李 彧 李連香 奚逢瑜 薛敬東 葉苗青 楊躍青 黨 珊 張 鴻 段降龍 高 瑛

近5年我國肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生例數(shù)占全球42.5%,根據(jù)2020年報道,我國HCC發(fā)病率居所有惡性腫瘤第5位,死亡率居第2位[1]。以抗程序性死亡受體-1(programmed death-1,PD-1)抗體及抗PD-L1抗體為代表的免疫檢查點(diǎn)分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)為HCC治療提供了新的思路[2],進(jìn)一步說明免疫因素在HCC發(fā)生發(fā)展中的發(fā)揮重要作用。以細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)雜免疫網(wǎng)絡(luò)參與了HCC發(fā)病,白細(xì)胞介素-35(interleukin-35,IL-35)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子,屬于IL-12細(xì)胞因子家族成員,是由EB病毒誘導(dǎo)基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)和IL-12p35構(gòu)成的異源二聚體,主要由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)分泌,并可正反饋促進(jìn)Treg功能,在肝臟疾病中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用[3]。但I(xiàn)L-35對HCC患者Treg的調(diào)控作用尚未見相關(guān)報道。因此,本研究擬以HCC患者為研究對象,觀察HCC患者IL-35的表達(dá)和Treg的比例,利用體外細(xì)胞培養(yǎng)體系,觀察外源性IL-35對HCC患者Treg活性的調(diào)控效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

入組2018年12月至2019年6月在陜西省人民醫(yī)院和陜西省中醫(yī)醫(yī)院就診的HCC患者。入組標(biāo)準(zhǔn):①年齡18～65歲;②取得知情同意;③診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[4]的標(biāo)準(zhǔn);④未接受過手術(shù)、化療、放療、介入、靶向或免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他惡性腫瘤;②合并心臟、肝臟、腎臟等重要器官系統(tǒng)功能衰竭或嚴(yán)重感染;③合并自身免疫性疾病;④妊娠及哺乳期婦女。入組同時期年齡和性別匹配的健康志愿者作為正常對照(normal control,NC)。本研究方案已通過陜西省人民醫(yī)院和陜西省中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審批,所有志愿者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 血漿和外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)分離 采集EDTA抗凝外周血20 ml,1000 r/min離心10 min后采集上層血漿凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。下層血?xì)胞使用人淋巴細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)、采用密度梯度離心法分離PBMC,凍存于液氮中備用。

1.2.2 CD4+CD25+CD127dim/-Treg純化 使用人CD4+CD25+CD127dim/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞純化試劑盒II(德國美天旎公司)純化Treg。取107個PBMC,加入10 μl CD4+CD25+CD127dim/-T細(xì)胞生物素抗體雞尾酒(包含生物素標(biāo)記的抗人CD8、抗人CD19、抗人CD123和抗人CD127),混勻、孵育、洗滌后加入LD分離柱,收集穿過分離柱的未標(biāo)記細(xì)胞即為CD4+CD127dim/-細(xì)胞。純化的CD4+CD127dim/-細(xì)胞加入10 μl CD25 Microbeads,混勻、孵育、洗滌后加入LD分離柱,收集未穿過分離柱的標(biāo)記細(xì)胞即為CD4+CD25+CD127dim/-Treg。

1.2.3 細(xì)胞刺激培養(yǎng) 所有HCC患者的PBMC(105個)加入重組人IL-35(美國Peprotech公司;終濃度1 ng/ml)[5-6]刺激培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。隨機(jī)選擇19例HCC患者純化的CD4+CD25+CD127dim/-Treg加入重組人IL-35(終濃度1 ng/ml)刺激培養(yǎng)24 h,洗滌2次去除外源性IL-35,然后取104個刺激后的CD4+CD25+CD127dim/-Treg,與105個自體PBMC共培養(yǎng)系統(tǒng),48 h后收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例 將PBMC轉(zhuǎn)入FACS管中,PBS洗滌2次,加入抗人CD3-PerCP、抗人CD4-FITC、抗人CD25-APC、抗人CD127-PE(均購自美國BD公司),于4 ℃避光孵育30 min,使用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR法檢測EBI3、IL-12p35、PD-1、T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3,TIM-3)、淋巴細(xì)胞活化基因3(lymphocyte-activation gene-3,LAG-3)mRNA相對表達(dá)量 提取細(xì)胞總RNA,將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用PrimeScript RT Reagent Kit(Perfect Real Time)(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:5×PrimeScript Buffer (for Real Time) 2 μl、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μl、Oligo dT Primer (50 μM) 0.5 μl、Random 6 mers (50 μM) 0.5 μl、總RNA 1 μg,加入RNase Free水調(diào)整總體積至10 μl。反轉(zhuǎn)錄條件:37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s。使用TB Green Premix實(shí)時定量PCR試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行實(shí)時定量PCR,實(shí)時熒光定量PCR體系:TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2×) 10 μl、PCR上游引物 (10 μM) 0.8 μl、PCR下游引物 (10 μM) 0.8 μl、ROX Reference Dye (50×) 0.4 μl、RT反應(yīng)液 2 μl,滅菌水 6 μl。實(shí)時定量PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性:95 ℃ 30 s 1個循環(huán),PCR反應(yīng) 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s 40個循環(huán)。PCR引物參考既往發(fā)表文獻(xiàn)[7,8]合成。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測血漿IL-35水平和培養(yǎng)上清中干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、IL-10、IL-35水平 使用武漢華美生物公司商品化ELISA試劑盒進(jìn)行檢測,操作按說明書進(jìn)行。將100 μl樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入包被的ELISA平板中,室溫孵育90 min后,棄液體甩干后加入100 μl生物素標(biāo)記的抗體工作液,室溫孵育60 min,洗板后加入100 μl辣根過氧化物酶結(jié)合工作液,室溫孵育30 min,洗板后加入TMB底物溶液90 μl,室溫孵育15 min后加入終止液50 μl。450 nm波長處讀取吸光度,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中細(xì)胞因子水平。

1.2.7 細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)法檢測細(xì)胞增殖 使用CCK-8試劑盒(武漢碧云天公司)進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測,在培養(yǎng)的最后的4 h向培養(yǎng)液中加入10% CCK-8溶液,培養(yǎng)結(jié)束后在450 nm波長處讀取吸光度,通過已知細(xì)胞數(shù)量的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣本中的細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。首先對計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),所有計量資料均符合正態(tài)分布,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計量資料的組間比較采用t檢驗(yàn)或配對t檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析,計數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者和NC的一般資料比較

本研究共入組51例HCC患者和25例NC,一般資料見表1。

表1 HCC患者和NC一般資料比較

2.2 CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例和IL-35在HCC患者中的變化

通過前向角光散射(forward scatter,FSC)和側(cè)向角光散射(side scatter,SSC)去除碎片和死亡細(xì)胞,在以CD3+CD4+T細(xì)胞門內(nèi),檢測CD25+CD127dim/-細(xì)胞(圖1)。HCC組CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例顯著高于NC組。HCC組血漿IL-35水平顯著高于NC組。HCC組PBMC中EBI3和IL-12p35 mRNA相對表達(dá)量均顯著高于NC組,見表2。HCC組中CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例與血漿IL-35水平呈顯著正相關(guān)(γ=0.400,P=0.0036,圖2)。

圖1 HCC組和NC組PBMC中CD4+CD25+CD127dim/-Treg典型流式檢測散點(diǎn)圖

圖2 HCC組CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例與血漿IL-35水平相關(guān)性分析

表2 HCC組和對照組血漿IL-35和PBMC中EBI3、IL-12p35 mRNA相對表達(dá)量比較

2.3 IL-35對HCC患者CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例和EBI3、IL-12p35 mRNA相對表達(dá)量的影響

51例HCC患者分離的PBMC使用重組人IL-35刺激培養(yǎng)24 h后,CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例較無IL-35刺激時升高。PBMC中EBI3和IL-12p35 mRNA相對表達(dá)量經(jīng)IL-35刺激后較無IL-35刺激顯著升高,見表3。

表3 IL-35對HCC患者PBMC中CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例和EBI3、IL-12p35 mRNA相對表達(dá)量的影響

2.4 IL-35對HCC患者CD4+CD25+CD127dim/-Treg中免疫檢查點(diǎn)受體、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的影響

19例HCC患者純化的CD4+CD25+CD127dim/-Treg經(jīng)IL-35刺激后,免疫檢查點(diǎn)受體PD-1、TIM-3和LAG-3 mRNA水平均升高,其抑制自體PBMC增殖的能力增強(qiáng),共培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞數(shù)量減少。在共培養(yǎng)上清中,IFN-γ分泌水平在經(jīng)IL-35刺激的Treg中顯著降低,而IL-10和IL-35分泌水平在經(jīng)IL-35刺激的Treg中顯著升高,見表4。

表4 IL-35對HCC患者CD4+CD25+CD127dim/-Treg免疫檢查點(diǎn)受體、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的影響

3 討論

IL-35在腫瘤疾病過程中主要發(fā)揮抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的作用。抑制小鼠腫瘤微環(huán)境中IL-35表達(dá)可增強(qiáng)T細(xì)胞增殖、增加T細(xì)胞效應(yīng)功能和抗原提呈活性、抑制免疫檢查點(diǎn)受體(包括:PD-1、TIM-3和LAG-3),降低T細(xì)胞功能衰竭[9]。但I(xiàn)L-35的表達(dá)變化在不同腫瘤中卻存在差異。IL-35在乳腺癌[10]、前列腺癌[11]、急性髓系白血病[12]、結(jié)直腸癌[13]患者外周血中的水平升高,但是,在非小細(xì)胞肺癌患者外周血IL-35水平與健康對照者比較無明顯變化,僅在腫瘤微環(huán)境中的浸潤水平較未發(fā)生腫瘤的肺部顯著升高[14]。本研究所發(fā)現(xiàn)的HCC患者血漿IL-35水平升高的結(jié)果與既往報道一致[6,15]。同時,本研究從轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)HCC患者PBMC中IL-35組成亞基EBI3和IL-12p35 mRNA相對表達(dá)量均顯著升高,與血漿蛋白表達(dá)水平一致。由于Treg是IL-35的主要來源,本研究進(jìn)一步對CD4+CD25+CD127dim/-Treg在HCC患者的水平進(jìn)行了分析,與既往的研究結(jié)果一致[16],HCC患者外周血Treg比例較對照者顯著升高。更為重要的是,HCC患者血漿IL-35水平與CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例呈顯著正相關(guān),進(jìn)一步說明CD4+CD25+CD127dim/-Treg是HCC患者IL-35的主要來源之一,參與HCC的發(fā)病過程。

IL-35在肝臟疾病過程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用。在慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎感染過程中,IL-35在增強(qiáng)調(diào)節(jié)性Treg免疫抑制活性的同時可抑制效應(yīng)性Th17細(xì)胞功能,也可抑制CD8+T細(xì)胞毒性作用,從而抑制病毒性肝炎誘導(dǎo)的肝臟炎癥應(yīng)答,發(fā)揮免疫抑制功能[5,17-18]。在慢加急性肝衰竭和HCC疾病過程中,IL-35主要促進(jìn)免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá),降低細(xì)胞毒性分子表達(dá),從而抑制CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[6,19]。但有關(guān)IL-35對HCC患者Treg功能調(diào)控的研究罕見報道。在呼吸機(jī)相關(guān)肺炎中的研究發(fā)現(xiàn),外源性IL-35對刺激患者支氣管肺泡灌洗液純化的Treg可增強(qiáng)其免疫抑制活性,主要表現(xiàn)為細(xì)胞增殖減弱、抑制性細(xì)胞因子分泌增強(qiáng)、促炎因子分泌較少[20]。本研究亦發(fā)現(xiàn),外源性IL-35可促進(jìn)HCC患者PBMC中CD4+CD25+CD127dim/-Treg的比例,也可增加IL-35亞基EBI3和IL-12p35 mRNA水平,提示IL-35可增強(qiáng)Treg比例和IL-35表達(dá),對Treg發(fā)揮正反饋?zhàn)饔?這與在結(jié)腸癌中的發(fā)現(xiàn)一致[21]。更為重要的是,外源性IL-35也可調(diào)控HCC患者Treg的免疫抑制功能,IL-35可促進(jìn)HCC患者Treg中免疫檢查點(diǎn)受體的表達(dá)[22],抑制PBMC增殖以及分泌抑制性細(xì)胞因子的能力均增強(qiáng),IFN-γ分泌水平降低,以上結(jié)果均提示IL-35可通過增強(qiáng)Treg的免疫抑制活性參與HCC免疫發(fā)病,促進(jìn)HCC疾病進(jìn)展。

綜上所述,HCC患者外周血中存在升高表達(dá)的IL-35和CD4+CD25+CD127dim/-Treg,Treg作為IL-35的主要來源,在HCC疾病過程中可能發(fā)揮正反饋?zhàn)饔?促進(jìn)Treg的增殖和活性,進(jìn)一步誘導(dǎo)HCC疾病中的免疫耐受,促進(jìn)HCC疾病進(jìn)展。