朵建英, 陳 海, 徐 敏, 邸 麗, 朱文佳, 黃 月, 文欣玫, 盧 巖, 王 敏, 笪宇威

淀粉樣物質(zhì)是由蛋白質(zhì)變性所致,亦可稱為淀粉樣變。淀粉變性病是由于不同結(jié)構(gòu)的異常蛋白在機(jī)體內(nèi)不同組織和器官沉積所致[1-4]。淀粉樣物質(zhì)可沉淀在血管周圍,累及周圍神經(jīng),導(dǎo)致淀粉樣變性周圍神經(jīng)病[5-7]。剛果紅染色是對(duì)淀粉樣物質(zhì)沉積最經(jīng)典且有效的病理染色方法[8-11]。實(shí)驗(yàn)室常用石蠟切片進(jìn)行剛果紅染色[9],不同試劑盒、染色流程、染色條件均會(huì)影響染色結(jié)果[12-14]。即使是使用同一試劑盒,對(duì)于不同組織的染色條件也有所差別[15-16]。筆者在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn),應(yīng)用剛果紅染色試劑盒對(duì)石蠟及冰凍標(biāo)本進(jìn)行染色(染色時(shí)間5 min),冰凍肌肉標(biāo)本可得到良好的染色結(jié)果,但冰凍神經(jīng)標(biāo)本往往觀察不到理想的結(jié)果。鑒此,筆者通過(guò)對(duì)染色時(shí)間及切片厚度進(jìn)行了反復(fù)測(cè)試,以期獲得神經(jīng)冰凍切片剛果紅染色的最佳條件,為淀粉樣周圍神經(jīng)病的快速病理診斷提供準(zhǔn)確證據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 選擇2022年8月于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的1例淀粉樣周圍神經(jīng)病患者,取得腓腸神經(jīng)的活檢組織標(biāo)本,迅速進(jìn)行液氮冷凍處理,以O(shè)CT(optimal cutting temperature compound)包埋劑包埋,固定于軟木片上,-80 ℃冰箱長(zhǎng)期保存?zhèn)錂z。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)活檢標(biāo)本未發(fā)現(xiàn)異常物質(zhì)沉積;(2)活檢石蠟標(biāo)本切片剛果紅染色偏振光下未見蘋果綠色。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2剛果紅染色方法

1.2.1 染色試劑 淀粉樣物質(zhì)染色液(Highman剛果紅法,雷根生物,DG0022),包括Highman剛果紅染色液(A液)、堿性乙醇分化液(B液)、Leagene蘇木素染色液(C液)。

1.2.2 標(biāo)本制備 將神經(jīng)組織標(biāo)本進(jìn)行冰凍切片(橫切或縱切),切片后采用丙酮固定15 min。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 本研究主要觀察剛果紅染色時(shí)間及切片厚度對(duì)染色結(jié)果的影響。染色時(shí)間設(shè)置5 min、10 min、15 min、20 min四個(gè)亞組;切片厚度設(shè)置6 μm、8 μm兩個(gè)亞組,共8組,每組橫切和縱切各3張切片。

1.2.4 染色過(guò)程 將固定后的冰凍切片以自來(lái)水沖洗1 min,根據(jù)分組放入Highman剛果紅染色液(A液)分別浸染5 min、10 min、15 min、20 min。隨后將切片放入堿性乙醇分化液(B液)分化5 s,予自來(lái)水沖洗1 min終止分化。將切片放入Leagene蘇木素染色液(C液),染核1 min,自來(lái)水沖洗5 min,放入蒸餾水分化2 min。逐級(jí)常規(guī)乙醇脫水,以二甲苯進(jìn)行透明化處理,中性樹膠封片。

1.2.5 染色結(jié)果觀察 使用Leica DM2500光學(xué)顯微鏡對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察。以神經(jīng)組織切片中出現(xiàn)磚紅色無(wú)定型物質(zhì)(一般為團(tuán)塊狀),并且該物質(zhì)在偏振光下呈現(xiàn)蘋果綠色雙折光,則判定為剛果紅染色陽(yáng)性。在普通光學(xué)顯微鏡下,淀粉樣蛋白磚紅色按照著色強(qiáng)度分為弱(略顯磚紅色)和強(qiáng)(顯鮮艷磚紅色)兩個(gè)等級(jí)。在熒光顯微鏡下(激發(fā)光波長(zhǎng)540～565 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)605～660 nm),淀粉樣蛋白呈大紅色熒光,按照熒光強(qiáng)弱分為弱(略顯紅色熒光)和強(qiáng)(顯現(xiàn)十分鮮艷紅色熒光)兩個(gè)等級(jí)。

1.3組織化學(xué)染色方法

1.3.1 標(biāo)本制備 將神經(jīng)組織標(biāo)本進(jìn)行冰凍切片,縱切或橫切,厚度為6 μm、8 μm各3張切片。

1.3.2 蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin,HE) 切片晾干后進(jìn)行HE染色:切片置入Harris蘇木精液2 min,自來(lái)水沖洗10 min后置入1%伊紅1 min;自來(lái)水快速?zèng)_洗1 min,逐級(jí)常規(guī)乙醇脫水,以二甲苯進(jìn)行透明化處理,中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1HE染色及剛果紅染色結(jié)果 HE染色切片可觀察到有淀粉樣物質(zhì)沉積物,呈不定形的粉紅色團(tuán)塊狀物質(zhì),偏振光下該物質(zhì)團(tuán)呈蘋果綠色。石蠟切片、冰凍切片經(jīng)HE染色和剛果紅染色后在光鏡下均能觀察到粉紅色物質(zhì)沉積及磚紅色物質(zhì)。但冰凍切片整體對(duì)比度更強(qiáng),特別是經(jīng)剛果紅染色時(shí),冰凍切片能更好地將淀粉樣物質(zhì)沉積從背景顏色中區(qū)分出來(lái)。偏振光下石蠟切片及冰凍切片均能觀察到蘋果綠色。見圖1。

?～?為石蠟切片觀察所見:?神經(jīng)內(nèi)膜見粉紅色團(tuán)塊狀物質(zhì),著色弱(HE染色,×100);?神經(jīng)內(nèi)膜見粉紅色團(tuán)塊狀物質(zhì),著色弱(HE染色,×200);?神經(jīng)內(nèi)膜見磚紅色團(tuán)塊狀物質(zhì),著色強(qiáng)(剛果紅染色,×100);?偏光鏡下觀察見蘋果綠樣沉積(剛果紅染色,×200)。?～?為冰凍切片觀察所見:?神經(jīng)內(nèi)膜見粉紅色團(tuán)塊狀物質(zhì),著色弱(HE染色,×100);?神經(jīng)內(nèi)膜見粉紅色團(tuán)塊狀物質(zhì),著色弱(HE染色,×200);?神經(jīng)內(nèi)膜見磚紅色團(tuán)塊狀物質(zhì),著色強(qiáng)(剛果紅染色,×100);?偏光鏡下觀察見蘋果綠樣沉積(剛果紅染色,×200)

2.2不同剛果紅染色條件下光鏡觀察結(jié)果比較 染色時(shí)間為5 min時(shí),6 μm厚的冰凍切片在光鏡下觀察到微弱的磚紅色物質(zhì),在偏振光下基本不能觀察到綠色熒光物質(zhì),而8 μm厚的冰凍切片也僅能觀察到微弱的蘋果綠色熒光物質(zhì)。當(dāng)染色時(shí)間為5 min、10 min、15 min和20 min時(shí),8 μm厚的冰凍切片在光鏡下觀察到明顯的磚紅色物質(zhì),較6 μm冰凍切片更為顯著。而當(dāng)染色時(shí)間為10 min時(shí),6 μm冰凍切片在偏振光下仍難以觀察到蘋果綠色熒光物質(zhì)。當(dāng)染色時(shí)間為15 min時(shí),8 μm厚的冰凍切片在光鏡下觀察到較明顯的磚紅色物質(zhì),而在此條件下,偏振光下能觀察到的蘋果綠色熒光最為顯著。見圖2。

2.38 μm切片在不同剛果紅染色時(shí)間條件下熒光顯微鏡觀察結(jié)果 當(dāng)染色時(shí)間為5 min、10 min、15 min、20 min時(shí),熒光顯微鏡下均能觀察到明顯的橙紅色熒光,其中以染色時(shí)間為15 min時(shí)熒光亮度最強(qiáng)。石蠟切片在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光,亮度弱。見圖3。

?～?為8 μm冰凍切片觀察所見:染色時(shí)間為5 min(?)、10 min(?)、15 min(?)、20 min(?)時(shí),熒光顯微鏡下觀察到橙紅色熒光,亮度強(qiáng)(剛果紅染色,×200)。??為石蠟切片觀察所見:染色時(shí)間為10 min,石蠟切片在熒光顯微鏡下呈紅色熒光,亮度弱[剛果紅染色,×100(?),×200(?)]

3 討論

3.1剛果紅染色于1922年由Bennhold發(fā)明[13],可用于活體內(nèi)淀粉樣物質(zhì)的鑒定并應(yīng)用到組織切片中,后經(jīng)Highman、Freudenthal等學(xué)者進(jìn)行改良。目前,本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的Highman剛果紅法,其染色液主要由剛果紅染色液和蘇木素染色液組成,染色操作簡(jiǎn)單易行,染色液性能穩(wěn)定,染色效果良好,較其他剛果紅染色方法有明顯優(yōu)勢(shì)。

3.2常規(guī)石蠟切片是制片技術(shù)中較為常用的方法,但操作步驟繁瑣,所需時(shí)間較長(zhǎng),從取材凝固到制成標(biāo)本需要消耗數(shù)日時(shí)間,而冰凍切片僅需耗時(shí)約7 h即可完成[13]。本研究應(yīng)用丙酮固定15 min,可在1 h內(nèi)得到剛果紅染色及常規(guī)的HE染色結(jié)果。另外,本研究通過(guò)對(duì)神經(jīng)石蠟切片和冰凍切片的剛果紅染色在普通光、偏振光及熒光下的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),冰凍切片染色結(jié)果對(duì)比度更高,更容易辨認(rèn),且熒光下染色物質(zhì)亮度更強(qiáng),有利于觀察者對(duì)剛果紅染色結(jié)果進(jìn)行判定。因此,冰凍切片不但節(jié)省了從送檢到診斷的時(shí)間,而且還提高了剛果紅染色陽(yáng)性判定的靈敏度,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床診斷大有裨益。

3.3有研究證實(shí),切片厚度對(duì)淀粉樣蛋白的剛果紅染色結(jié)果有影響,隨著切片厚度變薄,染色強(qiáng)度變?nèi)?當(dāng)薄切片≤3 μm時(shí)容易出現(xiàn)假陰性[17]。本次研究中為了防止冰凍切片制備時(shí)出現(xiàn)卷片、碎片等現(xiàn)象,選用6 μm(冰凍切片免疫組化染色常用切片厚度)及8 μm(冰凍切片組織化學(xué)染色常用切片厚度)作為染色切片厚度,觀察在這兩個(gè)厚度條件下剛果紅染色時(shí)間對(duì)染色結(jié)果的影響。另外,由于神經(jīng)組織較小,容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。經(jīng)筆者前期反復(fù)試驗(yàn),可用丙酮固定15 min替代4%甲醛、無(wú)水乙醇、Bouin液固定[18]。染色過(guò)程中復(fù)染細(xì)胞核的步驟為了避免過(guò)長(zhǎng)時(shí)間沖水引起脫片,可選擇蘇木素復(fù)染1 min,相應(yīng)的沖洗時(shí)間可由10 min縮短到5 min。

3.4淀粉樣纖維能被剛果紅染料染色,且該物質(zhì)在偏振光下能呈現(xiàn)出特征性的蘋果綠雙折光,這是含有β-褶片結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的特異表現(xiàn),是診斷淀粉樣變性病的重要依據(jù)[1,19]。在本研究中,切片厚度相同時(shí),剛果紅染色著色強(qiáng)弱隨著染色時(shí)間增加而增強(qiáng);染色時(shí)間相同時(shí),染色顏色隨著切片厚度增加而增強(qiáng)。同樣的厚度下,染色20 min的特異性物質(zhì)沉積磚紅色過(guò)深,接近于紫紅色,在偏振光及熒光下并沒有呈現(xiàn)出更好的染色效果;在染色15 min時(shí),6 μm及8 μm切片染色在普通光、偏振光、熒光下的效果均較好。

3.5在本研究中,當(dāng)染色時(shí)間為5 min時(shí),6 μm切片剛果紅染色所見磚紅色十分微弱,偏振光下基本觀察不到蘋果綠色物質(zhì),說(shuō)明切片厚度不足時(shí)偏振光觀察效果不佳[20]。而8 μm切片在染色5 min時(shí)能觀察到蘋果綠雙折光,說(shuō)明8 μm是較理想的切片厚度。當(dāng)染色20 min時(shí),8 μm切片磚紅色過(guò)深,且在偏振光下也沒有觀察到更顯著的蘋果綠雙折光。兩種厚度切片在染色15 min時(shí)均可觀察到較強(qiáng)的蘋果綠雙折光,這可能與淀粉樣物質(zhì)在組織中的含量或是剛果紅染料與淀粉樣纖維的結(jié)合原理有關(guān)。

3.6在熒光顯微鏡下觀察剛果紅染色能顯著提高診斷的靈敏度[1,20-22]。本研究中,8 μm厚度切片在染色5 min、10 min、15 min、20 min時(shí)均能觀察到十分明亮的紅色熒光,且在染色時(shí)間為15 min時(shí)所見熒光最為顯著,呈橙紅色熒光,顯著提高了陽(yáng)性染色的辨別力與診斷靈敏度。同時(shí),本研究發(fā)現(xiàn)冰凍切片較石蠟切片在熒光下顯色效果更優(yōu)。

綜上所述,8 μm冰凍切片剛果紅染色在A液中染色15 min時(shí)效果最好,光鏡下呈鮮艷磚紅色,偏振光下蘋果綠也較明顯,熒光顯微鏡下橙紅色熒光也最強(qiáng)。該方法不但簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程,縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間,還提高了染色靈敏度,有助于淀粉樣周圍神經(jīng)病的診斷。