黎秋紅，唐潔蘭

（廣西蒼梧縣國(guó)有天洪嶺林場(chǎng)，廣西 蒼梧 543100）

木材藍(lán)變又稱青變，藍(lán)變是松木在開發(fā)利用過程中常見的問題，藍(lán)變最初發(fā)生在鋸材的表面和原木的端面，滲透到木材內(nèi)部導(dǎo)致木材易腐朽，嚴(yán)重影響木材外觀，大大降低使用價(jià)值[1-3]。球殼孢科的可可球二孢（Lasiodiplodia theobromae）是引起木材藍(lán)變的主要病原菌[4]。它廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶。其寄主植物已知約500 種，廣西松木的藍(lán)變主要由可可球二孢引起，被藍(lán)變菌污染的木材變?yōu)榛宜{(lán)色或灰黑色，菌絲通過木射線進(jìn)入木材內(nèi)部組織的樹脂道和木射線內(nèi)，并可穿過紋孔蔓延擴(kuò)散，原木砍伐后陸地存放1 個(gè)月，兩端頭藍(lán)變深度可達(dá)30 cm[5-6]。目前防治木材藍(lán)變的技術(shù)主要依賴于五氯酚鈉和鉻砷酸銅等化學(xué)藥劑的處理[7]。但對(duì)哺乳動(dòng)物毒性大并含有微量劇毒物質(zhì)二惡英，因此日本和歐洲許多國(guó)家已經(jīng)完全禁止使用五氯酚同系物及其鈉鹽[8-9]。隨著科技的進(jìn)步，一些生物防治方法也逐漸得到應(yīng)用，例如通過微生物間的競(jìng)爭(zhēng)、抗生和利用關(guān)系，對(duì)木制品進(jìn)行長(zhǎng)期保護(hù)時(shí)，有益菌發(fā)揮“積極”競(jìng)爭(zhēng)能力，抑制有害真菌、細(xì)菌、放線菌等微生物生長(zhǎng)，去除藍(lán)變菌[10-12]。但上述生物殺菌劑的共同缺點(diǎn)是原料來源少、提取成本高、得率低。因此開發(fā)高得率、成本低、原料易得且廣泛的植物源防藍(lán)變藥劑成為當(dāng)務(wù)之急。該試驗(yàn)采用18 種植物的粗提物對(duì)可可球二孢的離體進(jìn)行活性研究，以期找到具有較高抑制活性的植物，為開發(fā)新型無污染抗松木藍(lán)變天然植物源殺菌劑提供基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 研究方法

1.1 試驗(yàn)地概況

植物樣品采集地廣西梧州（110°18′～111°40′ E，22°37′～24°18′ N），屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，處于海洋性氣候與大陸性氣候的過渡地域。夏半年盛行暖濕的海洋氣團(tuán)，冬季盛行干冷的大陸氣團(tuán)。地處低緯度地帶，太陽(yáng)輻射強(qiáng)，夏長(zhǎng)冬短，無霜期長(zhǎng)，年均331 d。年均氣溫21.2℃，1 月氣溫最低，平均氣溫為7.3℃，7 月最高平均氣溫34.4℃，年均降雨量1 506.9 mm?！?℃總積溫為7 738℃，≥10℃的活動(dòng)積溫為6 925.3℃，年平均相對(duì)濕度79%，春夏潮濕、秋冬干燥。年平均日照時(shí)數(shù)1 725.4 h。土壤為砂頁(yè)巖赤紅壤，土壤平均厚度80 cm 以上。林下灌木常見植物主要有桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）、野牡丹（Melastoma candidum）、漸尖毛蕨（Cyclosorus acuminata）等。

1.2 試驗(yàn)材料及方法

在選取分布廣泛、常見且具有一定抑菌表現(xiàn)的植物18種，分別是：黃荊（Vitex negundo）、柚子（Citrus grandis）、黃花夾竹桃（Thevetia peruviana）、紅花夾竹桃（Nerium indicum）、馬尾松（Pinus massoniana）、苦丁茶（Ilex kudingcha）、開口箭（Tupistra chinensis）、苦麻（Sonchus brachyotus）、排風(fēng)藤（Solanum lyratum）、飛龍掌血（Toddalia asiatica）、羊耳菊（Inula cappa）、排錢草（Phyllodium pulchellum）、湖北海棠（Malus hupehensis）、枇杷（Eribotrya japonica）、下田菊（Adenostemma lavenia）、陰香（Cinnamomum burmannii）、苦楝（Melia azedarach）、桑黃（Phellinus igniarius）。采集植物的枝葉果皮、莖塊等材料用于進(jìn)一步抽提試驗(yàn)。

1.2.1 植物提取與培養(yǎng)基制作。將采集的植物材料晾干置于烘箱，在80℃下連續(xù)烘干48 h。取出粉碎，取50 g 加入500 mL 的三角瓶中，加入400 mL 無水酒精，在65℃的水浴鍋中連續(xù)蒸餾提取12 h，過濾回收殘?jiān)?，再次倒?00 mL 酒精提取12 h 后將濾液匯集。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將濾液濃縮得到初提液，在60℃烘箱中烘干得到初提物浸膏，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)基的制作參照防霉劑國(guó)標(biāo)法進(jìn)行[13]。

1.2.2 菌種來源與培養(yǎng)?？煽汕蚨呔N由廣西大學(xué)林學(xué)院提供。在藍(lán)變的馬尾松原木上采集菌落，在馬鈴薯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖。通過DNA 測(cè)序篩選出可可球二孢霉菌并將菌種進(jìn)行活化，保存于4℃冰箱中。

1.2.3 接菌與培養(yǎng)。稱量一定量的提取物浸膏，溶于酒精后與已滅菌的培養(yǎng)基混合，制成相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基，冷卻12 h 之后接菌。接菌時(shí)，在菌種培養(yǎng)皿上用直徑0.5 cm 的打孔器取菌落邊緣的霉菌，接至含藥培養(yǎng)皿的中心部分。已接菌的培養(yǎng)皿倒置后裝袋，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 粗篩選。參照生長(zhǎng)速率法[14]，量取0.5 g 植物材料浸膏，溶于1 mL 的酒精中，制成0.5 g/mL 的藥液。用移液槍吸取0.2 mL 到裝有9.8 mL 已融化PDA 培養(yǎng)基（溫度約60℃）的三角瓶中，再倒入培養(yǎng)皿中制成濃度為1 g/L 的培養(yǎng)基平板，平板凝固冷卻后用打孔器接進(jìn)大小、生長(zhǎng)一致的病原真菌菌餅（直徑為0.5 cm），每個(gè)培養(yǎng)皿接1 個(gè)菌餅，生長(zhǎng)有菌落的一面朝下，每處理3 次重復(fù)，每次試驗(yàn)設(shè)置相同濃度的空白對(duì)照，以1 g/L 濃度的五氯酚鈉作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

因植物提取物的作用與真菌菌落直徑大小呈相關(guān)性，因此學(xué)者們統(tǒng)計(jì)植物提取物的抑菌效果，多以菌落直徑大小來對(duì)應(yīng)比較的標(biāo)準(zhǔn)，以研究植物提取物對(duì)木材藍(lán)變菌的抑制效果[13，15-17]。

接種好的培養(yǎng)皿倒置裝袋，放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)48 h 后取出，用十字交叉法測(cè)菌落的直徑，抑制率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

入選植物提取物的材料以病原真菌菌餅直徑的5～20倍為有效抑菌統(tǒng)計(jì)個(gè)數(shù)，對(duì)每種植物提取物材料取相同的質(zhì)量進(jìn)行抑菌篩選試驗(yàn)。從表1 可知，18 種植物入選的份數(shù)不同，其中開口箭、羊耳菊、湖北海棠（銀皮苷）3 種的份數(shù)最少，只有4 份，陰香入選的份數(shù)最多，有7 份材料。另外，從入選材料菌落直徑與抑菌率關(guān)系看，兩者在數(shù)值上未表現(xiàn)出正比關(guān)系。18 種植物選取的材料平均直徑也存在差別，變幅在3.74～8.50 cm 之間，粗篩選的材料平均直徑為4.82 cm，入選植物材料的平均直徑分為3 組，低于4 cm的是馬尾松和黃荊，平均直徑在4.00～6.00 cm 之間的共有16 份材料，而高于8.00 cm 直徑的僅有湖北海棠（總黃酮）。

由試驗(yàn)結(jié)果可知（表1），不同的植物提取物對(duì)可可球二孢具有不同的抑制性。在1 g/L 濃度下，飛龍掌血對(duì)可可球二孢的抑菌率達(dá)到了最高的31.11%，抑制率達(dá)到20%以上的植物有馬尾松、陰香、湖北海棠（銀皮苷）、羊耳菊、黃荊。其中比較引人注目的是馬尾松針的粗提物，松木常常容易發(fā)生藍(lán)變，但是其松針卻表現(xiàn)出了一定的抑制活性，在1 g/L 的濃度下抑制率達(dá)到了27.64%。另外湖北海棠（總黃酮）、排風(fēng)藤、苦楝的粗提物發(fā)生異常，不僅沒有抑制率，反而促進(jìn)可可球二孢的生長(zhǎng)，特別是湖北海棠（總黃酮），其抑制率達(dá)到了-52.38%，對(duì)可可球二孢的生長(zhǎng)具有較大的促進(jìn)作用。除了上述的植物種類之外，其他植物對(duì)可可球二孢具有一定的抑制效果，但是相對(duì)不明顯，只維持在20%以下，因而在下一步進(jìn)行梯度試驗(yàn)時(shí)將不采用這些植物。

用于陽(yáng)性對(duì)照的五氯酚鈉表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制效果，達(dá)到了100%，說明在相同條件下較純的化學(xué)藥劑由于組分單一，抑制成分的含量較大，因而其抑制率相對(duì)明顯；而粗提物由于組分混雜，具有抑制性的成分不明晰且含量較少，因此只有在較大的濃度下才能達(dá)到理想的抑制效果。

3 結(jié)論與討論

對(duì)18 種植物19 類粗提物進(jìn)行了對(duì)可可球二孢的抑菌性試驗(yàn)，從中選出抑制性強(qiáng)且資源豐富的植物作為防治松木藍(lán)變的植物源殺菌劑的原料。18 種入選材料的平均菌落直徑為4.82 cm，變幅為3.74～8.50 cm，存在顯著差別。18 種植物提取物的抑菌率存在顯著差別，平均抑菌率為11.64%，有15 種植物提取物的抑菌率為正值，有3 種植物提取物抑菌率為負(fù)值，分別是苦楝、排風(fēng)藤（石油醚部分）、湖北海棠（總黃酮），其中湖北海棠（總黃酮）的抑菌率最差，負(fù)值高達(dá)52.38%。有6 種植物提取物的抑菌率高于20%，分別是飛龍掌血、馬尾松、陰香、湖北海棠（銀皮苷）、羊耳菊、黃荊。其中飛龍掌血的抑菌率最高，達(dá)到31.11%。我國(guó)植物資源豐富，對(duì)植物的藥用也有悠久的歷史，植物源抑菌劑具有廣闊的發(fā)展前景。近年來國(guó)內(nèi)對(duì)植物源抑菌劑的研究有了長(zhǎng)足的發(fā)展[19]。植物源抑菌劑有污染少，對(duì)環(huán)境友好的特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用空間。經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，陰香、馬尾松、飛龍掌血、羊耳菊、湖北海棠和黃荊對(duì)引起藍(lán)變的主要菌種可可球二孢有較好的抑制性，再加上它們本身具有的優(yōu)勢(shì)，可以作為新的藥物代替部分化學(xué)藥劑或者與化學(xué)藥劑混合使用，為防治木材藍(lán)變提供新的途徑，這幾種植物在抑制木材藍(lán)變方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)和開發(fā)空間。