寧丞君 王 瑜 胡邵霖

肺癌是威脅人類生命健康的全球性問題,化療是臨床上治療肺癌的重要手段,順鉑(cisplatin,DDP)是常用的化療藥物,但是長期應(yīng)用,腫瘤細胞則會對其產(chǎn)生耐藥性,導致患者化療效果不佳[1],因此尋找能有效增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性,降低其耐藥性的藥物,對肺癌的治療將是一個重大的突破。淫羊藿苷(icariin,ICA)是從淫羊藿屬植物中提取的一種活性成分,研究表明,ICA通過抑制自噬,可增強順鉑耐藥卵巢癌細胞的化療敏感性[2]。此外,ICA通過降低乳腺癌細胞對它莫昔芬的耐藥性,從而促進細胞凋亡,降低細胞增殖遷移能力[3]。白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)/信號傳導子及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcrip-tion3,STAT3)信號通路在細胞增殖、分化過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在肝癌的發(fā)生發(fā)展中IL-6/STAT3信號通路被激活,隱甲腎上腺素通過抑制該信號通路誘導癌細胞凋亡[4]。二肽基肽酶 Ⅳ激活I(lǐng)L-6/STAT3信號通路促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖,增強癌細胞體內(nèi)致瘤性[5]。本研究以肺癌A549/DDP順鉑耐藥細胞為研究對象,探討ICA逆轉(zhuǎn)A549/DPP細胞耐藥性的影響,及對IL-6/STAT3信號通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人肺癌A549/DDP耐藥細胞株購自中科院上海細胞庫,培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天更換一次培養(yǎng)基,當細胞融合率達到80%時,胰蛋白酶消化傳代,傳至第4代后,取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2 試劑和儀器

ICA(純度≥98%)購自上海純優(yōu)生物科技有限公司;Transwell小室購自北京優(yōu)尼康生物技術(shù)有限公司;Matrix基質(zhì)膠購自上海BD公司;DDP購自美國Sigma-Aldrich公司;MTT試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;肺耐藥蛋白(lung resistance-related protein,LRP)和多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司;兔抗人IL-6、STAT3、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associad X,Bax)購自美國Invitrogen公司;多功能酶標儀購自美國Bio-Rad公司;電泳儀購自美國伯樂公司。

1.3 MTT法檢測不同濃度ICA對A549/DDP細胞增殖率的影響

取對數(shù)生長期的A549/DDP細胞,DMEM培養(yǎng)基將細胞制成單細胞懸液,以1×105個/孔接種于96孔板,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,將細胞隨機分為A549/DDP組、ICA組(ICA濃度為10、20、50、100、200 μmol/L),每組設(shè)置5個復(fù)孔,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL,培養(yǎng)4 h后棄掉上清,加入DMSO 150 μL,充分混勻后,置于酶標儀上,490 nm波長處檢測吸光度(A)值,細胞增殖率(%)=(AICA-A)/(AA549-A)×100%。

1.4 MTT法檢測不同濃度ICA對A549/DDP細胞耐藥性的影響

收集對數(shù)生長期的A549/DDP細胞,制成單細胞懸液,以1×105個/孔接種于96孔板,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,將細胞隨機分為DDP組、DDP+ICA-50 μmol/L組、DDP+ICA-100 μmol/L組。DDP組細胞加入DDP(DDP濃度為0、4、8、16、32 μg/mL),DD-P+ICA-50 μmol/L組和DDP+ICA-100 μmol/L組細胞加入上述濃度DDP后,再加入濃度分別為50 μmol/L和100 μmol/L的ICA,每組設(shè)置5個復(fù)孔,培養(yǎng)48 h后,再加入MTT溶液孵育4 h,棄掉上清,再加入DMSO 150 μL振蕩混勻,490 nm波長處檢測吸光度(A)值,計算細胞增殖率和半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration,IC50)。

1.5 ICA對A549/DDP細胞凋亡率的影響

收集對數(shù)生長期的A549/DDP細胞,制成單細胞懸液,以1×105個/孔接種于96孔板,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,將細胞隨機分為A549/DPP組、DDP組、DDP+ICA-1組,DDP+ICA-2組,DDP組細胞加入4 μg/mL DPP,DDP+ICA-1組和DDP+ICA-2組細胞加入4 μg/mL DPP后,再分別加入ICA 50 μmol/L和100 μmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細胞,PBS清洗細胞,500 μL Binding buffer將細胞重懸,細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC,振蕩混勻,再加入PI 5 μL,避光孵育10 min,上機檢測。

1.6 ICA對A549/DDP細胞侵襲能力的影響

細胞處理及分組同1.5,培養(yǎng)48 h后,收集細胞,制成細胞懸液,以密度為2×104個/孔接種于Transwell上室(已鋪基質(zhì)膠),每孔接種200 μL,下室中加入600 μL DMEM培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h,取出上室,甲醛固定20 min,用棉簽輕輕擦掉上室多余細胞,1%結(jié)晶紫染色15 min,PBS清洗2次,顯微鏡下觀察,并計數(shù)。

1.7 ICA對LRP和MRP mRNA相對表達量的影響

細胞處理及分組同1.5,培養(yǎng)48 h后,收集細胞,加入Trizol提取細胞總RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,進行PCR擴增,反應(yīng)體系為:dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq酶0.3 μL+MgCl2 1.5 μL+cDNA模板2 μL+上下游引物各1 μL,加ddH2O至總體積25 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán),72 ℃延伸10 min,以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△CT方法計算LRP和MRP mRNA相對表達量,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 ICA對IL-6、p-STAT3、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量的影響

細胞處理及分組同1.5,培養(yǎng)48 h后,收集細胞,加入RIPA裂解液裂解30 min,4 ℃ 12000 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm),收集上清液,BCA法測定蛋白濃度,裂解液調(diào)整蛋白濃度,100 ℃煮沸,使蛋白變性穩(wěn)定,120 v電泳2 h,0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h,TBST洗膜,封閉1 h,4 ℃條件下IL-6、p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2和GAPDH一抗(1∶1000)孵育過夜,TBST洗膜,二抗(1∶5000)室溫孵育1 h,ECL法顯色,Image J分析蛋白條帶灰度值,目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值=目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖能力比較

與A549/DPP組比較,10和20 μmol/L ICA處理后細胞增殖率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),50、100和200 μmol/L ICA處理后細胞增殖率降低,且具有劑量依賴性(P<0.05),見表2。

表2 各組細胞增殖率比較

2.2 各組細胞化療耐藥性比較

DDP組、DDP+ICA-50 μmol/L組和DDP+ICA-100 μmol/L組細胞的IC50分別為(18.36±2.05)μg/mL、(9.47±2.32)μg/mL和(5.61±1.78)μg/mL。與DDP組比較,DDP+ICA-50 μmol/L組和DDP+ICA-100 μmol/L組細胞IC50均降低(P<0.05);與DDP+ICA-50 μmol/L組比較,DDP+ICA-100 μmol/L組細胞IC50降低(P<0.05)。

相同濃度DDP時,與DDP組比較,DDP+ICA-50 μmol/L組和DDP+ICA-100 μmol/L組細胞增殖率降低(P<0.05);與DDP+ICA-50 μmol/L組比較,DDP+ICA-100 μmol/L組細胞增殖率降低(P<0.05);隨DDP濃度的增加,各組細胞增殖率降低,差異有統(tǒng)計學意義,且具有濃度依賴性(P<0.05),見表3。

表3 各組細胞增殖率比較

2.3 各組細胞凋亡率比較

細胞凋亡率組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與A549/DPP組比較,DDP組、DDP+ICA-1組和DDP+ICA-2組細胞凋亡率升高(P<0.05);與DDP組比較,DDP+ICA-1組和DDP+ICA-2組細胞凋亡率升高(P<0.05);與DDP+ICA-1組比較,DDP+ICA-2組細胞凋亡率升高(P<0.05),見表4。

表4 各組細胞凋亡率比較

2.4 各組細胞侵襲能力比較

侵襲細胞數(shù)組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與A549/DPP組比較,DDP組、DDP+ICA-1組和DDP+ICA-2組侵襲細胞數(shù)減少(P<0.05);與DDP組比較,DDP+ICA-1組和DDP+ICA-2組侵襲細胞數(shù)減少(P<0.05);與DDP+ICA-1組比較,DDP+ICA-2組侵襲細胞數(shù)減少(P<0.05),見表5。

表5 各組侵襲細胞數(shù)比較

2.5 各組細胞LRP和MRP mRNA相對表達量比較

LRP和MRP mRNA相對表達量組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與A549/DPP組比較,DDP組、DDP+ICA-1組和DDP+ICA-2組LRP和MRP mRNA相對表達量降低(P<0.05);與DDP組比較,DDP+ICA-1組和DDP+ICA-2組LRP和MRP mRNA相對表達量降低(P<0.05);與DDP+ICA-1組比較,DDP+ICA-2組LRP和MRP mRNA相對表達量降低(P<0.05),見表6。

表6 各組細胞LRP和MRP mRNA相對表達量比較

2.6 各組細胞IL-6、p-STAT3、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量比較

IL-6、p-STAT3、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與A549/DPP組比較,DDP組、DDP+ICA-1組和DDP+ICA-2組IL-6、p-STAT3和Bcl-2蛋白相對表達量降低,Bax蛋白相對表達量升高(P<0.05);與DDP組比較,DDP+ICA-1組和DDP+ICA-2組IL-6、p-STAT3和Bcl-2蛋白相對表達量降低,Bax蛋白相對表達量升高(P<0.05);與DDP+ICA-1組比較,DDP+ICA-2組IL-6、p-STAT3和Bcl-2蛋白相對表達量降低,Bax蛋白相對表達量升高(P<0.05),見表7。

表7 各組細胞中IL-6、p-STAT3、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量比較

A為A549/DPP組;B為DDP組;C為DDP+ICA-1組;D為DDP+ICA-2組。圖1 A549/DDP細胞中蛋白表達情況

3 討論

根據(jù)病理組織學特征,臨床上將肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌,由于病理亞型存在多樣性,亞型之間的異質(zhì)性以及治療中出現(xiàn)的耐藥性,造成肺癌治療效果差,多數(shù)肺癌患者就診時已是晚期,且腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移,所以無法進行手術(shù)治療,因此化療是治療肺癌的首選手段。而DDP是治療晚期非手術(shù)肺癌的常用藥物,但化療藥物耐藥性的問題仍不可避免,但目前細胞耐藥機制仍不明確,因此肺癌細胞順鉑耐藥機制的研究具有一定臨床意義。

ICA是我國的傳統(tǒng)中藥,是一種黃酮類化合物,具有抗炎,抗氧化及抗腫瘤等多種藥理學活性。研究發(fā)現(xiàn),ICA通過激活自噬相關(guān)蛋白,具有延緩D-半乳糖引起的腦衰老作用[6]。ICA通過促進凋亡蛋白的表達,降低抗凋亡蛋白的表達,從而抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的生長[7]。此外,ICA在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性中的作用已見報道,Jiang等[8]研究發(fā)現(xiàn),ICA可誘導多藥耐藥卵巢癌細胞凋亡,降低癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。Wang等[9]研究表明ICA可逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥人骨肉瘤細胞的多藥耐藥。本研究采用不同濃度ICA處理A549/DDP后,MTT法檢測結(jié)果顯示:隨著ICA濃度的升高,細胞增殖率逐漸降低。采用50 μmol/L和100 μmol/L ICA處理經(jīng)不同濃度DDP培養(yǎng)的A549/DDP細胞,結(jié)果顯示:ICA可提高A549/DDP細胞對DDP的敏感性,降低DDP對細胞的IC50。采用4 μg/mL DDP和50、100 μmol/L ICA處理A549/DDP細胞,結(jié)果顯示:ICA提高A549/DDP細胞的凋亡率,降低細胞侵襲能力,并存在劑量依賴性。多藥耐藥(MDR)是造成腫瘤細胞化療效果不佳的重要原因之一,MDR發(fā)生機制復(fù)雜,MRP和LRP是引起MDR的重要原因,MRP通過參與轉(zhuǎn)運GS-X復(fù)合物和運輸胞質(zhì)囊泡產(chǎn)生耐藥,LRP通過阻滯藥物在核內(nèi)聚集或?qū)⒓毎|(zhì)中的藥物運輸?shù)侥遗?通過胞吐作用將其排除細胞外,從而產(chǎn)生耐藥性。Shen等[10]研究表明A549/DDP細胞中MRP和LRP表達升高。本研究采用PCR法檢測MRP和LRP mRNA相對表達量,結(jié)果顯示:50和100 μmol/L ICA降低MRP和LRP mRNA相對表達量,且具有劑量依賴性。結(jié)果提示:ICA可增強A549/DPP細胞對順鉑的敏感性,降低其耐藥性。

IL-6/STAT3信號通路激活在多種癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程中具有重要作用,IL-6是銜接炎癥和腫瘤最核心的炎癥因子,在調(diào)節(jié)免疫功能、炎癥反應(yīng)和促進腫瘤生長等生物學過程中發(fā)揮作用,STAT3通過將炎癥因子介導的細胞外信號傳遞至細胞內(nèi),重新編碼細胞內(nèi)基因,參與調(diào)控腫瘤細胞的惡性行為學[11]。三苯氧胺通過抑制IL-6/STAT3信號通路降低星形膠質(zhì)細胞腦轉(zhuǎn)移,并逆轉(zhuǎn)癌細胞耐藥性[12]。靶向抑制IL-6/STAT3信號級聯(lián)可逆轉(zhuǎn)雌激素受體陽性乳腺癌三苯氧胺耐藥[13]。細胞凋亡手機提的嚴密調(diào)控,設(shè)計多個基因的激活,Bcl-2家族中促凋亡分子和抗凋亡分子間的平衡對細胞線粒體膜電位的穩(wěn)定性至關(guān)重要,Bcl-2和Bax對細胞凋亡有著“分子開關(guān)”的作用,Bax主要位于細胞質(zhì)中,一旦細胞接收到凋亡信號,其由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體膜上,導致線粒體膜上分子通道開放,使促凋亡因子大量釋放。Bcl-2是線粒體上重要的跨膜蛋白,與Bax結(jié)合可形成二聚體,從而穩(wěn)定線粒體膜電位,降低促凋亡因子釋放,發(fā)揮抗細胞凋亡作用[14]。本研究中蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示:50和100 μmol/L ICA可降低IL-6、p-STAT3和Bcl-2蛋白相對表達量降低,Bax蛋白相對表達量升高。結(jié)果提示:ICA抑制IL-6/STAT3信號通路,發(fā)揮促凋亡作用。

綜上所述,ICA可降低A549/DDP細胞順鉑耐藥性,其可能是通過抑制IL-6/STAT3信號通路發(fā)揮作用,為臨床治療肺癌提供新的理論依據(jù)。