陳 婕，張紅梅，譚春艷（遂寧市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川遂寧 629000）

人體腸道內(nèi)存在著大量的細(xì)菌，在生理狀態(tài)下，腸道菌群存在“自我穩(wěn)態(tài)”，維持著人體的健康。依據(jù)自然屬性分類，人類腸道菌群已經(jīng)鑒定出細(xì)菌的幾十個(gè)門，其中主要的腸道菌可以歸屬為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和放線菌門[1]。在危重疾病狀態(tài)下已經(jīng)抗生素的使用，腸道穩(wěn)態(tài)被打破，導(dǎo)致腸道菌群在種類、數(shù)量、比例、定位等多個(gè)方面發(fā)生改變。膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)室（intensive care unit，ICU）中最常見(jiàn)的疾病，是機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)所引起器官功能障礙[2]。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有研究顯示，腸道菌群紊亂可能是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生及發(fā)展的重要因素[3]。然而，目前關(guān)于膿毒癥患者腸道菌群紊亂的特點(diǎn)尚未研究清楚。D-乳酸主要來(lái)源于人體丙酮醛代謝，當(dāng)腸道屏障功能受損時(shí)，D-乳酸將被大量釋放至外周血，是提示腸道屏障功能受損的常見(jiàn)標(biāo)志物[4]?？扇苄运铇蛹?xì)胞觸發(fā)性受體（soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1，sTREM1）是新型的炎癥標(biāo)志物，單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）屬于趨化因子家族，在細(xì)胞浸潤(rùn)及遷移中發(fā)揮重要作用[5]。目前關(guān)于腸道菌群紊亂與腸道屏障破壞、炎癥反應(yīng)之間是否存在聯(lián)系仍未可知。本研究旨在通過(guò)分析膿毒癥患者腸道菌群生態(tài)特征及其與血清D-乳酸、sTREM1 及MCP-1之間的關(guān)系，對(duì)膿毒癥可能的致病機(jī)制進(jìn)行探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 行前瞻性研究，將遂寧市中心醫(yī)院2019.06～2022.06 間接收的46 例膿毒癥患者納為膿毒癥組，同期45 例入住ICU 但無(wú)膿毒癥者納為非膿毒癥組，50 例健康志愿者納為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有被研究者年齡18～45 歲；②膿毒癥患者符合Sepsis3.0 中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；③膿毒癥及非膿毒癥患者入住ICU 時(shí)間≥2 天。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)肛周感染者及腸造瘺者；②并發(fā)慢性胃腸道疾病者；③既往有消化道疾病及手術(shù)史者；④入組前三個(gè)月前服用益生菌制劑、腸道營(yíng)養(yǎng)制劑者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與者均知情且簽署同意書(shū)。病例資料：膿毒癥組中男性26 例，女性20例，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI） 20～26（23.69±3.15）kg/m2，年齡26～44（36.69±4.15）歲；原發(fā)?。汉粑到y(tǒng)疾病20 例，心血管疾病17例，神經(jīng)系統(tǒng)疾病5 例，其他4 例。非膿毒癥組中男性27 例，女性18 例，BMI 20～25（24.15±3.41）kg/m2，年齡25～45（37.85±3.79）歲；原發(fā)?。汉粑到y(tǒng)疾病21 例，心血管疾病15 例，神經(jīng)系統(tǒng)疾6 例，其他3 例。對(duì)照組中男性28 例，女性22 例，BMI 19～26（24.63±3.58）kg/m2，年齡26～44（36.94±4.43）歲，兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2/F=0.179,0.372,0.920,0.990,均P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 HiSeq2500 PE250（Illumina公司，美國(guó)），全自動(dòng)生化分析儀（上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，型號(hào)：卓越480），sTREM-1 試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司）；MCP-1 試劑盒（美國(guó)R&D 公司）。

1.3 方法

1.3.1 腸道菌群分析：①糞便標(biāo)本采集：膿毒癥組及非膿毒癥組糞便標(biāo)本采集時(shí)間為入住ICU 后第一天，患者自主排便或灌腸后，使用采樣勺將患者新鮮糞便深處取材，取材后將標(biāo)本迅速放置標(biāo)本盒內(nèi)送檢。對(duì)照組則于入組后采集新鮮糞便標(biāo)本。②腸道菌群檢測(cè)：16S rRNA 基因序列分析技術(shù)檢測(cè)被研究者腸道菌群情況。⑴提取糞便樣本總DNA：以CTAB 法提取樣本DNA，瓊脂凝膠電泳法檢測(cè)DNA 濃度與純度。⑵PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物純化：以稀釋后DNA 為模板，行優(yōu)勢(shì)菌16S rRNA 基因V3，V4 可變區(qū)的PCR 擴(kuò)增，2g/dl 瓊脂凝膠電泳純化PCR 產(chǎn)物。⑶使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Libraey Kit 48 rxns 制備文庫(kù)，行Qubit 定量檢測(cè)。⑷IonS5TMXL 上機(jī)測(cè)序，將一致性達(dá)97%的序列聚類歸并和可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），與Silva 的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，進(jìn)行樣本復(fù)雜度及多樣性比較，計(jì)算Chaol 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpaon 指數(shù)和ACE指數(shù)，TaxFun 軟件進(jìn)行給予KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)的菌群功能預(yù)測(cè)。

1.3.2 血清D- 乳酸、sTREM1 及MCP-1 水平檢測(cè)：①血壓標(biāo)本采集：分別于膿毒癥及非膿毒癥患者入住ICU 后第一天，及對(duì)照組入組后當(dāng)天，采集其外周靜脈血5ml，3 000r/min 快速離心15min，分離上層血清，置于-80℃冰箱內(nèi)待用。②采用德國(guó)羅氏全自動(dòng)分析儀及其配套試劑檢測(cè)血清D-乳酸水平，D-乳酸的正常值范圍為0.1～1.0mmol/L；酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)血清sTREM-1 和MCP-1 水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單方差分析，檢驗(yàn)有意義者，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用例表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)分析 見(jiàn)表1。三組腸道菌群ACE 指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；三組Chaol，Shannon 及Simpaon 指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中膿毒癥組患者Chaol，Shannon 及Simpaon 指數(shù)均低于非膿毒癥組（t=8.733,2.234,2.811,均P＜0.05）與對(duì)照組（t=12.360,2.911,3.311,均P＜0.05），非膿毒血癥組低于對(duì)照組（t=1.584,0.894,0.113,均P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 三組腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)分析（±s）

表1 三組腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)分析（±s）

項(xiàng)目膿毒癥組（n=46）非膿毒癥組（n=45）對(duì)照組（n=50）FP ACE 指數(shù) 476.59±46.69 483.69±53.69 490.15±55.48 0.797 0.453 Chaol 指數(shù) 365.45±43.58 465.69±50.37 473.58±52.15 71.632＜0.001 Shannon 指數(shù) 5.06±1.065.56±1.175.74±1.26 4.292 0.016 Simpaon 指數(shù) 0.83±0.170.94±0.210.96±0.22 5.694 0.004

2.2 三組腸道菌群菌門水平種類成分分析 見(jiàn)表2。對(duì)樣本OTU 聚類分析后發(fā)現(xiàn)，在門水平上，膿毒癥組、非膿毒癥組及對(duì)照組患者腸道微生物主要分為擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、變形菌門及梭桿菌門5 類。對(duì)樣本OTU 聚類分析后發(fā)現(xiàn)，非膿毒癥組與對(duì)照組患者腸道微生態(tài)中擬桿菌門+厚壁菌門占比均超過(guò)90%，膿毒癥組擬桿菌門+厚壁菌門占比低于其余兩組，變形菌門占比高于其余兩組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。膿毒癥組擬桿菌門+厚壁菌門、變形菌門與非膿毒癥組、對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.558，3. 984；4.623，4.058，均P＜0.05）。

表2 三組腸道菌群菌門水平種類成分分析（%）

2.3 三組血清D 乳酸、sTREM1，MCP 1 水平比較 見(jiàn)表3。膿毒癥組、非膿毒癥組及對(duì)照組間血清D-乳酸、sTREM1 及MCP-1 水平呈依次下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中，與膿毒癥組比較，非膿毒癥組和對(duì)照組三項(xiàng)水平顯著降低（t=28.577,27.435,15.716; 21.417,38.888,22.411,均P＜0.05），與非膿毒癥組比較，對(duì)照組三項(xiàng)水平降低（t=5.576,5.662,4.987,均P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 三組血清D-乳酸、sTREM1，MCP-1 水平比較（±s）

表3 三組血清D-乳酸、sTREM1，MCP-1 水平比較（±s）

項(xiàng)目膿毒癥組（n=46）非膿毒癥組（n=45）對(duì)照組（n=50）FP D-乳(mmol/L) 4.26±0.85 0.69±0.16 0.53±0.12 822.762＜0.001 sTREM1(ng/ml) 183.16±23.26 60.15±19.48 42.48±10.34 806.300＜0.001 MCP-1(ng/ml) 563.15±63.69365.73±55.78 311.42±51.74 311.42＜0.001

2.4 膿毒癥患者血清D-乳酸、sTREM1，MCP 1 水平與其腸道菌群之間的關(guān)系 見(jiàn)表4。相關(guān)性分析提示，膿毒癥組患者腸道內(nèi)擬桿菌門及厚壁菌門與其血清D-乳酸、sTREM1，MCP-1 水平均呈負(fù)相關(guān)，變形菌門與其血清D-乳酸、sTREM1，MCP-1水平均呈正相關(guān)。

表4 膿毒癥患者血清D-乳酸、sTREM1，MCP-1水平與其腸道菌群之間的關(guān)系

3 討論

在ICU 中，膿毒癥是宿主對(duì)感染所做出的一系列反應(yīng)，最常見(jiàn)的致死性臨床綜合征，其致死率可高達(dá)50%，嚴(yán)重威脅患者生命健康。探究膿毒癥發(fā)病原因及致病機(jī)制，是有效控制病情，改善患者預(yù)后的重要前提[6-7]。在膿毒癥3.0 中強(qiáng)調(diào)，膿毒癥與器官功能障礙密切相關(guān)，作為腸道內(nèi)重要的組成部分，腸道菌群與膿毒癥之間的關(guān)系逐漸得到重視[8-9]。但在膿毒癥中，腸道菌群紊亂的特點(diǎn)還尚未研究清楚。

本研究利用16S rRNA 技術(shù)對(duì)膿毒癥患者糞便菌群進(jìn)行分析，結(jié)果提示，與健康對(duì)照組及ICU 非膿毒癥患者一樣，膿毒癥患者糞便中的主要菌門均為擬桿菌門及厚壁菌門，但對(duì)照組及非膿毒癥組患者糞便內(nèi)擬桿菌門+厚壁菌門占比均超過(guò)90%，而膿毒癥組患者兩菌門占比總和明顯降低，且變形菌門占比明顯增加，說(shuō)明膿毒癥患者腸道中優(yōu)勢(shì)專性厭氧菌豐富下降，兼性厭氧菌豐度升高，有益共生菌含量下降，致病菌含量增多。此外，膿毒癥患者腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)Chaol，Shannon 及Simpaon 指數(shù)均較非膿毒癥組及對(duì)照組降低，提示膿毒癥患者腸道菌群多樣性下降。以上研究表示，膿毒癥患者存在明顯的腸道菌群失衡表現(xiàn)。這可能與膿毒癥患者在病理狀況下，腸道環(huán)境及腸黏膜血供改變，破壞腸道菌群生長(zhǎng)環(huán)境，且膿毒癥患者在治療過(guò)程中接觸的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑等因素相關(guān)。

另一方面，腸道屏障功能障礙也是腸道微生態(tài)異常的表現(xiàn)之一，其可為腸道菌群和內(nèi)毒素的異位提供條件，也是誘導(dǎo)膿毒癥的重要原因之一。前期研究表明外周血D-乳酸水平也是腸道屏障功能障礙的標(biāo)志之一。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血清D-乳酸水平明顯高于非膿毒癥組及對(duì)照組，提示其出現(xiàn)腸道屏障功能障礙。且D-乳酸水平與其腸道擬桿菌門、厚壁菌門水平呈負(fù)相關(guān)，與變形菌門水平呈正相關(guān)。D-乳酸是丙酮醛代謝物，主要來(lái)源于丙酮醛代謝，正常條件下，D-乳酸在血液中含量很少，但當(dāng)腸道屏障出現(xiàn)障礙時(shí)，血液中D-乳酸水平將急驟上升，進(jìn)而引起D-乳酸中毒[10]。膿毒癥患者常伴有低血容量、組織灌溉障礙、高乳酸血癥甚至乳酸性酸中毒，故外周血D-乳酸水平升高已成為膿毒癥、創(chuàng)傷性休克的常見(jiàn)診斷指標(biāo)[11]。因此本研究的結(jié)果提示膿毒癥患者腸道菌群失衡與腸道屏障功能障礙可能具有一定的相互作用力。

失控性炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是膿毒癥的本質(zhì)特征，作為機(jī)體對(duì)損傷性傷害的防御性反應(yīng)，失控性炎癥反應(yīng)意味著機(jī)體自身調(diào)節(jié)能力失衡，此時(shí)激活的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞可產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，共同促進(jìn)炎癥反應(yīng)的加劇，從而引發(fā)嚴(yán)重自身?yè)p傷。炎癥相關(guān)因子在該過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血清sTREM1 及MCP-1 水平高于非膿毒癥組及對(duì)照組。提示膿毒癥患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯。此外，相關(guān)性分析提示，膿毒癥患者擬桿菌門及厚壁菌門與其血清sTREM1 及MCP-1 水平均呈負(fù)相關(guān)，與變形菌門水平呈正相關(guān)。說(shuō)明膿毒癥患者腸道菌群失衡，還可能與炎癥反應(yīng)相結(jié)合，共同參與膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展。同時(shí)，張琪等[5]研究發(fā)現(xiàn)，血清sTREM1及MCP-1 水平與膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度間呈明顯正相關(guān)。這也同樣輔證了我們的研究結(jié)果。目前關(guān)于sTREM1 和MCP-1 在膿毒癥中的作用機(jī)制尚不清楚。有研究顯示sTREM1 屬于髓樣細(xì)胞上的免疫球蛋白超家族，sTREM1 能選擇性地表達(dá)在中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞上，誘導(dǎo)其分泌腫瘤壞死因子-α，干擾素γ 等炎性因子，觸發(fā)并放大細(xì)菌與真菌所引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是炎癥反應(yīng)中重要的作用因子[12]。MCP-1 主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生，可將單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T 細(xì)胞等募集至炎性病灶，參與炎癥反應(yīng)[13]。由此可知，膿毒癥可能使腸道菌群失衡，加重機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)負(fù)擔(dān)，促進(jìn)炎癥相關(guān)性反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述，膿毒癥患者腸道菌群多樣性下降，腸道內(nèi)擬桿菌門與厚壁菌門占比下降，變形菌門占比上升，且腸道菌群失衡可能聯(lián)合腸道屏障障礙與炎癥反應(yīng)，共同參與膿毒癥的發(fā)生。但本文所納入的研究樣本量過(guò)小，且未研究腸道菌群紊亂對(duì)膿毒癥患者預(yù)后的影響，也并未分析改善腸道菌群在膿毒癥中的應(yīng)用價(jià)值，以上研究結(jié)果僅表明膿毒癥腸道菌群多樣性下降，且與腸道屏蔽障礙及炎癥反應(yīng)相關(guān)，可為膿毒癥的治療研究提供新思路。