易文琪，劉 晨，徐銘鴻，逄 川，王 瑾，董思淇，陳 雷解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 008；解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部，北京 008；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 000；解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心介入超聲科，北京 008；中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 深圳 8000

鼻用糖皮質(zhì)激素是治療過敏性鼻炎和慢性鼻竇炎等常見鼻部疾病的一線藥物[1-2]。它可以有效降低炎癥反應(yīng)，改善臨床癥狀，但長期使用可能造成局部過度刺激，引起干燥和鼻出血等不良反應(yīng)[3-5]。鼻用糖皮質(zhì)激素對纖毛運(yùn)動的作用結(jié)果一直備受關(guān)注[6-7]。黏液纖毛清除系統(tǒng)(mucociliary clearance，MCC)是呼吸道防御各種吸入顆粒和外來病原體的第一道防線，其主要的動力來源是協(xié)調(diào)的纖毛運(yùn)動[8]。決定黏液纖毛清除能力的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)是纖毛的擺動頻率(ciliary beat frequency，CBF)。鼻用藥物的生物安全性通常以CBF 作為重要的衡量指標(biāo)[9]。部分藥物的纖毛毒性會抑制CBF，造成MCC 功能減退，從而使鼻腔黏膜與病原體、污染物或致癌物的接觸時(shí)間延長，最終導(dǎo)致鼻黏膜的感染或損傷[7]。因此，評價(jià)鼻用糖皮質(zhì)激素對纖毛運(yùn)動的影響具有重要意義。臨床上常見的鼻用糖皮質(zhì)激素包括布地奈德、糠酸莫米松和丙酸氟替卡松等。既往離體研究發(fā)現(xiàn)，未稀釋的布地奈德會導(dǎo)致纖毛可逆的停滯，50% 稀釋濃度的糠酸莫米松和丙酸氟替卡松則可造成纖毛完全不可逆的停滯[6-7]。然而，離體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不能完全反映在體鼻黏膜的生理狀態(tài)，因?yàn)殡x體組織或細(xì)胞失去了在體時(shí)的生理環(huán)境[10]，以及神經(jīng)、免疫等固有調(diào)控機(jī)制的保護(hù)[11-12]，使得離體纖毛更容易受藥物作用的影響。因此，離體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可能會放大藥物作用于纖毛的毒性作用，從而干擾局部用藥的精準(zhǔn)性。但由于觀察技術(shù)和設(shè)備的限制，在體觀測CBF 很難實(shí)現(xiàn)。本課題組前期通過應(yīng)用新型數(shù)碼顯微系統(tǒng)，在體觀察并記錄嚙齒類動物模型鼻黏膜表面的纖毛運(yùn)動，計(jì)算CBF、纖毛擺動幅度等數(shù)據(jù)，并探究了溫度[13]、卵清蛋白和組胺對纖毛運(yùn)動的影響[14]，成功建立了在體評估纖毛運(yùn)動的方法。基于該方法，我們擬觀察和分析鼻用糖皮質(zhì)激素對在體和離體鼻黏膜CBF 的影響，為進(jìn)一步探究鼻用糖皮質(zhì)激素潛在的纖毛毒性提供新的數(shù)據(jù)支持。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物 60 只清潔級3 月齡成年SD 大鼠，體質(zhì)量200 ~ 300 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。大鼠飼養(yǎng)于系統(tǒng)自動控制光照與溫度的動物飼養(yǎng)房內(nèi)，每日模擬光照與黑夜各12 h，溫度25℃，自由進(jìn)食水。大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 主要試劑和儀器 0.64%布地奈德(瑞典Astra Zeneca AB 公司)、0.05%糠酸莫米松(比利時(shí)MSD Belgium BVBA/SPRL 公司)、0.05%丙酸氟替卡松(西班牙Galxo Wellcome，S.A 公司)、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Invitrogen 公司)、青霉素-鏈霉素雙抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)、戊巴比妥鈉(美國Merck 公司)。數(shù)碼顯微系統(tǒng)(VHX6000，日本Keyence 公司)；鏡頭(Z100R，日本Keyence公司)；環(huán)形照明器(VH-Z100R，日本Keyence 公司)；高速數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)(VW-9000，日本Keyence 公司)。

3 動物分組 大鼠隨機(jī)分為在體觀察組和離體觀察組，每組30 只。每組又隨機(jī)分為布地奈德、糠酸莫米松和丙酸氟替卡松3 個(gè)亞組，各亞組均以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)作為對照，每個(gè)試驗(yàn)組和對照組各5 只大鼠。

4 在體觀察鼻黏膜纖毛運(yùn)動 參照本課題組已發(fā)表的研究方法[13-14]，在體觀察組大鼠按60 mg/kg的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，確認(rèn)麻醉深度后，全程密切觀察動物呼吸和心跳。切除大鼠單側(cè)鼻腔外側(cè)壁，暴露鼻中隔黏膜，將大鼠放置于帶有加熱墊的定制平臺以維持體溫和保持固定。將平臺放置于數(shù)碼顯微系統(tǒng)載物臺上，調(diào)整顯微鏡光源，使用高速數(shù)碼顯微系統(tǒng)對纖毛運(yùn)動影像進(jìn)行動態(tài)觀察，頻率設(shè)定為150 幀/s。即刻記錄未添加藥物前的纖毛擺動影像，每只大鼠隨機(jī)在鼻中隔黏膜上選取5 處感興趣區(qū)域(region of interest，ROI) 測量CBF，取平均值，代表這只大鼠CBF 基礎(chǔ)值。然后在試驗(yàn)組大鼠的鼻黏膜表面分別滴加0.1 μL 的布地奈德、糠酸莫米松和丙酸氟替卡松溶液，在對照組大鼠的鼻黏膜表面滴加0.1 μL 的PBS。每間隔5 min 記錄1 次纖毛運(yùn)動的影像，持續(xù)觀察并記錄纖毛運(yùn)動的情況60 min。

5 離體觀察鼻黏膜纖毛運(yùn)動 將離體觀察組大鼠過量麻醉后斷頭處死，立即解剖鼻中隔黏膜并放置于DMEM 培養(yǎng)液(補(bǔ)充有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素鈉和100 μg/mL 硫酸鏈霉素)中。培養(yǎng)基液體剛好不浸沒鼻黏膜表面，以避免影響表面黏液，然后放置于上述數(shù)碼顯微系統(tǒng)下觀察黏膜表面非邊緣區(qū)域的纖毛運(yùn)動，以減少取材切割過程中機(jī)械性刺激對纖毛的影響。維持環(huán)境恒溫恒濕。即刻記錄未添加藥物前的纖毛擺動影像，隨機(jī)在鼻中隔黏膜上選取5 處ROI 測量CBF，取平均值，代表這只大鼠離體觀察的CBF 基礎(chǔ)值。然后在試驗(yàn)組大鼠的鼻黏膜表面分別滴加0.1 μL 鼻用糖皮質(zhì)激素，在對照組大鼠的鼻黏膜表面滴加0.1 μL PBS。每5 min 記錄1 次纖毛運(yùn)動的影像，持續(xù)觀察60 min。

6 CBF 的測量和評估 按照Francis 和Lo[15]描述的方法，使用Fiji/ImageJ 軟件包處理纖毛運(yùn)動影像。沿纖毛運(yùn)動方向，在感興趣的纖毛波上畫一條直線，然后使用 “Reslice”功能生成具有波浪圖案的圖像。測量每個(gè)波峰之間的像素?cái)?shù)，計(jì)算纖毛每秒擺動次數(shù)，即CBF (Hz) = 每秒像素/每個(gè)波的像素，因?yàn)槊總€(gè)像素代表1 幀圖像。對于在體和離體觀察，每只大鼠的CBF 為該時(shí)間點(diǎn)記錄的纖毛運(yùn)動影像中隨機(jī)5 處ROI 的CBF 平均值。根據(jù)Merkus 等[16]的描述將藥物對纖毛的抑制程度分為3 類：60 min 后，CBF 恢復(fù)到基礎(chǔ)值的75%或以上，為纖毛友好；恢復(fù)到基礎(chǔ)值的25% ~75%，為纖毛抑制；恢復(fù)到基礎(chǔ)值的25% 或更低，為纖毛停滯。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，在體和離體CBF 數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。CBF 隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，組間比較采用Sidak 多重比較檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 在 體 和 離 體 觀 察鼻 黏膜 的CBF 比 較 在體大鼠鼻黏膜的CBF 顯著高于離體鼻黏膜[(9.83 ±0.94) Hzvs(6.10 ± 0.91) Hz，P＜0.001)]。見圖1。

圖1 在體與離體觀察鼻黏膜的CBF 比較(n=30)Fig.1 Comparison of CBF of nasal mucosa observed in vivo and in vitro (n=30)

2 布地奈德對在體和離體鼻黏膜CBF 的影響在體條件下，鼻黏膜滴加布地奈德后CBF 在60 min內(nèi)無顯著變化。離體條件下，布地奈德加藥后造成CBF 即刻下降，于15 min 時(shí)下降至最低，為加藥前的26.24%，60 min 恢復(fù)至基礎(chǔ)值的55.38%，且加藥后組間各時(shí)間點(diǎn)的CBF 與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 布地奈德和PBS 對在體和離體鼻黏膜CBF 的影響A：布地奈德對在體CBF 的影響；B：布地奈德對離體CBF的影響(n=5；bP＜0.01，vsPBS)Fig.2 Effect of budesonide and PBS on CBF of nasal mucosa in vivo and in vitro A: Effect of budesonide on CBF in vivo; B: Effect of budesonide on CBF in vitro (n=5; bP＜0.01, vsPBS)

3 糠酸莫米松對在體和離體鼻黏膜CBF 的影響在體條件下，鼻黏膜滴加糠酸莫米松后CBF 在60 min 內(nèi)無顯著變化。而離體條件下，糠酸莫米松在60 min 內(nèi)造成CBF 緩慢而持續(xù)的下降，于60 min 時(shí)降至最低，為加藥前的44.11%，且加藥5 min 后組間各時(shí)間點(diǎn)的CBF 與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 糠酸莫米松和PBS 對在體和離體鼻黏膜CBF 的影響A：糠酸莫米松對在體CBF 的影響；B：糠酸莫米松對離體CBF 的影響(n=5；aP＜0.05，bP＜0.01，vsPBS)Fig.3 Effect of mometasone furoate and PBS on CBF of nasal mucosa in vivo and in vitro A: Effect of mometasone furoate on CBF in vivo; B: Effect of mometasone furoate on CBF in vitro (n=5; aP＜0.05, bP＜0.01, vsPBS)

4 丙酸氟替卡松對在體和離體鼻黏膜CBF 的影響 在體條件下，鼻黏膜滴加丙酸氟替卡松后CBF在60 min 內(nèi)無顯著變化。離體條件下，丙酸氟替卡松在60 min 內(nèi)使CBF 呈波動式下降，在60 min時(shí)抑制程度為加藥前的67.81%，且在加藥0 ~ 5 min和20 ~ 60 min 時(shí)，組間各時(shí)間點(diǎn)的CBF 與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖4。

圖4 丙酸氟替卡松和PBS 對在體和離體鼻黏膜CBF 的影響A：丙酸氟替卡松對在體CBF 的影響；B：丙酸氟替卡松對離體CBF 的影響(n=5；aP＜0.05，bP＜0.01，vsPBS)Fig.4 Effect of fluticasone propionate and PBS on CBF of nasal mucosa in vivo and in vitro A: Effect of fluticasone propionate on CBF in vivo; B: Effect of fluticasone propionate on CBF in vitro (n=5; aP＜0.05,bP＜0.01, vsPBS)

討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體與離體鼻黏膜纖毛運(yùn)動有差異，在體CBF 基礎(chǔ)值顯著高于離體，這與本課題組既往研究結(jié)果一致[13]。主要原因是離體組織局部生理環(huán)境的改變，如Ca2+濃度、ATP、pH 值及乙酰膽堿等[17-18]；取材過程造成的機(jī)械性刺激可能是另一重要的影響因素。本研究的離體實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基沒有淹沒和破壞鼻黏膜表面的黏液層，有效減少了鼻黏膜生物結(jié)構(gòu)的變化。觀察的目標(biāo)是位于鼻黏膜表面的纖毛，而不是組織邊緣或單個(gè)纖毛細(xì)胞表面的纖毛，因此有效減少了機(jī)械性刺激的干擾。但離體組織周圍的生物成分改變，如Ca2+濃度降低，可能會導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流減少，影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+的周期性震蕩所產(chǎn)生的纖毛同步的異相波，鼻黏膜的CBF 會受到顯著抑制[17]。同時(shí)，離體組織失去了局部的血液循環(huán)和神經(jīng)調(diào)控，組織缺氧會造成細(xì)胞酸化以及纖毛直接供能物質(zhì)ATP 銳減[17]。這些因素均可能是引起CBF 基礎(chǔ)值下降的原因。

本研究首次評估了臨床常用的3 種鼻用糖皮質(zhì)激素——布地奈德、糠酸莫米松和丙酸氟替卡松鼻噴激素對大鼠在體和離體鼻黏膜纖毛功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于離體組，鼻用糖皮質(zhì)激素對在體纖毛CBF 無顯著影響。本研究采用新型數(shù)碼顯微系統(tǒng)觀察和分析在體鼻黏膜纖毛運(yùn)動，實(shí)驗(yàn)操作過程對纖毛正常的生理狀態(tài)干擾較小，相較于既往研究更接近纖毛運(yùn)動的實(shí)際情況[13]，有助于在實(shí)際臨床中進(jìn)一步探究鼻用糖皮質(zhì)激素的纖毛毒性。既往臨床研究中，Atar 等[19]采用糖精試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，布地奈德、糠酸莫米松和丙酸氟替卡松對人體MCC 無顯著影響，與本研究的在體動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[7,20]。Naclerio 等[21]采用放射性粒子示蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)布地奈德會改善過敏性鼻炎患者的MCC，糠酸莫米松則對MCC 無影響，但這些臨床試驗(yàn)無法從微觀角度直接觀察纖毛的實(shí)時(shí)運(yùn)動情況。本研究為進(jìn)一步精準(zhǔn)評價(jià)鼻用藥物的安全性提供了新的方法及數(shù)據(jù)支持。在離體實(shí)驗(yàn)中，我們將未稀釋的鼻用糖皮質(zhì)激素直接作用于鼻黏膜表面，發(fā)現(xiàn)60 min 內(nèi)鼻用糖皮質(zhì)激素可造成CBF 顯著抑制。其中，布地奈德表現(xiàn)為可逆的纖毛抑制作用，而糠酸莫米松和丙酸氟替卡松則對CBF 呈現(xiàn)持續(xù)且不可逆的纖毛抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與既往的研究結(jié)果一致[6-7]。在體鼻黏膜不斷分泌黏液，稀釋并向外傳輸?shù)渭釉诒丘つけ砻娴乃幬铮瑴p少藥物與原位纖毛的接觸時(shí)間，使藥物作用時(shí)間變短。但離體鼻黏膜組織失去了分泌黏液的生理功能，且離體黏膜表面纖毛周圍黏液層的生理結(jié)構(gòu)不再完整，這可能也是離體鼻黏膜CBF 無法完全恢復(fù)的原因之一。

目前，各種離體評價(jià)方法，如離體組織、原代培養(yǎng)、氣液界面培養(yǎng)及類器官等已廣泛應(yīng)用于鼻內(nèi)制劑安全性的研究，但均存在不足：纖毛上皮組織在取材時(shí)會受到機(jī)械性破壞從而引起纖毛繼發(fā)性運(yùn)動障礙[22]；原代培養(yǎng)的纖毛細(xì)胞表面缺乏黏液層，纖毛直接暴露于藥物中[10]；氣液界面培養(yǎng)物的黏液層會過度聚集，更換培養(yǎng)基或添加藥物后，會沖洗黏液導(dǎo)致CBF 增加，而24 h 內(nèi)黏液再生會抑制CBF[23]。同時(shí)，由于藥物在培養(yǎng)基內(nèi)持續(xù)存在，可能會對纖毛造成持續(xù)性的影響。因此，本研究在維持纖毛原有生理環(huán)境完整性的前提下，直接觀察并分析活體動物鼻黏膜上的纖毛運(yùn)動，實(shí)現(xiàn)了對纖毛運(yùn)動進(jìn)行高質(zhì)量、實(shí)時(shí)、穩(wěn)定、微觀的在體成像。該研究結(jié)果可作為鼻用藥物臨床前研究的在體數(shù)據(jù)的有效補(bǔ)充。

本研究的局限性是建立動物觀察模型過程中存在有創(chuàng)的手術(shù)操作，只能進(jìn)行一次性實(shí)驗(yàn)，無法繼續(xù)觀察藥物重復(fù)暴露對CBF 的影響。本研究的在體研究結(jié)果在60 min 內(nèi)表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，但由于建模方法的限制，無法觀察到藥物對纖毛的長期影響。已知研究表明，人類正常的黏液纖毛傳輸時(shí)間不超過 30 min[24]。因此，我們認(rèn)為60 min 的實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間是充足的。

鼻用糖皮質(zhì)激素是鼻內(nèi)給藥的經(jīng)典代表。鼻內(nèi)給藥不僅用于鼻腔局部疾病的治療，還應(yīng)用于全身治療及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[25-26]。在鼻用藥物及配方應(yīng)用于人體前，需采用動物研究評估其安全性。本研究所使用的在體評估系統(tǒng)為鼻用藥物安全性和纖毛毒性研究提供了一種更客觀的評價(jià)手段。同時(shí)，該方法也為直接觀察人體鼻黏膜纖毛運(yùn)動提供了更多的可能性，若能改良成像系統(tǒng)，使其具備類似鼻內(nèi)鏡的形態(tài)和功能，將有望發(fā)展為一種能夠廣泛開展的客觀定量的臨床檢查手段，極大地提高纖毛相關(guān)疾病的臨床診斷能力。

綜上所述，本研究通過新型數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)觀察，發(fā)現(xiàn)布地奈德、糠酸莫米松和丙酸氟替卡松對離體觀察的大鼠鼻黏膜的纖毛運(yùn)動均產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，而對在體觀察的大鼠鼻黏膜纖毛運(yùn)動并無顯著的影響。這表明鼻用糖皮質(zhì)激素?zé)o顯著的纖毛毒性，具有良好的安全性；同時(shí)本研究所使用的在體評估系統(tǒng)彌補(bǔ)了離體觀察與機(jī)體真實(shí)環(huán)境差異較大的不足，可用于客觀評價(jià)鼻用藥物的安全性和纖毛毒性。

作者貢獻(xiàn)易文琪、劉晨：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)施實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)解釋，文章撰寫；徐銘鴻、逄川：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)解釋，文章內(nèi)容修改；王瑾、董思淇：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)解釋，提供實(shí)驗(yàn)試劑、經(jīng)費(fèi)和技術(shù)支持；陳雷：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)解釋。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文相關(guān)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：yiwenqi_028@163.com。