詹新宇 李博樂 張永華 江長青

摘要：目的 探索自擬補骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉（alendronate sodium，ALN）緩解激素性股骨頭壞死的具體機制。

方法 在前期臨床研究基礎上，利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立激素性股骨頭壞死家兔模型，經中西藥聯(lián)合干預后，研究激素性股骨頭壞死模型兔的骨組織結構、病理、細胞凋亡以及股骨頭壞死分子標志物的變化。

結果 自擬補骨方聯(lián)合西藥ALN改善股骨頭壞死狀態(tài)，并降低凋亡細胞的百分比。同時，自擬補骨方西藥聯(lián)合給藥下調破骨細胞分化因子（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的表達，上調模型兔中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）及骨保護素（osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG）表達，降低RANKL/OPG比值。

結論 自擬補骨方聯(lián)合西藥ALN通過下調RANKL/OPG途徑在預防LPS誘導的股骨頭壞死方面顯示出協(xié)同作用。

關鍵詞：股骨頭壞死；中藥補骨方；阿侖膦酸鈉；類固醇激素；RANKL/OPG通路

中圖分類號：R681.8

文獻標志碼：B

文章編號：1007-2349（2023）07-0001-03

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是骨科常見疾病類型之一，最主要癥狀為局部股骨頭發(fā)炎、髖關節(jié)疼痛且活動受限，嚴重影響患者的生活質量。ONFH根據病因不同可以分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性。創(chuàng)傷性ONFH主要是由嚴重外部創(chuàng)傷引起的，其病因和發(fā)病機制是明確的；然而，非創(chuàng)傷性ONFH主要是由激素、酒精及代謝性疾病引起，造成股骨頭內部血液供應異常，最終導致股骨頭中的活骨壞死［1-2］。類固醇激素引起的股骨頭壞死是非創(chuàng)傷性ONFH的最常見形式，占所有ONFH病例的30～50％。ONFH多發(fā)于20～50歲的中青年，且其發(fā)病率趨于年輕化［3］。ONFH嚴重影響了人們的健康，針對ONFH的治療尤為迫切。目前，多種西藥已被應用于ONFH的臨床治療，例如抗凝血藥和血管擴張劑、降脂藥、雙膦酸鹽類等；臨床研究證實雙膦酸鹽類藥物能預防股骨頭的破壞和變形，其中阿侖膦酸鈉有防止廣泛塌陷的骨頭繼續(xù)塌陷的潛能［4］。然而目前臨床上對于西藥治療ONFH的用藥時機、劑量等問題仍缺乏相關的系統(tǒng)研究，且存在著靶向性低，易產生副作用等缺點。傳統(tǒng)中藥在中國已經使用了數(shù)千年，具有許多優(yōu)點，如多靶點、全身調節(jié)、副作用小和價格低廉。近年來大量研究證明中藥能減輕骨壞死程度、有效延緩ONFH的進程［5］。之前的研究證明補骨方在ONFH中顯示出良好的臨床療效［6］，但其在ONFH中的功能和機制卻鮮為人知。在這項研究中，筆者建立了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ONFH兔模型，并研究了補骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉在LPS誘導的ONFH中的作用和機制。

1 資料與方法

1.1 動物模型構建 新西蘭大白兔共20只，年齡8周，體重約2.5 kg，雄性，按照標準飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。實驗白兔購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司。待實驗白兔適應性喂養(yǎng)1周后，精確稱重，隨機選取5只作為空白對照組，其余15只作為模型組。模型組動物經耳緣靜脈注射10 μg/kg脂多糖，24 h后于右側臀部肌肉注射醋酸潑尼松龍20 mg/kg，連續(xù)注射3 d，每次間隔24 h。空白對照組注射同等劑量的生理鹽水，不注射脂多糖和醋酸潑尼松龍。為預防感染，動物每周2次肌肉注射青霉素鈉，每次每只5萬單位。造模6周后，通過對比空白對照組動物和模型組動物的進食量、毛色狀況、體重、注射部位病變程度、精神狀態(tài)評價造模是否成功。然后隨機選取1只對照組和3只模型組動物采集股骨固定并進行HE染色。此次研究中所有動物實驗均已經過當?shù)貍惱頃徟ㄟ^。

1.2 給藥方式 將造模成功的剩余12只動物隨機分為三組，每組4只，即模型組、西藥組、補骨方+西藥組。西藥組為阿侖膦酸鈉（alendronate sodium，ALN，北京萬生藥業(yè)），按照150 μg/kg·d-1進行灌胃；補骨方+西藥聯(lián)合給藥組為阿侖膦酸鈉加上自擬補骨方。中藥補骨方由12種中草藥組成，包括血竭、龍膽、川芎、黨參、紫草、白術、牛膝、紅花、金銀花、麥冬、沒藥和甘草。將總重100 g草藥浸入1，000 mL水中，煮沸濃縮至250～300 mL。中藥劑量按兔子體重計算，使用前先將藥物稀釋于生理鹽水，按照25 g/ kg·d-1進行灌胃，對照組用等量的生理鹽水進行灌胃，共治療四周。

1.3 臨床觀察 觀察對比各組動物的進食量、毛色狀況、體重、注射部位病變程度、精神狀態(tài)、死亡率。

1.4 HE染色 白兔股骨組織置于多聚甲醛中固定后，用乙醇逐級脫水，經浸蠟、包埋后，制成4 μm組織切片，蘇木素染色7 min、伊紅染色1 min后在顯微鏡（Olympus，日本）下觀察。

1.5 TUNEL染色 使用細胞凋亡檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）檢測細胞凋亡率。組織切片用100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液室溫孵育20 min；再用100 μL1×Equilibration Buffer室溫孵育10 min；隨后加入TdT，37℃避光孵育60 min；最后滴加DAPI避光孵育5 min，然后在熒光顯微鏡（Olympus，日本）下觀察采集圖像。

1.6 RT-qPCR檢測 取100 mg組織，加入1 mL Trizol提取總RNA；通過Oligo引物利用逆轉錄酶反轉錄生成cDNA；以cDNA為模板進行PCR擴增，進行基因表達量分析。靶基因的相對表達量通過 2-ΔΔCt法分析；GAPDH作為內參；PCR反應條件為：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40循環(huán)；PCR反應引物序列如表1。

1.7 Western blotting 檢測 用EDTA脫鈣液對股骨標本進行脫鈣；隨后利用RIPA裂解液冰上提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后電泳跑膠（分離膠濃度為8%，蛋白上樣量為40 μg），轉膜；加入RANKL（1∶500；Bs-20624R，Bioss）和OPG（1∶500；Bs-2064R，Bioss）一抗，4℃過夜孵育；然后再加入辣根過氧化物酶耦聯(lián)二抗（1∶2，000；BA1054，博士德生物科技有限公司，武漢），37 ℃孵育1 h；最后顯影、拍攝，利用Image J軟件（Rockville，USA）處理圖像，測定灰度值。

1.8 統(tǒng)計學方法 所有結果以均值 ± 標準差的形式呈現(xiàn)，多組間比較采用單因素方差分析，2組之間比較采用t檢驗。數(shù)據統(tǒng)計分析和作圖軟件為GraphPad prism 7（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）。P<0.05和P<0.01為顯著性差異和極顯著性差異的篩選標準。

2 結果

2.1 臨床觀察結果 實驗過程中，對照組動物進食正常、毛色正常、體重增加，無異常。模型組動物進食減少、毛色干枯雜亂、體重下降、注射部位出現(xiàn)浮腫、行動不便。建模一周后，模型組動物右爪逐漸出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象，空白對照組動物右爪無變化。模型組動物與對照組相比，進食量明顯下降，精神狀態(tài)較萎靡，體重下降，毛發(fā)不光亮。與模型組相比，補骨方聯(lián)合ALN給藥后進食量有所增加，精神狀態(tài)漸漸轉好。體重較模型組有所回升，毛色逐漸恢復光亮。實驗過程中所有動物均未死亡。

2.2 組織病理學檢查結果 取白兔股骨組織進行HE染色。如圖1所示，對照組軟骨細胞排列均勻，細胞核呈圓形，形態(tài)正常，骨髓腔細胞正常，骨小梁完整，破骨細胞較少。模型組動物軟骨細胞損傷排列雜亂，細胞核固縮，骨小梁斷裂消失，骨髓腔細胞胞質顏色溶解著色變淺，細胞核固縮，破骨細胞增多。與模型組比較，ALN給藥后動物軟骨細胞輕微雜亂，骨小梁溶解較為明顯，骨髓腔細胞較少，著色較淺，細胞形態(tài)較差；補骨方與ALN組軟骨細胞排列較均勻，破骨細胞減少，骨髓腔細胞著色較正常，骨小梁略有溶解。這些結果說明模型組白兔出現(xiàn)了明顯的股骨損傷；ALN延緩了股骨壞死進程，而補骨方與ALN聯(lián)合給藥展現(xiàn)出更好的療效。

2.3 補骨方聯(lián)合ALN對白兔股骨組織ALP含量的影響 ALP是成骨細胞早期分化的標志物，其含量變化如圖2所示。與對照組相比，模型組中ALP含量明顯下降（P<0.01）；與模型組相比，ALN處理后，ALP含量有所上升（P<0.01）；與西藥組相比，補骨方聯(lián)合ALN處理組ALP含量上升趨勢更明顯（P<0.01）。在ONFH模型兔中，骨代謝活性明顯下降；ALN單獨處理改善了骨代謝活性；而補骨方ALN聯(lián)合給藥對改善骨代謝活性的效果更加顯著。

2.4 補骨方聯(lián)合ALN對白兔股骨細胞凋亡的影響 TUNEL染色法檢查細胞凋亡率，結果如圖3所示。與對照組相比，ONFH模型兔中凋亡細胞數(shù)量明顯上升（P<0.01）；ALN有效降低了細胞凋亡率（P<0.01）；與西藥組相比，補骨方ALN聯(lián)合給藥展現(xiàn)出更好的療效（P<0.01）。在ONFH兔中股骨細胞凋亡增多，補骨方聯(lián)合ALN有效抑制了細胞凋亡。

2.5 補骨方聯(lián)合ALN對白兔股骨組織中RANKL、OPG基因mRNA及蛋白表達的影響 如圖4所示，與空白對照組相比，模型組白兔股骨組織中RANKL基因和蛋白表達量均明顯上調，OPG基因和蛋白表達顯著下調（P<0.01；圖4A、B、D），RANKL/OPG比值增加（P<0.01；圖4C）；ALN處理后，與模型組相比，RANKL基因表達含量下降，而OPG基因表達含量上升，RANKL/OPG比值降低（P<0.01；圖4A-C），并且RANKL蛋白表達量下降，OPG蛋白表達量上升（P<0.01；圖4D）；與西藥單獨處理相比，補骨方聯(lián)合ALN聯(lián)合處理效果更加明顯（P<0.01）。RANKL及OPG的含量變化說明補骨方聯(lián)合ALN通過下調RANKL/OPG抑制ONFH進程。

3 討論

類固醇通過一系列的信號通路介導成骨細胞凋亡和破骨細胞分化，從而打破了骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡，并導致ONFH［7］。類固醇-ONFH在臨床工作中經常出現(xiàn)，可導致高度致殘。因此，開發(fā)新的藥物或療法來治療和預防類固醇-ONFH迫在眉睫。目前針對ONFH的治療主要包括手術治療和非手術治療（物理治療、藥物治療等）［4］。中藥或天然提取物是藥物治療ONFH中一種有效手段，與其他類型的藥物相比，具有高效和低毒等特點［8］。在之前的臨床研究中，我們發(fā)現(xiàn)補骨方聯(lián)合ALN對激素性ONFH有一定作用［6］。本研究探究了補骨方對及激素性ONFH的抑制作用和機理。研究表明，在LPS誘導的兔ONFH模型中，股骨頭中成骨細胞的數(shù)量減少、骨組織中細胞凋亡數(shù)量增多，聯(lián)合使用ALN以及補骨方藥物可以使壞骨恢復并降低細胞凋亡率。LPS誘導RANKL的表達并抑制OPG的表達。聯(lián)合使用ALN加補骨方可以下調RANKL/OPG通路。

中醫(yī)學中，股骨頭壞死屬于“骨痹”和“骨蝕”范疇，其基本病機為血瘀阻絡、精不生髓［9］。中藥補骨方由十二種中草藥組成，包括血竭、龍膽、川芎、黨參、紫草、白術、牛膝、紅花、金銀花、麥冬、沒藥和甘草。此藥方中血竭、龍膽、川芎能夠活血行氣、祛風止痛且抗菌消炎，改善血液循環(huán)，保證骨組織的營養(yǎng)供應；黨參、白術燥濕健脾、益氣養(yǎng)血、補裨益不足；牛膝中的三萜類化合物能減輕激素引起的成骨細胞抑制和骨細胞凋亡引起的成骨障礙；紅花、沒藥具有活血止痛的作用；紫草、金銀花、麥冬能夠清熱解毒；甘草調和藥物且緩急止痛［10］。ALN是一種用于治療ONFH的西藥，它能夠增加骨密度、抑制骨溶解，有效抑制股骨頭壞死。本次研究證實補骨方聯(lián)合ALN處理減少了LPS誘導的ONFH中的破骨細胞數(shù)量，改善了股骨細胞形態(tài)，有效降低了股骨頭壞死。ALP是一種普遍存在于成骨細胞內的胞內酶，骨代謝旺盛時，ALP活性增強［11］。本次研究結果顯示，使用自擬補骨方和ALN聯(lián)合處理后，壞死骨組織中細胞凋亡率降低且ALP含量明顯上升；這說明補骨方ALN聯(lián)合處理改善了ONFH模型兔股骨壞死狀態(tài)，減緩了ONFH進程。RANKL/OPG是評價骨健康與調節(jié)骨吸收平衡的重要指標，其增加則促進成骨細胞凋亡，使骨形成延遲。OPG能抑制破骨細胞分化和活性，維持骨代謝平衡［12］。牛膝提取物對類固醇誘導的OPG下調和RANKL上調具有拮抗作用，并且對預防類固醇誘導的ONFH有好處［13］。本研究結果顯示，補骨方聯(lián)合ALN通過上調OPG表達和下調RANKL表達以降低RANKL/OPG比值，進一步增強了ALN對LPS誘導的ONFH的療效。

這項研究表明，補骨方ALN聯(lián)合處理可以通過下調RANKL/OPG通路來加速壞死骨的修復并改善LPS誘導的ONFH的發(fā)展進程，對LPS誘發(fā)的ONFH具有一定緩解作用。

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（收稿日期：2022-08-18）