謝一瀲 鄔怡怡 吳洲笑

肝臟在受到藥物、缺血、外源性毒物等因素所致的損害時，會出現(xiàn)急性肝損傷，嚴(yán)重時可致急性肝衰竭并危及生命[1]。姜黃素是從姜黃的根莖中提取的一種酚類化合物，對于藥物或有毒物質(zhì)所致肝損傷及其他類型的肝病均有不同程度的預(yù)防或治療作用[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可改善脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）/D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）所致的急性肝損傷，而自噬在其中可發(fā)揮保護作用[3]。線粒體自噬作為一種重要的選擇性自噬，是否參與其中，以及如何發(fā)揮保護作用，還需進(jìn)一步研究。核酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域（nucleotide binding oligomerization domain，NOD）樣受體家族3（NOD-like receptors，NLRP3）炎癥小體是一種細(xì)胞內(nèi)多蛋白復(fù)合體，參與了各種肝臟疾病的炎癥和免疫反應(yīng)。多項研究顯示，NLRP3 炎癥小體在LPS/D-GalN 導(dǎo)致的肝損傷中有重要作用，抑制NLRP3 通路減少炎癥因子的釋放，可達(dá)到改善肝損傷的目的[4-6]。有研究認(rèn)為，線粒體自噬能抑制NLRP3 炎癥小體，從而治療炎癥性疾病[7-9]。在LPS/D-GaIN 誘導(dǎo)的急性肝損傷動物模型中，姜黃素可能通過線粒體自噬-NLRP3 炎癥小體通路起保護作用，但相關(guān)報道鮮見。基于此，本研究擬探討姜黃素在急性肝損傷中的作用，分析其作用機制，以期為其用于急性肝損傷的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 30 只雄性SPF 級SD 大鼠，180～220 g，購自上海斯萊克有限公司，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)環(huán)境：20～25 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2 主要試劑 姜黃素（批號：shbn9867）購自美國Sigma 公司，用0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成24 g/L 藥液，備用；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）（批號：0000136326）購自美國Sigma 公司，用二甲基亞砜配制成5 mmol/L，備用；LPS（批號：0000129517）、D-GalN（批號：slcf9830）和ATP 檢測試劑盒（批號：MAK190）均購自美國Sigma 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：092822221202）、β-肌動蛋白（β-actin）（批號：AF0006）和JC-1 檢測試劑盒（批號：C2006）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG 抗體（批號：GAR0072）和紅細(xì)胞裂解液（批號：MR0504-500）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司,山羊抗小鼠IgG 抗體（批號：GAM007）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；大鼠IL-1β ELISA 檢測試劑盒（批號：mL003057）購自酶聯(lián)生物科技有限公司?？贵wNLRP3（批號：ab263899）、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）（批號：ab286125）、IL-1β（批號：ab283818）和PTEN 誘導(dǎo)假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）（批號：ab186303）購自美國Abcam 公司；Parkin（批號：4211T）購自美國CST 公司。

1.3 動物分組及建模 30 只大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、肝損傷組、姜黃素組、3MA 組和姜黃素+3MA 組，每組6 只。除對照組外，其余4 組將LPS 和DGalN 按照10 μg/kg 和800 mg/kg 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)用800 μL的無菌0.9%氯化鈉注射液溶解后，一次性腹腔注射，建立急性肝損傷模型。預(yù)實驗觀察到肝臟組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，中央靜脈及肝竇擴增，可見點灶性壞死和嚴(yán)重充血，并伴隨炎癥細(xì)胞侵潤，提示造模成功。對照組腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉注射液。造模前5天，姜黃素組和姜黃素+3MA 組大鼠按5.00 mL/kg 劑量灌飼姜黃素藥液，對照組、肝損傷組和3MA 組按5.00 mL/kg劑量灌飼CMC-Na溶液，1次/d[3]。造模前2 h，3MA 組和姜黃素+3MA 組大鼠腹腔注射3.35 mL/kg 的3MA 藥液[3]，其余各組腹腔注射3.35 mL/kg 的二甲基亞砜。造模后12 h，頸椎脫臼法處死大鼠并收取血液和肝臟組織。血液經(jīng)室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心20 min，收集上層淡黃色血清，存放于-20 ℃冰箱。新鮮肝臟組織部分浸泡于4%甲醛中固定，部分經(jīng)液氮瞬時冷凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，剩余組織按要求保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 各組大鼠肝組織病理檢查 采用HE 染色。肝臟組織經(jīng)甲醛固定3～5 d，修塊、脫水、透明、浸蠟、包埋后進(jìn)行切片，染色后顯微鏡下觀察。

1.4.2 各組大鼠肝組織細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測 采用JC-1 流式檢測。新鮮肝臟組織經(jīng)預(yù)冷的PBS 漂洗2 遍，浸泡于預(yù)冷的1640 培養(yǎng)基中。取出組織剪碎研磨，收集懸液后PBS 漂洗2 遍，加入復(fù)合酶消化液，1 000 r/min 離心5 min，收集沉淀，紅細(xì)胞裂解液裂解后1 000 r/min 離心5 min ，離心2 次棄去上清液，用1 mL 的1640 培養(yǎng)基重懸。PBS 洗滌細(xì)胞，1 000 r/min 4 ℃離心5 min，加入1 mL 的JC-1 染色工作液，充分混勻后，放入37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。4 ℃下1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用預(yù)冷的JC-1 染色緩沖液離心洗滌2 次，再重懸于1 mL 的染色緩沖液中，最后流式上機檢測各組細(xì)胞樣本中發(fā)生去極化的細(xì)胞數(shù)，并計算細(xì)胞比例。其中綠色熒光為去極化細(xì)胞，去極化細(xì)胞比例越高，提示細(xì)胞受損嚴(yán)重，線粒體膜電位下降越嚴(yán)重。

1.4.3 各組大鼠肝組織細(xì)胞ATP 水平檢測使用ATP 檢測試劑盒。準(zhǔn)確稱取0.5 g 組織樣本，勻漿裂解完全后于8 000 r/min 離心5 min，取上清液過濾蛋白后稀釋。分別加0、2、4、6、8、10 μL 10 mmol/ L 標(biāo)準(zhǔn)品到96 孔板內(nèi)，加ATP Assay Buffer 補充至50 μL，另加入50 μL 樣本；混合混勻后覆膜，室溫避光孵育0.5 h；測量各孔570 nm 波長下的吸光度值。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本ATP 水平。

1.4.4 各組大鼠肝組織線粒體自噬的檢測 使用透射電鏡觀察。新鮮肝臟組織塊放入2.5%戊二醛磷酸緩沖液中固定過夜，取出沖洗、固定、染色、脫水、滲透和包埋，置于烘箱內(nèi)聚合，之后修塊并制作超薄切片，染色后置于TECNAI 10 透射電鏡下觀察線粒體形態(tài)和自噬小體。

1.4.5 各組大鼠肝組織IL-1β 陽性率檢測 采用免疫組化染色。取新鮮肝臟組織固定、修塊、脫水、透明、浸蠟、包埋及切片，使用二甲苯脫蠟，乙醇復(fù)水，用3%的雙氧水在37 ℃孵化10 min，PBS 沖洗后進(jìn)行抗原修復(fù)，加入一抗后在4 ℃冰箱中孵育過夜，取出后室溫下靜置30 min，PBS 洗滌3 次，5 min/次；滴加二抗，在37 ℃下孵育40 min，再用PBS 沖洗3 次，5 min/次；用二氨基聯(lián)苯胺法染色，然后再用蘇木素復(fù)染，等待其干燥后封片，顯微鏡下觀察肝臟組織IL-1β 陽性率，切片褐色或黃褐色表示為陽性。用Image-Pro Plus 測量免疫組化陽性表達(dá)的吸光度值。

1.4.6 各組大鼠血清IL-1β 水平檢測 采用ELISA法。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50 μL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。樣本孔中加50 μL 待測樣本，空白孔加50 μL 樣本稀釋液。各孔分別加入100 μL 辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫溫育60 min。棄去液體，控干后洗滌液清洗5 次。各孔加入底物A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液。測量各孔450 nm波長處吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖計算IL-1β 水平。

1.4.7 各組大鼠肝臟組織線粒體自噬相關(guān)蛋白和炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot 法。取0.1 mg 肝臟組織加入裂解液，充分勻漿后離心，留存上清液。加入BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測樣本中的蛋白濃度，然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，再轉(zhuǎn)膜并封閉。取出聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，加入TBST 緩沖液，搖床上緩慢洗滌5 min。將PVDF 膜移入含有線粒體自噬相關(guān)蛋白（Parkin、PINK1）和炎癥相關(guān)蛋白（NLRP3、Caspase-1和IL-1β）一抗的孵育盒中，4 ℃孵育過夜。洗膜后將PVDF 膜轉(zhuǎn)移到含二抗的抗體孵育盒中，室溫下?lián)u床孵育2 h，并再次洗膜。最后將PVDF 膜放于保鮮膜之上，加入底物，并移入凝膠成像分析儀中曝光顯影。以βactin為內(nèi)參，計算各蛋白灰度值，即蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法；方差不齊時用Tamhane 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5 組大鼠肝組織病理學(xué)變化 對照組未見明顯的肝細(xì)胞病變。肝損傷組可見大量肝細(xì)胞腫脹，肝小葉結(jié)構(gòu)排列紊亂，中央靜脈及肝竇擴張，嚴(yán)重充血，并且可見點狀壞死，較多炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞核深染固縮、碎裂及溶解。與肝損傷組相比，姜黃素組的肝細(xì)胞腫脹及點狀壞死則顯著減少，炎癥細(xì)胞浸潤相對較輕。而3MA 組及姜黃素+3MA 組的肝組織病理與肝損傷組相比無明顯變化，見圖1（插頁）。

圖1 5 組大鼠肝組織的病理變化

2.2 5 組大鼠肝細(xì)胞MMP 變化和線粒體ATP 水平的比較 和對照組相比，肝損傷組去極化細(xì)胞比例顯著上升，提示MMP 下降；且線粒體ATP 水平顯著下降（P＜0.01），即線粒體受損嚴(yán)重。和肝損傷組相比，姜黃素組去極化細(xì)胞比例顯著下降（P＜0.01），提示MMP 升高；且ATP 水平顯著升高（P＜0.01），即線粒體ATP 合成能力改善。和姜黃素組相比，3MA 組和姜黃素+3MA組去極化細(xì)胞比例均顯著上升（均P＜0.05），線粒體合成ATP能力均顯著下降（均P＜0.01）。見圖2。

圖2 5 組大鼠肝組織線粒體ATP 水平和線粒體膜電位比較（A：線粒體細(xì)胞膜電位的流式細(xì)胞圖；B：去極化細(xì)胞比例；C：細(xì)胞ATP 水平）

2.3 5 組大鼠肝臟組織細(xì)胞線粒體自噬情況比較透射電鏡結(jié)果顯示，肝損傷組中，線粒體明顯腫脹，內(nèi)部嵴破壞或消失，并可見自噬體形成。姜黃素組中，線粒體損傷較輕，線粒體碎片減少，自噬體的數(shù)量增加，并可見自噬體包裹線粒體碎片。3MA 組和姜黃素+3MA 組線粒體結(jié)構(gòu)明顯受損，自噬體數(shù)量減少。見圖3。

圖3 透射電鏡下各組大鼠肝組織的線粒體及自噬體形態(tài)

2.4 5 組大鼠肝組織IL-1β 陽性率和表達(dá)的比較 免疫組化染色結(jié)果顯示，和對照組相比，肝損傷組陽性細(xì)胞數(shù)及相應(yīng)吸光值顯著上升（P＜0.01），提示肝組織IL-1β 陽性率升高；和肝損傷組相比，姜黃素組陽性細(xì)胞數(shù)及相應(yīng)吸光度值顯著減少（P＜0.01），提示肝組織IL-1β 陽性率降低；和姜黃素組相比，3MA 組和姜黃素+3MA 組陽性細(xì)胞數(shù)及相應(yīng)吸光度值均顯著上升（P＜0.01）。ELISA 結(jié)果顯示，與對照組相比，肝損傷組血清IL-1β 水平顯著升高，與肝損傷組相比，姜黃素組血清IL-1β 水平顯著下降，與姜黃素組相比，3MA 組和姜黃素+3MA 組血清IL-1β 水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。見圖4。

圖4 5 組大鼠IL-1β 表達(dá)比較（A：肝組織免疫組化染色結(jié)果；B：平均吸光度值；C：血清IL-1β 水平）

2.5 5 組大鼠肝組織線粒體自噬相關(guān)蛋白和炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 與對照組相比，肝損傷組的Parkin、PINK1、NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 的蛋白灰度值均顯著上調(diào)（均P＜0.01）；與肝損傷組相比，姜黃素組Parkin 和PINK1 蛋白灰度值顯著上調(diào)（均P＜0.05），NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白灰度值均顯著下降（均P＜0.01）；與姜黃素組相比，3MA 組和姜黃素+3MA 組Parkin、PINK1 蛋白灰度值均顯著下降（均P＜0.01），NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白灰度值均上升（均P＜0.05）。見圖5。

圖5 5 組大鼠肝組織Caspase-1、IL-1β、NLRP3、Parkin 和PINK1 的蛋白灰度值比較（A：蛋白電泳圖；B：蛋白灰度值）

3 討論

姜黃素是一種藥理作用廣泛的天然化合物，在近年來受到國內(nèi)外眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以顯著改善LPS/D-GaIN 所致的肝臟病理組織學(xué)損傷，姜黃素治療后，受損的肝臟組織細(xì)胞的MMP 可顯著升高，線粒體ATP 的合成能力也得到改善，提示姜黃素的肝臟保護作用與其保障線粒體功能相關(guān)。然而，在給予自噬抑制劑3MA 后，MMP 和ATP水平均顯著下降，提示姜黃素對線粒體功能的保護作用可能與線粒體自噬相關(guān)。

線粒體自噬是自噬的一種特異性的選擇形式，可以選擇性地清除細(xì)胞中受損的線粒體，從而維持線粒體功能的完整[10-11]。線粒體自噬通路中一個重要的調(diào)節(jié)途徑是PINK1-Parkin 通路，當(dāng)線粒體發(fā)生去極化損傷時，PINK1 會聚集在線粒體外膜并快速激活Parkin，并將其募集至線粒體外膜，促進(jìn)線粒體膜蛋白泛素化，從而啟動線粒體自噬[12-13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對線粒體自噬有著重要調(diào)節(jié)作用。Wang 等[14]發(fā)現(xiàn)姜黃素能通過上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRTl）抑制NLRP3 炎癥反應(yīng)，從而減輕急性肺損傷。Rainey 等[15]發(fā)現(xiàn)，姜黃素能促進(jìn)線粒體的生物合成，并誘導(dǎo)線粒體自噬。Cao 等[16]研究認(rèn)為，姜黃素可通過PINK1-Parkin 通路調(diào)控線粒體自噬，從而改善H2O2誘導(dǎo)的腸上皮氧化應(yīng)激損傷，而敲除Parkin 基因則可消除姜黃素的保護作用。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以改善腦缺血再灌注損傷，其機制是姜黃素增加了線粒體膜電位和ATP 水平，從而保護線粒體功能并增強線粒體自噬。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LPS/D-GalN 引起大鼠肝組織損傷時，線粒體ATP 水平和MMP 下降，電鏡下觀察到線粒體損傷嚴(yán)重，自噬體數(shù)量增多，Western blot 結(jié)果顯示線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1 和Parkin 的表達(dá)上調(diào)，提示LPS/D-GalN 致肝損傷可激活線粒體自噬，以進(jìn)行自我保護；姜黃素干預(yù)后，大鼠肝組織損傷減輕，線粒體ATP 水平和MMP 上升，電鏡下觀察到線粒體碎片被自噬體包繞，線粒體損傷減輕，PINK1 和Parkin 的蛋白表達(dá)顯著增強；然而，當(dāng)加入自噬抑制劑3MA 后，姜黃素的這種保護作用被逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為PINK1 和Parkin 的蛋白表達(dá)顯著減少。這些結(jié)果表明，線粒體自噬可能在姜黃素緩解LPS/D-GalN 誘導(dǎo)的急性肝損傷中發(fā)揮了保護作用。

LPS/D-GalN 損傷肝臟時會產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），而ROS 是激活NLRP3 炎癥小體的重要誘因[18-19]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體在急性肝損傷中發(fā)揮重要作用[20-22]。在受到病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）刺激后，NLRP3 炎癥小體可活化Caspase-1 分子，繼而活化促炎因子IL-1β，進(jìn)一步激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，分泌多種促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡[23-24]。ROS 產(chǎn)生的主要場所是線粒體，線粒體自噬作為一種重要的選擇性自噬，可選擇性清除受損的線粒體，與炎癥反應(yīng)和炎癥小體關(guān)系最為密切[7，13，25]。Yu 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可能通過促進(jìn)肝細(xì)胞中的線粒體自噬，抑制NLRP3 炎癥小體的活化，從而減緩非酒精性脂肪性肝炎的進(jìn)展。Shan等[27]認(rèn)為，在對乙酰氨基酚導(dǎo)致的急性肝損傷的小鼠模型中，增強線粒體自噬可以抑制NLRP3 炎癥小體的激活，從而減輕肝臟炎性反應(yīng)，改善肝損傷。以上研究中表明，線粒體自噬-NLRP3 炎癥小體通路在肝損傷中的作用重大。本研究經(jīng)免疫組化和ELISA 檢測均發(fā)現(xiàn)，相比肝損傷組，姜黃素組IL-1β 表達(dá)水平顯著下降，Western blot 顯示炎癥相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β 的表達(dá)明顯下降，提示姜黃素可以抑制NLRP3 炎性小體的活化，減少Caspase-1 和IL-1β 生成，從而減輕炎癥反應(yīng)。但加入3MA 后線粒體自噬蛋白減少，而炎癥相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 的表達(dá)均顯著增強，血清及肝臟組織中IL-1β 含量明顯升高，從而驗證了線粒體自噬對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。

綜上所述，姜黃素對LPS/D-GalN 誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護作用可能與激活線粒體自噬抑制NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)，但尚需進(jìn)一步深入研究。