周雅情，王瑩，王昱灃

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

牛排菇（Fistulln hepatica），又名褐蘑菇、洋松茸、波多黎各菌、牛舌菌、豬肝菌，屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬，是雙孢蘑菇的近緣種[1]。其菌肉厚實(shí)緊密，口味獨(dú)特，暢銷歐美諸多國家，后被我國長江中下游地區(qū)引進(jìn)且成功馴化栽培。牛排菇含有豐富的蛋白質(zhì)，其脂肪和膽固醇含量較低[2]。牛排菇可增加礦物質(zhì)含量[3]，降低肌肉蛋白質(zhì)的損失、抑制胸腺萎縮和減少類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[4]。此外，研究者發(fā)現(xiàn)牛排菇不僅能預(yù)防腫瘤[5]，還能通過生成白細(xì)胞介素來調(diào)節(jié)腸道免疫力[6]。牛排菇的營養(yǎng)功能和潛在的多種藥用價(jià)值賦予其廣闊的市場開發(fā)前景。

食用菌源多肽的研究近年來得到重視，相關(guān)多肽的提取研究和功能性價(jià)值被不斷報(bào)道，如利用靈芝水解物可分離出抗氧化肽[7]，從羊肚菌中可發(fā)現(xiàn)一種具有腫瘤預(yù)防功能的新型多肽等[8]。食用菌源多肽不僅分子量小容易被人體吸收，且其食用安全，用于疾病預(yù)防和治療時，對人體沒有副作用，可以替代很多藥物用于人體治療[9]。但牛排菇多肽方面的研究目前鮮有報(bào)道，僅見劉瑩[10]利用耗時較長的水提醇沉法獲得該多肽。關(guān)于多肽的提取主要有酶解法、發(fā)酵法、化學(xué)合成法[11]。發(fā)酵法是利用微生物在適宜條件下發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶將原料代謝分解成多肽等小分子，此方法成本低但是過程不易于控制，生成的產(chǎn)物具有不確定性[12]?；瘜W(xué)合成法則對技術(shù)要求高，工藝繁瑣，多不被采用。酶解法在食品和生物醫(yī)藥業(yè)中應(yīng)用性很高，因?yàn)槊附獾倪^程中不會加入有機(jī)溶劑，也不會產(chǎn)生對人體有毒害的物質(zhì)，整個反應(yīng)體系便于調(diào)控[13]。因此本研究擬以珍稀食用菌——牛排菇為原料，采用酶解法進(jìn)行多肽提取，通過對反應(yīng)時間、底物濃度、pH 值、溫度、加酶量進(jìn)行考察，利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化多肽提取工藝，以期為后續(xù)該多肽的活性研究及相關(guān)功能產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛排菇：市售；氫氧化鈉、甲醛（均為分析純）：廣東光華科技股份有限公司；鹽酸（分析純）：南京化學(xué)試劑有限公司；酸性蛋白酶（10 000 U/g）、堿性蛋白酶（20 000 U/g）、胃蛋白酶（3 000 U/g）、木瓜蛋白酶（80 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；胰酶（4 000 U/g）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水槽（DK-8D 型）：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電子天平（CP124C）、pH 計(jì)（STARTER 3100）：奧豪斯儀器（上海）有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9240MBE）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；離心機(jī)（TDZ5-WS）：長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；高速多功能粉碎機(jī)（RHP-400）：浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛排菇多肽提取工藝

將牛排菇清洗干凈后在50 ℃下烘干，粉碎，過100 目篩。稱量1.00 g 蘑菇粉，根據(jù)不同底物濃度加入水后混勻，放置在指定溫度的水浴鍋中預(yù)熱10 min，用1 mol/L NaOH 和HCl 溶液調(diào)節(jié)至適宜pH 值，然后根據(jù)一定的加酶量加入對應(yīng)的蛋白酶，再次混勻后放置水浴鍋中水浴一定時間。水浴結(jié)束后在100 ℃下滅酶10 min，冷卻后在4 000 r/min 下離心20 min，取上清液得粗多肽[14]。

1.3.2 蛋白酶篩選

將酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶5 種酶分別在各自的最適pH 值和最適溫度下對牛排菇進(jìn)行酶解，各自最適條件見表1[15]。根據(jù)1.3.1步驟，加酶量設(shè)為3 000 U/g，每隔1 h 測定不同蛋白酶對酶解過程中水解度的影響，持續(xù)6 h，篩選出最佳蛋白酶[16-17]。

表1 不同蛋白酶最適的pH 值和溫度Table 1 Optimal pH value and temperature of different proteases

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 反應(yīng)時間對酶解效果的影響

固定底物濃度為4%，溫度為45 ℃，pH 值為7，加酶量3 000 U/g，分別設(shè)置反應(yīng)時間為1、2、3、4、5、6 h，以水解度為指標(biāo)，考察不同反應(yīng)時間對水解度的影響。

1.3.3.2 底物濃度對酶解效果的影響

固定pH 值為8，溫度為45 ℃，反應(yīng)時間4 h，加酶量3 000 U/g，分別設(shè)置底物濃度為3%、4%、5%、6%、7%，以水解度為指標(biāo)，考察不同底物濃度對水解度的影響。

1.3.3.3 pH 值對酶解效果的影響

當(dāng)反應(yīng)條件設(shè)為底物濃度為4%，溫度為45 ℃，反應(yīng)時間4 h，加酶量3 000 U/g，分別設(shè)置pH 值為6、7、8、9、10，以水解度為指標(biāo)，考察不同pH 值對水解度的影響。

1.3.3.4 溫度對酶解效果的影響

當(dāng)反應(yīng)條件設(shè)為底物濃度為4%，pH 值為7，反應(yīng)時間4 h，加酶量3 000 U/g，分別設(shè)置溫度為40、45、50、55、60 ℃，以水解度為指標(biāo)，考察不同溫度對水解度的影響。

1.3.3.5 加酶量對酶解效果的影響

當(dāng)反應(yīng)條件設(shè)為底物濃度為4%，pH 值為7，溫度為45 ℃，反應(yīng)時間4 h，分別設(shè)置加酶量為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g，以水解度為指標(biāo)，考察不同加酶量對水解度的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對水解度影響較大的反應(yīng)時間、底物濃度、pH 值、加酶量4 個因素為自變量，以水解度為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5 總氮量測定

根據(jù)GB 5009.5—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法測定牛排菇中總氮量。

1.3.6 氨基態(tài)氮含量測定

取5 mL 酶解液，加入60 mL 去CO2水（蒸餾水超聲20 min），混勻，用0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至8.2，加入20 mL 中性甲醛溶液（取50 mL 甲醛加入3 mL 0.5%酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH 滴加至顏色變?yōu)槲⒎奂t色，現(xiàn)配現(xiàn)用），用0.1 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至9.2，記錄加入甲醛后所消耗的氫氧化鈉體積?？瞻讓φ沼?5 mL 水重復(fù)上述試驗(yàn)，記錄加入甲醛后消耗的體積[18]。氨基態(tài)氮含量計(jì)算公式如下[19]。

式中：M 為氨基態(tài)氮含量，mg/mL；C 為氫氧化鈉濃度，mol/L；V1為空白對照加入甲醛后消耗氫氧化鈉的體積，mL；V2為樣液加入甲醛后消耗氫氧化鈉的體積，mL；V3為所取樣液體積mL；14 為氮元素的相對分子質(zhì)量，g/mol。

1.3.7 水解度測定

水解度計(jì)算公式如下。

式中：h 為水解度，%；A 為氨基態(tài)氮含量，mg/mL；B 為總氮含量，mg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，試驗(yàn)結(jié)果利用SAS V8 中單因素方差分析Duncan 法進(jìn)行顯著性分析，并用Origin 8.5 軟件作圖。通過Design-Expert 8.0.6 設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，并對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及二次多項(xiàng)式回歸擬合，當(dāng)P＜0.05 時，結(jié)果具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶篩選

胰酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶5 種酶的水解度結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同種類酶對酶解程度的影響Fig.1 Effects of different kinds of enzymes on the degree of enzymatic hydrolysis

由圖1 可知，在同一時間下，幾種酶對牛排菇酶解的程度依次為胰酶＞木瓜蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胃蛋白酶＞酸性蛋白酶。因?yàn)椴煌傅拿盖形稽c(diǎn)不同，酶解效果不一樣，結(jié)果顯示胰酶水解度明顯高于其他4 種酶，所以選擇胰酶對牛排菇進(jìn)行酶解。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)時間對水解度的影響

不同反應(yīng)時間對酶解效果的影響如圖2 所示。

圖2 不同反應(yīng)時間對酶解效果的影響Fig.2 Effects of different reaction times on enzymatic hydrolysis

由圖2 可知，隨著反應(yīng)時間延長，水解度增加，到達(dá)5 h 后雖有所下降，但是并不顯著（P＞0.05）。因?yàn)槊附鈺r間過短，酶與底物的接觸時間不足，影響酶解效果，當(dāng)酶解時間過長，則酶解過度，使多肽分解成小分子氨基酸。又因?yàn)? h 與5 h 的水解度并沒有顯著差異（P＞0.05），從節(jié)能節(jié)時角度考慮，4 h 可作為酶解時間的中心點(diǎn)。

2.2.2 底物濃度對水解度的影響

不同底物濃度對酶解效果的影響如圖3 所示。

圖3 不同底物濃度對酶解效果的影響Fig.3 Effects of substrate concentrations on enzymatic hydrolysis

由圖3 可知，隨著底物濃度增加，水解度先增加后降低，在底物濃度為4%時水解度達(dá)到最大。當(dāng)?shù)孜餄舛忍髸r，酶與底物不能充分接觸，導(dǎo)致反應(yīng)不完全，而當(dāng)?shù)孜餄舛忍r，酶的濃度被稀釋，影響了酶解反應(yīng)的進(jìn)行[20-21]。因此選擇3%、4%和5%作為底物濃度的3 個水平進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 pH 值對水解度的影響

不同pH 值對酶解效果的影響如圖4 所示。

圖4 不同pH 值對酶解效果的影響Fig.4 Effects of different pH values on enzymatic hydrolysis

由圖4 可知，水解度隨著pH 值的增大先升高后降低。每種酶都有最適pH 值范圍，過高或過低都會直接影響酶活，當(dāng)pH 值大于7 時，酶的生物活性下降，其酶解能力也隨之下降[22]。所以選擇6、7、8 作為pH 值的3 個水平進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.4 溫度對水解度的影響

不同溫度對酶解效果的影響如圖5 所示。

圖5 不同溫度對酶解效果的影響Fig.5 Effects of different reaction temperatures on enzymatic hydrolysis

由圖5 可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，其水解度先升高后降低，在45 ℃達(dá)到最高點(diǎn)。因?yàn)闇囟冗m當(dāng)上升，可以增加酶活力，提高酶促反應(yīng)速率，但是溫度過高會破壞酶的結(jié)構(gòu)，使得酶活性降低[23]。因此選擇45 ℃作為后續(xù)試驗(yàn)的最適溫度，不再對反應(yīng)溫度進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.5 加酶量對水解度的影響

不同加酶量對酶解效果的影響如圖6 所示。

圖6 加酶量對酶解效果的影響Fig.6 Effects of different enzyme additions on enzymatic hydrolysis

由圖6 可知，隨著加酶量的增加，底物水解度不斷升高，超過8 000 U/g 后增加不顯著（P＞0.05），這是因?yàn)殡S著加酶量增加，酶與底物結(jié)合位點(diǎn)不斷增加，水解程度不斷加大，但是當(dāng)加酶量達(dá)到一定程度，結(jié)合位點(diǎn)趨向飽和，繼續(xù)提高加酶量也不會提升水解效果[24]。又因?yàn)榧用噶吭? 000 U/g 與10 000 U/g 時不顯著（P＞0.05），所以選擇加酶量6 000、8 000、10 000 U/g 3 個水平進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案和結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface experimental design

采用Design-Expert.8.0.6 軟件得到響應(yīng)值與各影響因素之間的二元多項(xiàng)式回歸方程：水解度=57.41+1.44A-2.11B+2.55C+1.31D+0.13AB+0.11AC-1.21AD-0.088BC-0.13BD+0.66CD+0.91A2-0.053B2+0.092C2-0.97D2。

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Continue table 3 Response surface experimental design and results

通過表4 結(jié)果可知，該模型P＜0.000 1＜0.01 說明該響應(yīng)面擬合模型極顯著，可以較好地反映試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響，失擬項(xiàng)P=0.363 7，不顯著（P＞0.05），說明回歸模型擬合程度良好，非試驗(yàn)因素對試驗(yàn)結(jié)果影響較小。決定系數(shù)R2值越接近1，說明模型的預(yù)測值與實(shí)際值越接近，該模型R2=0.982 3，矯正后模型決定系數(shù)R2Adj=0.964 5，說明該回歸方程擬合度較好，可以用此模型分析和預(yù)測各因素對水解度的影響。由F值得到各因素對水解度影響的主次順序?yàn)镃>B>A>D，所以對牛排菇多肽的水解度影響最大的是加酶量，然后是底物濃度、反應(yīng)時間，最后是pH 值。由回歸方程和方差分析可知，模型中各因素對水解度的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；對于交互項(xiàng)因素而言，AD 交互作用極顯著（P＜0.01）、CD 因素的交互作用顯著（P＜0.05）。對于二次項(xiàng)因素而言，A2、D2因素的交互作用均極顯著（P＜0.01）。

2.3.2 工藝優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定提取的最佳工藝條件，利用Design-Expert 8.0.6 分析，最終分析得到牛排菇多肽的最佳提取工藝條件為反應(yīng)時間5 h、底物濃度5%、酶解pH8、加酶（胰酶）量9 998.11 U/g、多肽水解度的預(yù)測值為59.97%?？紤]實(shí)際情況，調(diào)整提取工藝為反應(yīng)時間5 h、底物濃度5%、酶解pH8、加酶（胰酶）量10 000 U/g。為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果與真實(shí)情況的一致性和可靠性，進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，在最佳工藝條件下，水解度實(shí)測值為59.17%，與預(yù)測值相差0.8%，該響應(yīng)面法優(yōu)化所得的最佳工藝條件有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究以牛排菇為原料，利用胰酶進(jìn)行酶解獲得其多肽，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對酶解工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到最優(yōu)條件：反應(yīng)時間5 h、底物濃度5%、酶解pH8、加酶（胰酶）量10 000 U/g。在最優(yōu)工藝條件下牛排菇多肽的水解度與理論值接近，該響應(yīng)面模型準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本文對牛排菇多肽的深入研究提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，后續(xù)將進(jìn)而探究牛排菇多肽的特性和生物活性。