常冠坤 王繼豐 于爽 郝婧瑋

文章編號(hào)：1003?6180（2023） 03?0041?07

摘? 要：探討威靈仙-白花蛇舌草藥對(duì)治療癌癥的作用機(jī)制.從HERB與Swiss ADME兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出威靈仙-白花蛇舌草藥對(duì)中活性成分、作用靶點(diǎn)、癌癥疾病靶點(diǎn)、活性成分與疾病的共同靶點(diǎn)，篩選出重要的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)，將活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證.關(guān)鍵靶點(diǎn)為ESR1，重要活性成分為槲皮素、阿魏酸和恩貝林，這三種藥物的活性成分均與疾病靶點(diǎn)蛋白有著較好的結(jié)合性.威靈仙-白花蛇舌草藥對(duì)可能對(duì)治療癌癥疾病起著重要作用.

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；威靈仙；藥對(duì)；癌癥；分子對(duì)接

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Mechanism of Couplet Medicines of Clematis chinensis Osbeck

and Hedyotis diffusa Treatment for Cancer

CHANG Guankun1，WANG Jifeng2，YU Shuang1，HAO Jingwei1*

（1.College of life science and technology，Mudanjiang Normal College，Mudanjiang，Heilongjiang 157011，China；2.Institute of? Nature Resources And Ecology.Has，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin，

Heilongjiang 150040，China）

Abstract：Exploring the Mechanism of couplet medicines of Clematis chinensis Osbeck and Hedyotis diffusa Treatment for Cancer.The HERB and Swiss ADME databases were used to screen active ingredients， target proteins， and common targets of Clematis chinensis Osbeck and Hedyotis diffusa for cancer treatment， and important active ingredients and key targets were identified and verified through molecular docking.The key target is ESR1， and the important active ingredients are Quercetin， Ferulic acid， and Embelin.All three active ingredients have good binding properties with the disease target protein.Couplet medicines of Clematis chinensis Osbeck and Hedyotis diffusa may play an important role in the treatment of cancer.

Key words：network pharmacology；Clematis chinensis Osbeck；Hedyotis diffusa;couplet medicines；cancer；molecular docking

癌癥是由于生物體某個(gè)基因發(fā)生突變導(dǎo)致的[1-2]，中草藥如威靈仙（Clematis chinensis Osbeck），常與其他中藥配伍治療疾??；白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）是南方較為常見的中草藥，有著消炎、解毒、抗癌腫等多種藥理作用，具有較好的使用價(jià)值.[1-4]本文以威靈仙-白花蛇舌草為藥對(duì)，采用活性成分篩選法[5]，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，探討威靈仙-白花蛇舌草藥對(duì)的抗癌機(jī)制.

1 材料與方法

威靈仙-白花蛇舌草對(duì)活性成分的收集和篩選 在數(shù)據(jù)庫(kù)本草組鑒（http：//drug.ac.cn/，HERB）中分別搜索威靈仙、白花蛇舌草的成分，選擇OB score ≥ 30為篩選條件，分選出主要成分.在 Swiss ADME（http：//www.swissadme.ch/）中，以藥代動(dòng)力學(xué)里的胃腸道吸收（GI absorption）為“High”的結(jié)果，及類藥性（Druglikeness）五個(gè)預(yù)測(cè)（Lipinski，Ghose，Veber，Egan，Muegge）的結(jié)果中有2個(gè)及以上是“Yes”為篩選條件，對(duì)HERB中收集的活性成分進(jìn)行篩選，篩選得到最終的活性成分.

威靈仙-白花蛇舌草藥對(duì)活性成分靶點(diǎn)的收集 將得到的活性成分在數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中收集對(duì)應(yīng)的Canonical SMILES，并在SwissTargetPrediction（http：//www.swiss-target-prediction.ch/）輸入各個(gè)活性成分的Canonical SMILES，物種屬性設(shè)置為“Homo sapiens”，選擇Probability > 0的靶點(diǎn)數(shù)據(jù).

癌癥靶點(diǎn)的收集 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）搜索關(guān)鍵詞“cancer”，選擇Score ≥ 20 的靶點(diǎn)；在OMIM（https：//www.omim.org/）里的Gene Map中搜索“cancer”，并收集該數(shù)據(jù)庫(kù)與癌癥疾病有關(guān)的所有作用靶點(diǎn).

疾病與藥物共同關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選 將藥物活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)上傳至Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），取得威靈仙-白花蛇舌草藥對(duì)與癌癥作用的靶點(diǎn)，即共同靶點(diǎn)，并作韋恩圖.

藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病的互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用軟件Cytoscape 3.9.0 將藥物、成分、靶點(diǎn)、疾病構(gòu)建成網(wǎng)絡(luò)圖，探究各個(gè)成分與各個(gè)靶點(diǎn)的相互關(guān)系.篩選出威靈仙-白花蛇舌草藥對(duì)中的藥物活性成分.

PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物與疾病的共同靶點(diǎn)上傳至STRING（https：//cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，物種屬性選擇“Homo sapiens”，余下參數(shù)皆為默認(rèn)值，將得到的相應(yīng)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 ，得到藥對(duì)活性成分與疾病的蛋白質(zhì)（PPI）互相作用網(wǎng)絡(luò)圖.利用該軟件中的Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治觯詃egree值為主要參考標(biāo)準(zhǔn)作圖，使用MCODE模塊軟件分析網(wǎng)絡(luò)圖中的基因簇，運(yùn)用cytoHubba模塊軟件以MCC為參考標(biāo)準(zhǔn)分析核心基因.

對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路的富集分析 將藥物與疾病的共同靶點(diǎn)上傳至Metascape（https：//metascape.org/），進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，分析該靶點(diǎn)集參與細(xì)胞組成、生物過程、分子功能的作用和種類，分析參與作用的信號(hào)通路類型，分析數(shù)據(jù)上傳至在線作圖平臺(tái)微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/），作氣泡圖.

重要活性成分與主要靶點(diǎn)的分子對(duì)接 在PDB（https：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中選取主要作用靶點(diǎn)蛋白的pdb格式文件，在TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)中選取重要藥物活性成分的mol2格式文件，用AutoDock-Vinna 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，用Pymol 軟件進(jìn)行可視化分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

篩選結(jié)果表明，威靈仙的活性成分28個(gè)，白虎蛇舌草的活性成分7個(gè)，有2個(gè)共同成分：白頭翁素（Anemonin），槲皮素（Quercetin）.

藥物靶點(diǎn)的篩選結(jié)果表明，威靈仙活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)467個(gè)，白花蛇舌草活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)264個(gè)，兩者合并去重，總共得到靶點(diǎn)523個(gè).

靶點(diǎn)篩選得到400個(gè)靶點(diǎn)，癌癥疾病靶點(diǎn)498個(gè)，合并去重后得到781個(gè)疾病靶點(diǎn).運(yùn)用Venny 2.1取藥物與疾病的交集靶點(diǎn)，得到交集靶點(diǎn)56個(gè).

運(yùn)用Cytoscape 3.9.0軟件將威靈仙的28個(gè)活性成分和白花蛇舌草的7個(gè)活性，與56個(gè)藥物和疾病的共同靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作.網(wǎng)絡(luò)由92個(gè)節(jié)點(diǎn)和244條邊組成，用Network Analyzer分析各個(gè)活性成分的Outdegree值.共同成分槲皮素（B1）的Outdegree值為18.威靈仙活性成分中最大Outdegree值為9，是恩貝林（WLX09）；白花蛇舌草活性成分中最大Outdegree值為14，是阿魏酸（BHSSC03）.

2.1 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物與疾病的共同靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件，得到藥物與疾病的共同靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，其degree值從里到外逐漸變小，靶點(diǎn)蛋白ESR1的degree值最大為45.以degree值為參考標(biāo)準(zhǔn)，選取數(shù)值最大的前八個(gè)基因靶點(diǎn)，運(yùn)用MCODE模塊軟件分析該網(wǎng)絡(luò)，得到2個(gè)基因簇（表2）.運(yùn)用cytoHubba模塊軟件以MCC為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析.前十的基因靶點(diǎn)為EGFR，CCND1，VEGFA，HRAS，STAT3，MAPK1，SRC，MDM2，AKT1，ESR1.

2.2 GO富集分析和KEGG通路的富集分析

將藥物與疾病的56個(gè)共同靶點(diǎn)上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路的富集分析.GO富集分析包括分子功能（MF）、生物過程（BP）和細(xì)胞組分（CC）.共同靶點(diǎn)集涉及分子功能條目78條，主要關(guān)于磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性、蛋白激酶活性；共同靶點(diǎn)集涉及細(xì)胞組分條目44條，主要關(guān)于受體復(fù)合體、微膜結(jié)構(gòu)域、膜筏；共同靶點(diǎn)集涉及生物過程條目100 2條，主要關(guān)于酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路、腺體的發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的響應(yīng).取GO富集分析3個(gè)部分，根據(jù)P值前五個(gè)條目在微生信平臺(tái)作氣泡圖（圖1）.

KEGG通路的富集分析涉及152個(gè)條目，主要關(guān)于癌癥通路、癌癥中的蛋白聚糖、癌癥中的微小RNA、化學(xué)致癌-受體的激活、前列腺癌，還有PI3K-Akt這條重要信號(hào)通路.根據(jù)P值選取KEGG通路的富集分析結(jié)果前20個(gè)條目，在微生信平臺(tái)作氣泡圖（圖2）.

2.3 分子對(duì)接驗(yàn)證

選取槲皮素、阿魏酸和恩貝林這三個(gè)藥物活性成分別與靶點(diǎn)蛋白ESR1進(jìn)行分子對(duì)接.運(yùn)用AutoDock-Vinna對(duì)接，用Pymol分析結(jié)果顯示.槲皮素與ESR1蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，形成1個(gè)氫鍵，結(jié)合能為-7.7 kcal/mol（圖3）；阿魏酸與ESR1蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，形成1個(gè)氫鍵，結(jié)合能為-6.0 kcal/mol（圖4）；恩貝林與ESR1蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，形成3個(gè)氫鍵，結(jié)合能為-7.0 kcal/mol（圖5）.以上三個(gè)活性成分與靶點(diǎn)蛋白皆有較好的結(jié)合性.

3 討論

篩選出藥對(duì)中的槲皮素、阿魏酸和恩貝林三個(gè)重要活性成分，通過對(duì)篩選出的共同靶點(diǎn)集進(jìn)行PPI蛋白互作，ESR1是最重要的靶點(diǎn).將該靶點(diǎn)與篩選出的三個(gè)藥物活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)三個(gè)活性成分與ESR1靶點(diǎn)蛋白都具有較好的結(jié)合性.對(duì)共同靶點(diǎn)集進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示多集中于癌癥通路.

在蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中，結(jié)合三種篩選方式，得到前五核心靶點(diǎn)分別是ESR1，CCND1，EGFR，STAT3，HRAS.乳腺癌發(fā)病后，ESR1會(huì)發(fā)生突變，是乳腺癌的標(biāo)志產(chǎn)物[6]，有部分患者的ESR1會(huì)發(fā)生甲基化，而ESR1未發(fā)生甲基化的患者的存活率比發(fā)生甲基化的患者存活率要高[7]；ESR1甲基化后也會(huì)影響卵巢癌的發(fā)生，說明ESR1與多種疾病有著很大的關(guān)聯(lián)性.[8]鑒于ESR1的關(guān)聯(lián)性較多，猜測(cè)該基因與其他癌癥疾病的發(fā)病原因存在較大的關(guān)系.

槲皮素、阿魏酸、恩貝林這三種活性成分與疾病靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)度最大，具有更大的研究?jī)r(jià)值.分子對(duì)接顯示，這三種活性成分與ESR1靶點(diǎn)蛋白都有較好的結(jié)合性.槲皮素對(duì)多種癌癥均有不俗的治療效果.如Wang發(fā)現(xiàn)槲皮素通過轉(zhuǎn)錄因子EB和活性氧依賴性鐵凋亡的溶酶體活化誘導(dǎo)p53非依賴性癌細(xì)胞死亡[9]，能夠調(diào)節(jié)ROS穩(wěn)態(tài)，抑制Akt和NF-KB途徑，使前列腺癌細(xì)胞凋亡和壞死.[10]除了直接作用于癌細(xì)胞，槲皮素還可以通過改變癌細(xì)胞的耐藥性.Lu等發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過通過雄激素受體和PI3K-Akt信號(hào)通路，降低了前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的耐藥性.[11]有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，阿魏酸處理宮頸癌細(xì)胞系的細(xì)胞后，分別能達(dá)到88.3%和85.4%的抑制率，且隨著阿魏酸處理濃度的增加，宮頸癌細(xì)胞周期中的G0期 或 G1期都能發(fā)生顯著性停滯，也會(huì)降低相關(guān)蛋白的自噬.[12]在對(duì)肺癌的治療中，阿魏酸衍生物中的FXS-3能對(duì)ERK/p38，AKT/mTOR和MEK/ERK信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)調(diào)控，阻止信號(hào)的傳遞，進(jìn)而使肺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移受到了抑制，能有效達(dá)到治療肺癌的目的[13]，而另一種衍生物4-乙烯基愈創(chuàng)木酚治療結(jié)腸癌是通過誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡達(dá)到治療作用的.[14]恩貝林能改變?nèi)梭w乳腺細(xì)胞癌焦點(diǎn)的基因表達(dá)，主要體現(xiàn)于細(xì)胞增殖的抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡這兩方面.[15]恩貝林能抑制Akt信號(hào)的傳導(dǎo)，能使活化的GSK-3β部分促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡.[16]在治療胰腺癌的作用中，恩貝林除了能抑制Akt和Shh通路使胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受阻，還可以調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境抑制炎癥.[17]目前尚未見有槲皮素、阿魏酸、恩貝林這三種活性成分對(duì)靶蛋白ESR1作用的研究報(bào)道，基于三種活性成分現(xiàn)有的研究，猜測(cè)ESR1可能是這三種活性成分潛在的作用靶點(diǎn).

對(duì)靶點(diǎn)集的富集分析發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號(hào)通路的P值最大，猜想該通路是治療癌癥重要的信號(hào)通路. Ma等發(fā)現(xiàn)PHLDA2的下調(diào)通過PI3K-AKT信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌的EMT并促進(jìn)自噬.[18]Wang等發(fā)現(xiàn)LINC01559通過上調(diào)PGK1，誘導(dǎo)PTEN啟動(dòng)子的甲基化，使PTEN受到抑制，進(jìn)而激活PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖.[19]Wang等發(fā)現(xiàn)黃芪素能在治療胃癌過程中首先誘導(dǎo)凋亡信號(hào)蛋白的表達(dá)，通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散，達(dá)到治療胃癌的作用.[20]胡椒堿在治療胃癌的過程中，同樣通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來抑制增殖并誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡，其中涉及到了上調(diào)Bax，Bad的蛋白表達(dá)和下調(diào)Bcl-2，Bcl-xl的蛋白表達(dá).[21]激活或抑制PI3K-AKT信號(hào)通路會(huì)引起相關(guān)癌癥發(fā)病或誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，猜想PI3K-AKT信號(hào)通路是藥對(duì)治療癌癥的主要通路.

綜上所述，藥對(duì)的活性成分可能通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號(hào)通路作用于癌癥疾病的靶點(diǎn)，達(dá)到治療癌癥的目的.

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