徐陽，辛嘉英，2*，王雨晴，王貴儒，尹一

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點(diǎn)實驗室，甘肅 蘭州 730000）

過氧化鈣（CaO2）是一種常見的無機(jī)化合物，為淡黃色粉末，難溶于水，易溶于乙醚等有機(jī)溶劑，是常見的化工原料，在食品開發(fā)、加工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在食品工業(yè)領(lǐng)域還可用作小麥粉增白劑、殺菌劑等[1-3]，天然小麥粉一般呈乳白色或黃色，且不易加工成面團(tuán)[4]，而將過氧化鈣添加到小麥粉中，既可以提高面筋韌性，還可以有效提高小麥粉的色澤，由于CaO2作為小麥粉添加劑會對人體健康構(gòu)成潛在危險，如食用過量會刺激腸道、誘發(fā)癌癥等[5]，自2011 年，我國衛(wèi)生部門已經(jīng)全面禁止在小麥粉中添加過氧化鈣[6]，為了防止一些生產(chǎn)廠商以此獲得利益，進(jìn)一步保障食品安全，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，小麥粉中過氧化鈣的檢測受到越來越多的關(guān)注及重視。常用的過氧化鈣檢測方法有物理法、化學(xué)法等[7-8]，但這些方法在操作時通常會產(chǎn)生無法避免的誤差，導(dǎo)致試驗結(jié)果誤差較大、準(zhǔn)確度低。因此，酶法檢測被廣泛開發(fā)。其中，過氧化物酶（peroxidase，POD）及其模擬酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品和生物領(lǐng)域[9-10]，應(yīng)用前景良好。

張玉榮等[11]提出酶法檢測小麥粉中CaO2含量，利用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）為生物催化劑，HRP 是常見的天然過氧化物酶，CaO2與硫酸反應(yīng)可生成H2O2，在碘化鉀（KI）的存在下，HRP 可催化H2O2氧化季胺，使其快速生成一種黃色物質(zhì)，從而對小麥粉中CaO2進(jìn)行定量分析。此方法具有較高的精密度、準(zhǔn)確度及高靈敏度，但HRP 是天然過氧化物酶，易受外界環(huán)境因素如溫度、pH 值的影響。在一般的酶催化反應(yīng)進(jìn)程中，溫度越高，反應(yīng)速度越快，當(dāng)溫度過高時，天然酶會失活，降低反應(yīng)溫度，反應(yīng)速度也會下降。在上述反應(yīng)體系中，酸化后的溶液需將溶液pH 值調(diào)節(jié)至中性，在中性條件下，檢測才能進(jìn)行，這導(dǎo)致試驗操作更加繁瑣、效率降低，從而存在一定局限性[12]。因此，使用穩(wěn)定性好、溫度和pH 值范圍廣的模擬酶替代天然酶，成為實現(xiàn)酶法檢測小麥粉中CaO2的關(guān)鍵。

甲烷氧化菌是一類以甲烷為能量來源及碳源的細(xì)菌，甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb）是一種由甲烷氧化菌發(fā)酵分泌的菌素，具有抗氧化、抗菌作用[13-15]。它是一種小分子熒光肽，對銅有很強(qiáng)的親和力[16]，Mb可以通過其來自2 個惡唑酮環(huán)的氮和來自2 個烯硫醇基團(tuán)的硫來配位單個Cu（II）離子[17]，且與Cu 配位后具有良好的過氧化物酶活性，配位后的Mb-Cu 能在更寬的溫度和pH 值范圍內(nèi)催化反應(yīng)[18]。Xin 等[19]基于在Mb-Cu 的催化下，H2O2能快速氧化苯酚和4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine，4-AAP）生成紅色醌亞胺的原理，建立了一種新的催化體系檢測小麥粉中CaO2。Mb 非常穩(wěn)定，在酸性介質(zhì)及50 ℃下也能保持良好的催化活性[20]。因此試驗過程可省略調(diào)節(jié)pH 值這一步驟。此條件下，Mb 表現(xiàn)出較高的POD 活性，此檢測方法速度更快、操作過程更簡單，并且試驗結(jié)果良好、準(zhǔn)確度高，已成功應(yīng)用于小麥粉中過氧化鈣的測定。季胺是一類可測定多種物質(zhì)的靈敏試劑，可作為底物被過氧化氫氧化從而顯色，并且可很好地溶于微酸性水溶液[21-22]，由于過氧化鈣在酸性介質(zhì)中可生成H2O2，因此季胺作為底物可更好地應(yīng)用于小麥粉中過氧化鈣的檢測。

基于Mb-Cu 的良好POD 活性，本文建立了Mb-Cu-KI-季胺新體系，利用Mb-Cu 催化過氧化氫氧化季胺顯色的原理檢測小麥粉中CaO2含量并優(yōu)化反應(yīng)條件，方法操作簡單、速度快，可應(yīng)用于小麥粉CaO2的檢測，為小麥粉中過氧化鈣的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉：市售；甲烷氧化菌：清華大學(xué)環(huán)境生物技術(shù)實驗室提供；甲烷（99.99%）：哈爾濱黎明氣體有限公司；甲醇、季胺（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；大孔樹脂：美國Supelco 公司；五水合硫酸銅（分析純）：汕頭市西隴化工工廠有限公司；過氧化鈣（75%）：上虞潔華化工有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）：蘇州力坤精細(xì)化工有限公司；碘化鉀（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；濃硫酸（分析純）：北京化學(xué)試劑公司；試驗用水均為二級水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550 紫外-可見分光光度計：日本島津公司；FDU-1200 冷凍干燥機(jī)：東京理化器械公司；HL-2S 恒流泵：上海滬西分析儀器廠；HDL 組合式紫外檢測器：上海金達(dá)公司；BLBI0-HYG-FJ2 生物反應(yīng)器搖床：上海百侖生物科技有限公司；RV8V 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA 公司；BCD-215GM 冰箱：合肥美的電冰箱有限公司；DF-101S 磁力攪拌器：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；HWS24 電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；800XL 顏色掃描器：上海中晶科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 甲烷氧化菌素的分離與純化

參考文獻(xiàn)[13]的方法，配制無機(jī)鹽（nitrate mineral salt，NMS）培養(yǎng)基，以甲基彎菌（Methylosinus trichosporium）OB3b 為菌種，使用NMS 培養(yǎng)基對其進(jìn)行121 ℃高溫滅菌、換氣，時間為5～6 d，將得到的發(fā)酵液離心30 min（8 000 r/min，4 ℃），離心后所得到的菌液上清液經(jīng)已活化的大孔樹脂吸附，在組合式紫外檢測器的檢測下，用60%甲醇溶液對樹脂進(jìn)行洗脫，獲得Mb，通過34 ℃、130 r/min 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，液體狀Mb 再經(jīng)過冷凍干燥后得到粉末狀Mb，放入-30 ℃冰箱中備用。

1.3.2 Mb-Cu 的制備

將凍干后的Mb 配制成各個濃度的溶液置于比色皿中，放入紫外-可見分光光度計，使用微量進(jìn)樣器向比色皿中每隔30 s 加入5 μL 濃度為10 nmol/L 的CuSO4溶液，觀察紫外光譜曲線，當(dāng)曲線逐漸趨于一致時，減少CuSO4溶液的加入量，改為加入2 μL，直至曲線峰型不再變化，Mb-Cu 制備完成。

1.3.3 過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱量1.55 g 過氧化鈣，加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的稀硫酸，磁力攪拌4 min，轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶，蒸餾水定容，再稀釋100 倍，獲得0.1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 檢測波長的確定

取3 只10 mL 比色管，分別加入0、0.5、1.0 mL CaO2標(biāo)準(zhǔn)使用液，再依次加入100 μL 季胺溶液、15 μL KI溶液、2 mL 磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、Mb-Cu 溶液，蒸餾水定容至10 mL，置于50 ℃恒溫水浴中10 min，進(jìn)行紫外全光譜掃描。

1.3.5 反應(yīng)條件的選擇

以Mb-Cu 濃度（1.5×10-5～7.5×10-5mol/L）、季胺用量（0～200 μL）、KI 用量（0～30 μL）、反應(yīng)溫度（30～70 ℃）、體系pH 值（1～5）、反應(yīng)時間（0～20 min）為變量，探討其對催化反應(yīng)體系顯色的影響。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取標(biāo)準(zhǔn)工作液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL 加入到10 mL 比色管中，再分別加入0.02 mol/L 季胺溶液60 μL、0.05 mol/L KI 溶液12 μL、50 μL Mb-Cu 溶液以及2 mL PBS 緩沖溶液（0.2 mol/L，pH4.7），蒸餾水定容至10 mL。50 ℃恒溫水浴10 min，于462 nm 處測定其吸光度，以過氧化鈣濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 精密度與準(zhǔn)確度的測定

準(zhǔn)確稱量1 g 小麥粉，加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)為1%的稀硫酸，攪拌均勻后，加蒸餾水定容至100 mL，混合均勻后轉(zhuǎn)入離心管，以5 000 r/min 離心10 min，離心結(jié)束后吸取上清液8 mL，依次加入100 μL 季胺、15 μL KI、50 μL Mb-Cu 溶液、2 mL PBS 緩沖溶液，再于50 ℃水浴中反應(yīng)10 min，于462 nm 處測定其吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比可讀出過氧化鈣的含量。加標(biāo)濃度為100、200、400 mg/kg，試驗以不添加過氧化鈣的小麥粉作為空白樣品，試驗重復(fù)6 次，測定方法的精密度與準(zhǔn)確度。過氧化鈣含量的計算公式如下。

式中：C 為小麥粉中過氧化鈣含量，μg/g；c 為標(biāo)準(zhǔn)曲線中過氧化鈣的濃度，mg/L；m 為樣品質(zhì)量，g；10 為定容體積，L；100 為稀釋倍數(shù)。

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制備

在最佳條件下進(jìn)行顯色后，使用顏色掃描器收集顯色后的圖像，使用Photoshop 將顏色按照漸變規(guī)律合成圖像，制備過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)比色卡。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗均重復(fù)6 次，采用SPSS 19.0 進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)處理分析，采用Origin 8.5 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mb 的表征

Mb 呈淡黃色液體，其在紫外-可見分光光度計的檢測下吸收光譜如圖1 所示。

由圖1 可知，在258、302、338、398 nm 四處有明顯吸收峰，表明Mb 結(jié)構(gòu)完整。

2.2 Mb-Cu 的結(jié)合

圖2 為Mb-Cu 配位的紫外-可見吸收光譜。

圖2 Mb-Cu 配位的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-visible absorption spectrum of Mb-Cu complex

由圖2 可知，在紫外-可見分光光度計的檢測下，隨著Cu2+的加入，在338 nm 和398 nm 處的吸收峰值逐漸下降，說明Cu2+分別與Mb 中的4-羥基-5-硫酰咪（4-hydroxy-5-thioimidazole，HTI）和4-硫酰-5-羥基咪唑（4-thioyl-5-hydroxyimidazole，THI）結(jié)合，398 nm處吸收峰值降低說明Cu2+與THI 中的S 原子配位；338 nm 處吸收峰值降低表明Cu2+與HTI 基團(tuán)中的S原子配位。當(dāng)338 nm 和398 nm 處的吸收峰值下降停止時，表明配位結(jié)束，Mb 與Cu 配位完成，結(jié)合為Mb-Cu。

2.3 反應(yīng)機(jī)理

CaO2與硫酸反應(yīng)生成過氧化氫，在Mb-Cu 的催化下，以KI 為增敏劑可加快反應(yīng)速度，提高反應(yīng)效率，季胺作為反應(yīng)底物被氧化并伴有顯黃色反應(yīng)，試驗反應(yīng)方程式如下。

總反應(yīng)（1）+（2）+（3）+（4）+（5）為：

2.4 檢測波長的選擇

圖3 為紫外光譜吸收曲線。

圖3 紫外光譜吸收曲線Fig.3 UV absorption spectra of the color system

如圖3 所示，不含CaO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的曲線趨勢平穩(wěn)，無吸收峰出現(xiàn)，而含有CaO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的2 條曲線在462 nm 處均出現(xiàn)較強(qiáng)吸收峰，且隨著CaO2標(biāo)準(zhǔn)溶液含量的增加，其吸光度也隨之增大，說明在462 nm 處該顯色體系具有較高靈敏度，因此，測定波長為462 nm。

2.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.5.1 Mb-Cu 濃度對顯色的影響

Mb-Cu 濃度對反應(yīng)顯色的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 Mb-Cu 濃度對顯色的影響Fig.4 Influence of the Mb-Cu concentration on the absorbancy

由圖4 可知，當(dāng)Mb-Cu 濃度在0～4.5×10-5mol/L時，吸光度隨著Mb-Cu 濃度的增加而增大，說明Mb-Cu 濃度越高，酶促反應(yīng)進(jìn)行的越快，當(dāng)Mb-Cu 濃度超過4.5×10-5mol/L 時，吸光度呈下降趨勢，說明此時酶促反應(yīng)已經(jīng)結(jié)束，當(dāng)Mb-Cu 的濃度為4.5×10-5mol/L時，體系吸光度最高，因此Mb-Cu 的最適濃度為4.5×10-5mol/L。

2.5.2 季胺用量對顯色的影響

季胺用量對顯色的影響如圖5 所示。

圖5 季胺用量對顯色的影響Fig.5 Influence of the quaternary ammonium dosage on the absorbancy

季胺作為反應(yīng)底物，其用量在一定程度上會影響反應(yīng)顯色，如圖5 所示，在季胺用量為0～60 μL 時，吸光度迅速增加，此時，季胺用量與吸光度成正比，吸光度隨底物的增加而增大，當(dāng)季胺用量超過60 μL 時，吸光度呈下降趨勢，此時，酶以及增敏劑消耗完畢，底物過多會造成吸光度降低，因此，試驗選取季胺用量為60 μL。

2.5.3 KI 用量對顯色的影響

KI 用量對顯色的影響如圖6 所示。

圖6 KI 用量對顯色的影響Fig.6 Influence of the KI dosage on the absorbancy

KI 在體系中為增敏劑，可增加體系靈敏度，提高反應(yīng)速度，如圖6 所示，在0～12 μL 時，吸光度快速增加，說明在此區(qū)間內(nèi)，KI 與反應(yīng)速度成正比；在12～18 μL時，體系吸光度達(dá)到較高水平，此時反應(yīng)已達(dá)到飽和；超過18 μL 時，吸光度逐漸降低，因此試驗選取KI 用量為12 μL。

2.5.4 反應(yīng)溫度對顯色的影響

反應(yīng)溫度對顯色的影響如圖7 所示。

圖7 反應(yīng)溫度對顯色的影響Fig.7 Influence of reaction temperature on the absorbancy

酶催化反應(yīng)中，反應(yīng)溫度對酶催化速度產(chǎn)生重要影響，模擬酶通?？梢酝ㄟ^提高反應(yīng)溫度加快反應(yīng)速度，比天然酶更耐高溫。由圖7 可知，吸光度隨著溫度的升高而增加，50 ℃時到達(dá)最高，且溫度過高M(jìn)b-Cu可能發(fā)生部分變性，最終導(dǎo)致失活，高溫也易發(fā)生副反應(yīng)，因此試驗選擇50 ℃作為反應(yīng)溫度。

2.5.5 pH 值對顯色的影響

pH 值對顯色的影響如圖8 所示。

圖8 pH 值對顯色的影響Fig.8 Influence of pH on the absorbancy

由圖8 可知，催化反應(yīng)需要在適宜pH 值環(huán)境下進(jìn)行，本試驗選取pH 值范圍為1～5，采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值，結(jié)果表明，pH 值對顯色體系影響較小，可忽略不計，說明Mb-Cu 模擬酶不易受環(huán)境因素影響。因此，模擬酶催化反應(yīng)可省略調(diào)節(jié)pH 值這一過程，使試驗更加簡便。

2.5.6 反應(yīng)時間對顯色的影響

反應(yīng)時間對顯色的影響如圖9 所示。

圖9 反應(yīng)時間對顯色的影響Fig.9 Influence of reaction time on the absorbancy

由圖9 可知，體系吸光度在反應(yīng)10 min 時達(dá)到最大，10 min 后幾乎不變，因此反應(yīng)時間為10 min。

2.5.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在最佳反應(yīng)條件下，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖10 所示。

圖10 CaO2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10 CaO2 standard curve

由圖10 可知，體系中的CaO2濃度為0～10 mg/L時，CaO2濃度與462 nm 處的吸光度呈正相關(guān)。線性方程為y=0.078 1x+0.019 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6。計算得出標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.75×10-4，檢出限（limit of detection，LOD）為1.82×10-2mg/L（相當(dāng)于2.25 mg/kg 小麥粉）。

2.5.8 精密度與準(zhǔn)確度

加標(biāo)回收結(jié)果如表1 所示。

表1 加標(biāo)回收結(jié)果（n=6）Table 1 Results of spike recovery（n=6）

由表1 可知，平均加標(biāo)回收率為99.21%～100.35%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.31%～1.22%，試驗結(jié)果表明上述檢測小麥粉中過氧化鈣含量的方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

2.5.9 標(biāo)準(zhǔn)比色卡

過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)比色卡如圖11 所示。根據(jù)反應(yīng)后的顏色變化，可直接將過氧化鈣含量與標(biāo)準(zhǔn)色卡進(jìn)行比較，實現(xiàn)過氧化鈣含量的可視化檢測。

圖11 CaO2 標(biāo)準(zhǔn)比色卡Fig.11 CaO2 standard colorimetric card

3 結(jié)論

本文建立并優(yōu)化了甲烷氧化菌素模擬酶催化顯色法測定小麥粉中過氧化鈣的方法，根據(jù)過氧化鈣與硫酸反應(yīng)生成過氧化氫的原理，利用Mb-Cu 模擬過氧化物酶催化過氧化氫，并在碘化鉀存在的條件下氧化季胺顯色，建立了對小麥粉中過氧化鈣含量測定的目視比色法，本方法可操作性強(qiáng)、操作步驟簡單、結(jié)果可靠，適用于過氧化鈣的檢測。