王紅坤，張炫，李雨時，宗德琴，梁鋮，張洋逸，趙洪木

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院蜂學(xué)系，云南 昆明 650201）

約80%的異花傳粉植物需要昆蟲授粉進行繁殖，而人工栽培的作物有2/3 必須通過昆蟲授粉才能獲得高產(chǎn)和豐產(chǎn)，蜜蜂科內(nèi)昆蟲是地球最為重要的授粉昆蟲，在糧食安全、生態(tài)可持續(xù)性和生物多樣性方面發(fā)揮著不可替代的作用[1]。盡管在過去的50 年間我國蜂群飼養(yǎng)數(shù)量仍保持快速增長趨勢，但是由于疾病流行與頻發(fā)導(dǎo)致的飼養(yǎng)蜂群持續(xù)性的丟失，極大制約了我國養(yǎng)蜂業(yè)的健康發(fā)展[2]。在眾多蜜蜂病害中，蜜蜂病毒病尤其特殊。第一個蜜蜂病毒——蜜蜂囊狀幼蟲病毒于2013 年被首次報道，隨后陸續(xù)有30 余種蜜蜂病毒被報道，最常見和傳播最廣的病毒包括急性蜜蜂麻痹病毒（Acute bee paralysis virus，ABPV）、黑蜂王臺病毒（Black queen cell virus，BQCV）、慢性蜜蜂麻痹病毒 （Chronic bee paralysis virus，CBPV）、 殘翅病毒（Deformed wing virus，DWV）、以色列急性麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus，IAPV）、克什米爾蜜蜂病毒（Kashmir bee virus，KBV） 和蜜蜂囊狀病毒（Sacbrood virus，SBV），但并未引起足夠的重視[3-5]。與其他昆蟲病毒相比，蜜蜂病毒多為RNA 病毒，具有種類多、易變異、多因素聯(lián)合致病和多寄主寄生能力等特點，可在同生境條件下進行相互交叉?zhèn)鞑?，對蜜蜂的影響非常?fù)雜，導(dǎo)致在致病機理研究和疾病防控上依然知之甚少，也一直是蜜蜂病害研究的熱點[6-7]。由于缺乏在病毒傳播動力學(xué)、發(fā)病機制、流行病學(xué)和寄主免疫學(xué)方面的知識及相關(guān)數(shù)據(jù)，蜜蜂病毒病的流行與傳播機制仍未得到完全揭示，目前尚無有效預(yù)防和治療手段；加上蜜蜂的新引進和國際交流，蜜蜂病毒在全球范圍內(nèi)迅速傳播[8]。規(guī)?；B(yǎng)蜂生產(chǎn)的飼養(yǎng)管理模式下的飼養(yǎng)蜂群因生產(chǎn)需求、飼養(yǎng)品種、營養(yǎng)條件、飼養(yǎng)小環(huán)境、病蟲害流行等多種生物及非生物因素協(xié)同作用，飼養(yǎng)蜂群疾病流行與爆發(fā)呈現(xiàn)多因子聯(lián)合脅迫的趨勢，給疾病防控與診斷帶來新的挑戰(zhàn)[9]。

在試驗中，我們以人工飼養(yǎng)蜂場內(nèi)的東西方蜜蜂實驗蜂群以及蜂場周圍的部分蜜粉源植物作為研究對象，檢測七種最常見和傳播最廣的病毒在其體內(nèi)或不同組織中的存在情況，為蜂場內(nèi)蜜蜂病毒病的流行病學(xué)調(diào)查及其傳播途徑研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

分別采集自實驗蜂場的東、西方蜜蜂樣本，以及蜂場周圍的有花植物的花、莖、葉組織樣本，放置于-80℃短期保存或直接進行下一步操作。采用TRNzol 法提取樣本總RNA，使用FarstKing 一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行一步法RT-PCR，凝膠電泳后送至上海生工生物檢測驗證，進行蜜蜂常見病毒病的流行病學(xué)調(diào)查。

1.2 試驗儀器與試劑

1.2.1 主要儀器設(shè)備

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（GAX-9140），電子分析天平，臺式高速冷凍離心機，瓊脂糖水平電泳儀，伯樂普通PCR 儀（T100），超微量核酸測定儀（NanoPhotometer N50-Touch），超凈工作臺（SJ-CJ2FD 雙人單面潔凈工作臺），雪科制冰機，超低溫冰箱，高壓滅菌鍋，微波爐。

1.2.2 主要試劑

細(xì)胞裂解液（TRNzol Universal），純化回收試劑盒、一步法反轉(zhuǎn)錄RT-PCR 試劑、cDNA 第一鏈合成試劑、熒光定量預(yù)混試劑[EastepTM Gel and PCR Clean-up System、FastKing One Step RT-PCR Kit、FastKing RT Kit(With gDNase)、SuperReal PreMix Color (SYBR Green)，天根生化科技有限公司]；低熔點瓊脂糖粉。

1.3 引物設(shè)計與合成

通過文獻查閱[10]確定用于蜜蜂病毒病流行病學(xué)調(diào)查的引物對，具體引物信息見表1。本試驗所用引物均由生工生物股份有限公司合成。用RNase-free H2O 溶解至濃度為10 μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 用于蜜蜂病毒病的流行病學(xué)調(diào)查的七種蜜蜂病毒引物的堿基序列

1.4 核酸提取

按照TRNzol Universal 說明書，將待處理樣本進行核酸提取，獲得樣本總RNA，用超微量核酸測定儀，通過測定260 nm 處的吸收峰來測定總RNA 的濃度，以260 nm/280 nm的吸光度比來估計RNA的純度，所有樣本OD260/OD280 值均高于1.8。將RNA 置于-80℃暫存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙乱徊皆囼灐?/p>

1.5 反應(yīng)條件的設(shè)定

根據(jù)FastKing One Step RT-PCR Kit 說明書，擴增體系如下：12.5 μL 2×FarstKing One Step RT-PCR MasterMix，1 μL 25×RT-PCR Enzyme Mix，各0.75 μL 上下游特異性引物，1 μL 樣本總RNA 模板，7 μL RNase-free H2O。利用PCR 儀對提取的RNA 進行擴增，反應(yīng)條件為：42 ℃，30 min；95 ℃，3 min；94 ℃，30 sec；60℃，30 sec；72 ℃，30 sec；40 個循環(huán)；72 ℃，5 min。擴增結(jié)束后，使用1%~2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將經(jīng)過紫外透射觀察到目的條帶片段的樣本送至上海生工生物股份有限公司進行測序確定。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測結(jié)果

分別使用七種蜜蜂病毒的特異性引物對將獲得的各樣本總RNA 進行RT-PCR 擴增反應(yīng)后用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，。只有DWV、BQCV 和SBV 三種蜜蜂病毒特異性引物對在目標(biāo)位置附近出現(xiàn)且僅出現(xiàn)一個條帶。以DWV 為例，其特異性引物對在Marker 711 bp 附近出現(xiàn)且僅出現(xiàn)一個條帶，與預(yù)期相符（圖1），將經(jīng)過紫外透射觀察到目的條帶片段的樣本送至上海生工生物股份有限公司進行測序，將測序結(jié)果使用NCBI 的BLAST 程序與參考基因組MH165180 進行比對，結(jié)果核苷酸序列同一性均超過96.32%，確定獲得的片段為DWV 片段。

圖1 引物對DWVF/DWVR 的RT-PCR 擴增結(jié)果Fig.1 Results of RT-PCR amplification of DWVF/DWVR with primers

2.2 東、西方蜜蜂中的蜜蜂病毒病流行病學(xué)調(diào)查

對采集的東、西方蜜蜂樣品進行一步法RT-PCR 調(diào)查七種蜜蜂病毒病流行病學(xué)，凝膠電泳后送檢測序確定。檢測結(jié)果顯示，東方蜜蜂研究所實驗蜂場內(nèi)僅有BQCV、DWV、IAPV、SBV 存在，且DWV 的總樣品陽性檢出率最高。其中，東方蜜蜂樣品中僅發(fā)現(xiàn)BQCV、DWV 和SBV 三種病毒，且DWV 的檢出率最高；西方蜜蜂樣品中僅發(fā)現(xiàn)BQCV、DWV、IAPV 和SBV 四種病毒，且DWV 的檢出率最高。西方蜜蜂中的BQCV、DWV 和SBV 三種病毒檢出率均高于東方蜜蜂（表2-1）。

表2-1 東、西方蜜蜂中七種蜜蜂病毒病流行病學(xué)結(jié)果

2.3 有花植物中的蜜蜂病毒病流行病學(xué)調(diào)查

對采集的東、西方蜜蜂樣品進行一步法RT-PCR 調(diào)查七種蜜蜂病毒病流行病學(xué)，凝膠電泳后送檢測序確定。檢測結(jié)果顯示，采集自東方蜜蜂研究所實驗蜂場周圍的24 種有花植物中，有10 種有花植物的花組織中存在DWV，有4 種有花植物的葉組織中存在DWV，有3 種有花植物的莖組織中檢測到DWV。其中，三角梅、紫藤、迎春的花、莖、葉組織中均檢出DWV。所有檢出DWV的有花植物中花組織的DWV 檢出率最高（表2-2）。另外，對24 種有花植物進行BQCV 的流行病學(xué)調(diào)查顯示，僅在迎春花組織中檢出 BQCV， 且檢出率較低 6.7%（2/30）。

表2-2 有花植物中七種蜜蜂病毒病流行病學(xué)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

病毒病是人類和動植物共同關(guān)注的全球性問題[126]。蜜蜂的病毒圈也十分多樣化，其中蜜蜂殘翅病毒可以在多個宿主中檢測到[127]，并形成了全球范圍的流行。病毒是專性寄生生物，其復(fù)制周期的所有步驟都依賴于宿主，一旦復(fù)制完成并且宿主的資源耗盡，病毒就必須克服跨越物理和空間障礙才能到達并入侵另一個宿主的生物防御系統(tǒng)[11]。本試驗中東、西方蜜蜂樣品中均發(fā)現(xiàn)BQCV、DWV 和SBV 三種病毒，除此以外，西方蜜蜂樣品中還發(fā)現(xiàn)了IAPV。幾種病毒中的DWV 檢出率都最高，其次是BQCV。這與蜂群內(nèi)多種病毒共同感染，且DWV 是最流行的病毒[12]的結(jié)論一致。此外，西方蜜蜂樣品中的病毒陽性檢出率普遍高于東方蜜蜂，這與前人的研究成果一致[13]。從結(jié)果來看，實驗蜂場DWV 感染率相對較高，因此，提高對DWV 的認(rèn)識，加強監(jiān)測和防控迫在眉睫。

本試驗結(jié)果顯示，蜂場附近的部分有花植物中僅存在DWV 和BQCV 兩種病毒，再次驗證了蜜蜂病毒具備強大的適應(yīng)能力；其中，BQCV 的檢出率較低，而DWV 廣泛地存活于有花植物的花組織中（10/24），這些有花植物涵蓋了喬木、灌木、蔓生草本、草本、藤本和草質(zhì)藤本[14-17]；相比較而言，植物的花組織最容易檢出DWV，莖組織最難檢出DWV，這在一定程度上支持了DWV 可以通過共享花卉資源進行蜂群的種間、種內(nèi)及跨物種傳播[18-20]這一假設(shè)，但莖組織檢出DWV 也為傳播途徑研究提供了新方向。另一方面，因三角梅無蜜無粉，迎春有粉無蜜，而紫藤屬于蜜粉源植物，表明蜜粉源植物可能因其長期的協(xié)同進化而表現(xiàn)出對蜜蜂病毒的較強抗性。本次試驗研究結(jié)果為蜜蜂病毒病的蜜源植物至蜜蜂寄主傳播途徑研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。