞周期活動(dòng),見表2。

表2 MYBL1相關(guān)基因GO/KEEG

2.4 免疫浸潤相關(guān)性分析

如圖3,MYBL1表達(dá)與B細(xì)胞(cor=0.209)、CD4+T細(xì)胞(cor=0.178)、CD8+T細(xì)胞(cor=0.388)、巨噬細(xì)胞(cor=0.331)、中性粒細(xì)胞(cor=0.484)、樹突狀細(xì)胞(cor=0.331)等呈正相關(guān),且各P均<0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

盡管癌癥治療發(fā)展迅速,但腎透明細(xì)胞癌死亡率仍居高不下,最主要原因是腎透明細(xì)胞癌早期缺乏典型癥狀,以致診斷時(shí)往往為腫瘤晚期,失去手術(shù)機(jī)會(huì),且腎透明細(xì)胞癌對(duì)放療和化療敏感性較差[15]。為早期診斷及預(yù)后判斷尋找敏感基因是本研究中重點(diǎn)。

MYBL1參與細(xì)胞周期調(diào)控,染色體易位、基因重排等方式使得MYBL1負(fù)性調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域缺失,進(jìn)一步引起細(xì)胞增殖失控,從而對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用[6],通過影響細(xì)胞周期調(diào)控參與腫瘤產(chǎn)生與本文KEEG富集通路分析結(jié)果相一致。MYBL1參與肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、腺樣癌以及多種血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫納入539例KIRC臨床資料,以MYBL1中位數(shù)為界分低表達(dá)組、高表達(dá)組,MYBL1表達(dá)與性別、腫瘤分期、T分期、M分期有關(guān)。同時(shí)本研究觀察到MYBL1在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)量高于癌旁正常組織,因此對(duì)于臨床實(shí)踐中,可通過檢測MYBL1表達(dá)量作為腎透明細(xì)胞癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)物。同時(shí)對(duì)于MYBL1在腎透明細(xì)胞癌患者中不同表達(dá)量進(jìn)行生存分析,MYBL1表達(dá)與OS、PFI等生存指標(biāo)成反比,因此MYBL1可作為腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)志物。通過對(duì)MYBL1及其相關(guān)基因進(jìn)行分析,進(jìn)一步研究其對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,通過GO/KEEG通路分析,MYBL1參與細(xì)胞周期調(diào)控,以及細(xì)胞器裂解、核裂變、ATP酶活性和偶聯(lián)、微管運(yùn)動(dòng)等多種細(xì)胞周期活動(dòng)。MYBL1與多種免疫細(xì)胞相關(guān),其表達(dá)與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞成正相關(guān),為將來免疫治療提供更廣闊思路。

通過本研究闡述,MYBL1表達(dá)在腎透明細(xì)胞癌的早期診斷及預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)物具有一定意義,且其表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤為將來新的免疫治療提供理論依據(jù)。