仲亞東，孔德桐，馬伯敏（.鄒城市人民醫(yī)院乳甲血管疝外科，山東濟(jì)寧 7500；.泗水縣人民醫(yī)院普外科，山東濟(jì)寧 700；.魚臺縣人民醫(yī)院腫瘤科，山東濟(jì)寧 700）

甲狀腺癌（thyroid cancer）是病變于甲狀腺濾泡上皮，頸部出現(xiàn)腫塊或結(jié)節(jié)等臨床特征的惡性腫瘤疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，甲狀腺癌發(fā)病增長率正在逐年上升，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，女性群體居多。甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，通常被認(rèn)為受遺傳因素、碘缺乏、雌激素水平和電離輻射等因素影響，及時(shí)診斷治療可有效延長患者預(yù)后生存期[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，核受體亞家族3C 組成員2（nuclear receptor subfamily 3,group C,member 2，NR3C2）在多種惡性腫瘤發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用，例如：NR3C2的高表達(dá)可以抑制胰腺癌細(xì)胞生長增殖，抑制腎癌細(xì)胞的生長，延長患者的生存期。但NR3C2 在甲狀腺癌患者中的表達(dá)和作用機(jī)制尚未被研究[4-6]。E 盒結(jié)合鋅指蛋白1（E-box-binding zinc finger protein 1，ZEB1）是一種轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)報(bào)道，ZEB1 在多種腫瘤疾病中異常表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的遷徙、轉(zhuǎn)移，如肺腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌等[7-9]。既往研究發(fā)現(xiàn)，ZEB1 在甲狀腺癌中表達(dá)異常升高，抑制ZEB1 表達(dá)可有效抑制甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲能力，但NR3C2 和ZEB1 在甲狀腺癌中的作用機(jī)制尚未被深入研究。本研究旨在分析甲狀腺癌組織和患者血清NR3C2，ZEB1 表達(dá)水平，及其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018 年3 月～2019 年5 月在鄒城市人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的85 例甲狀腺癌患者的癌組織和癌旁組織（距癌組織＞3cm）樣本，分別收集甲狀腺癌患者（實(shí)驗(yàn)組）手術(shù)前、術(shù)后1 周、術(shù)后1 個(gè)月的血清樣本，以及同期到本院體檢的30例健康者（對照組）血清樣本。實(shí)驗(yàn)組男性47 例，女性38 例，年齡55～78（62.82±6.59）歲；對照組男性16 例，女性14 例，年齡58～80（63.15±6.88）歲，兩組年齡和性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.233,χ2=0.034,P＞0.05）。收集整理甲狀腺癌患者年齡、性別、腫瘤直徑、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)病理學(xué)確診為甲狀腺癌；②初診、未接受過頸部相關(guān)手術(shù)治療；③研究對象和家屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有肝、腎等其他器官嚴(yán)重疾?。虎诨加衅渌麗盒阅[瘤、血液相關(guān)疾病等；③患有高血壓、糖尿病者；④基礎(chǔ)臨床病例資料不全者。本研究內(nèi)容已經(jīng)過本院倫理委員會審核通過。

1.2 儀器與試劑 Trizol 試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司），NR3C2 和ZEB1 免疫組織化學(xué)法單克隆抗體和二抗試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司），7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司），XS-200 光學(xué)顯微鏡（南京江南光電集團(tuán)股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：甲狀腺癌患者手術(shù)后，完整保存患者癌組織和癌旁組織樣本備用。分別抽取對照組體檢時(shí)，實(shí)驗(yàn)組手術(shù)前、術(shù)后1 周、術(shù)后1 個(gè)月時(shí)的靜脈血3～5 ml，3 500 r/min 離心10 min，取上清置于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測血清NR3C2 mRNA 和ZEB1 mRNA 相對表達(dá)量。按照Trizol RNA 提取試劑盒操作說明提取標(biāo)本中的總RNA，然后將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒操作說明進(jìn)行操作。PCR 反應(yīng)體系：2×SYBR Green Mix 7.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，加入ddH2O 至20 μl。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，共40 個(gè)循環(huán)。引物序列見表1，以GAPDH 作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct值表示相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色法：取甲狀腺癌患者的癌組織標(biāo)本和對照癌旁組織標(biāo)本，進(jìn)行脫蠟水化，用PBS 緩沖液進(jìn)行徹底沖洗，然后采用微波煮沸的方法將抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫后取出玻片，分別用蒸餾水和PBS 緩沖液各進(jìn)行3 次沖洗，分別加入NR3C2 和ZEB1 的一抗，放入4 ℃冰箱孵育過夜，取出后用PBS 緩沖液充分洗滌4 次，接著加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫條件下放置45 min，結(jié)束后用PBS 緩沖液充分沖洗3 次，最后進(jìn)行染色，復(fù)染，定色，脫水，封片。用陽性病理切片做陽性對照，PBS 緩沖液代替一抗做陰性對照，然后在顯微鏡下選取5 個(gè)視野觀察染色情況。

1.3.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：觀察各個(gè)染色切片的染色結(jié)果，并對其進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)分為兩部分：①根據(jù)陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行評分，0 分為無著色，1 分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色；②根據(jù)陽性細(xì)胞著色面積占比進(jìn)行評分，0 分為占比＜10%，1 分為占比11%～25%，2 分為占比26%～50%，3 分為占比51%～75%，4 分為占比＞75%。將著色強(qiáng)度和著色面積評分相加，總分＜3分為陰性表達(dá)，≥3 分為陽性表達(dá)。

1.3.5 隨訪觀察：主要以電話及門診復(fù)查的方式對所有甲狀腺癌患者隨訪三年，患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或癌因死亡時(shí)則隨訪結(jié)束，患者隨訪率為100%。生存時(shí)間為術(shù)后日期至患者死亡時(shí)間或最終隨訪截止時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料采用單因素方差分析，兩兩比較采用snk-q檢驗(yàn)，血清NR3C2 mRNA 和ZEB1 mRNA 表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier 法分析，對數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行組間生存曲線差異分析，采用多因素COX 回歸分析甲狀腺癌患者預(yù)后影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清NR3C2，ZEB1 mRNA 的相對表達(dá)水平分析 實(shí)驗(yàn)組術(shù)前血清NR3C2 mRNA（0.55±0.14）相對表達(dá)水平低于對照組（0.97±0.22），術(shù)前、術(shù)后1 周、術(shù)后1 個(gè)月血清NR3C2 mRNA（0.55±0.14，0.69±0.15，0.89±0.19）相對表達(dá)水平依次升高（t=12.038，q=7.995,19.415,11.421,均P＜0.001）；實(shí)驗(yàn)組術(shù)前ZEB1 mRNA（1.88±0.28）相對表達(dá)水平高于對照組（1.02±0.41），術(shù)前、術(shù)后1 周、術(shù)后1 個(gè)月血清ZEB1 mRNA（1.88±0.28，1.43±0.32，1.15±0.29）相對表達(dá)水平依次降低（t=12.716，q=13.962,22.649,8.687,均P＜ 0.001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 甲狀腺癌組織和癌旁組織NR3C2，ZEB1 表達(dá)比較 見表2。甲狀腺癌組織中NR3C2 陽性表達(dá)率（36.47%）顯著低于癌旁組織（72.94%），ZEB1陽性表達(dá)率（67.06%）顯著高于癌旁組織（30.59%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。

表2 甲狀腺癌組織及癌旁組織中NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA 的表達(dá)情況[n(%)]

2.3 甲狀腺癌患者血清NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA相對表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系分析 見表3。甲狀腺癌患者血清NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA 相對表達(dá)水平與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、包膜浸潤有關(guān)（均P＜0.05）。

表3 血清NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA 的相對表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表3 血清NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA 的相對表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

類 別nNR3C2 mRNAtPZEB1 mRNAtP年齡（歲）＜60410.54±0.140.6830.4971.86±0.280.4670.642≥60440.56±0.131.89±0.31腫瘤直徑（cm）＜2480.53±0.111.3130.1931.86±0.250.7060.482≥2370.57±0.171.90±0.27病理類型 乳頭狀癌460.52±0.141.7280.0881.89±0.270.5460.587其他類型390.58±0.181.86±0.23 TNM 分期 Ⅰ～Ⅱ380.59±0.182.4490.0161.84±0.112.0130.047Ⅲ～Ⅳ470.51±0.121.91±0.19分化程度 低分化400.49±0.163.938＜0.0011.93±0.272.0290.046中、高分化450.61±0.121.83±0.18淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無430.58±0.152.0810.0401.83±0.172.3480.021有420.51±0.161.93±0.22包膜浸潤 無390.58±0.142.2120.0301.81±0.242.2960.024有460.52±0.111.95±0.31

2.4 甲狀腺癌患者血清NR3C2 mRNA，ZEB1 mRNA相對表達(dá)水平與患者三年生存率的關(guān)系分析 見圖1，圖2。以術(shù)前患者血清NR3C2 mRNA 和ZEB1 mRNA 相對表達(dá)水平進(jìn)行劃分，NR3C2 mRNA 相對表達(dá)水平＜0.55 為低表達(dá)組，≥0.55 為高表達(dá)組，ZEB1 mRNA 相對表達(dá)水平＜1.88 為低表達(dá)組，≥1.88 為高表達(dá)組。NR3C2 mRNA 高表達(dá)組患者三年生存率為86.00%（43/50），NR3C2 mRNA低表達(dá)組患者三年生存率為40.00%（14/35），兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.168，P＜0.05）；ZEB1 mRNA 高表達(dá)組患者三年生存率為35.29%（12/34），ZEB1 mRNA 低表達(dá)組患者三年生存率為88.24%（45/51），兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.593，P＜0.05）。

圖1 不同NR3C2 mRNA 相對表達(dá)水平與甲狀腺癌患者三年生存率的關(guān)系

圖2 不同ZEB1 mRNA 相對表達(dá)水平與甲狀腺癌患者三年生存率的關(guān)系

2.5 甲狀腺癌患者預(yù)后影響因素的COX 回歸分析見表4。以TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ期=1，Ⅲ～Ⅳ期=0）、分化程度（低分化=1，中，高分化=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無=0，有=1）、包膜浸潤（無=0，有=1）、NR3C2 mRNA（＜0.55=1，≥0.55=0）和ZEB1 mRNA（≥1.88=1，＜1.88=0）為自變量，生存時(shí)間為時(shí)間變量，預(yù)后（死亡=1，生存=0）為因變量。多因素COX 回歸分析顯示，TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、包膜浸潤、NR3C2 mRNA 和ZEB1 mRNA 相對表達(dá)水平為甲狀腺癌患者預(yù)后影響因素（P＜0.05）。

3 討論

近年來，甲狀腺癌的發(fā)病率持續(xù)上升，位于我國惡性腫瘤發(fā)病增長率首位，且屬于年輕群體中最常見的惡性腫瘤之一[10]。甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段、多種基因相互影響作用的復(fù)雜過程，其具體的發(fā)病機(jī)制尚未明確。腫瘤相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)異常、表觀遺傳學(xué)修飾、環(huán)境致癌物等因素都會影響甲狀腺癌的發(fā)生與發(fā)展過程[11]。甲狀腺良性結(jié)節(jié)與甲狀腺癌的臨床表現(xiàn)、治療療效和患者生存期呈現(xiàn)出不同的表現(xiàn)，及時(shí)準(zhǔn)確作出判斷對患者治療效果和提高預(yù)后生存期具有重要的臨床意義[12]。因此，尋找便捷準(zhǔn)確的生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行甲狀腺癌早期的診斷治療對患者預(yù)后恢復(fù)具有重要意義。

NR3C2 編碼鹽皮質(zhì)激素受體（mineralocorticoid receptor，MR），屬于核轉(zhuǎn)錄因子[13]。NR3C2 存在于機(jī)體內(nèi)包括胃腸道、腦部、心臟、皮膚等多個(gè)部位，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)生理活動以維持機(jī)體平衡穩(wěn)定。大量研究表明，NR3C2 參與并影響多種惡性腫瘤病情的發(fā)展[14-15]。盧達(dá)新等[16]探討了NR3C2 表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，NR3C2 在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，并且低表達(dá)的NR32C 患者預(yù)后生存率低。陳恩更等[17]基于癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫分析影響結(jié)腸腺癌（colonic adenocarcinoma，COAD）患者預(yù)后的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NR3C2 在COAD 患者組表達(dá)下調(diào)，NR3C2的表達(dá)與患者預(yù)后情況相關(guān)，但NR3C2 在甲狀腺癌中的作用機(jī)制尚未被深入研究。本研究結(jié)果表明，甲狀腺癌組織NR3C2 陽性表達(dá)率低于癌旁組織，實(shí)驗(yàn)組患者術(shù)前、術(shù)后1 周、術(shù)后1 個(gè)月血清NR3C2 mRNA 相對表達(dá)水平依次升高，且NR3C2 mRNA 高表達(dá)者三年生存率顯著高于低表達(dá)者，與其在乳腺癌和結(jié)腸腺癌中表達(dá)情況一致，提示NR3C2 mRNA高表達(dá)可能抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、分化等活動，與甲狀腺癌病程發(fā)展密切相關(guān)且影響患者預(yù)后情況。

ZEB1 廣泛存在于機(jī)體各個(gè)部位，屬于ZEB 家族一員，是一類相對保守的轉(zhuǎn)錄因子[18]。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA 靶向結(jié)合ZEB1 mRNA 的3’非翻譯區(qū)，從而影響病情的進(jìn)展[19-20]。黃麗群等[21]研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量白藜蘆醇（resveratrol，Res）對ZEB1 表達(dá)水平產(chǎn)生不同程度的下調(diào)，從而對細(xì)胞侵襲和遷移產(chǎn)生不同程度的影響，Res 可有效的下調(diào)ZEB1的表達(dá)水平，從而抑制甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究結(jié)果表明，甲狀腺癌組織ZEB1 陽性表達(dá)率高于癌旁組織，實(shí)驗(yàn)組術(shù)前、術(shù)后1 周、術(shù)后1 個(gè)月血清ZEB1 mRNA 相對表達(dá)水平依次降低，且ZEB1 mRNA 高表達(dá)者三年生存率顯著低于低表達(dá)者，提示ZEB1 mRNA 高表達(dá)可能促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、分化等活動，與甲狀腺癌病程發(fā)展密切相關(guān)且影響患者預(yù)后情況。

本文主要研究了NR32C 和ZEB1 在甲狀腺癌組織和血清中的表達(dá)情況，以及與患者預(yù)后的關(guān)系，但其在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制尚未被深入研究，還需后續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究。

綜上所述，甲狀腺癌患者組織和血清NR32C低表達(dá)，ZEB1 高表達(dá)，其表達(dá)均與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、包膜浸潤和患者預(yù)后有關(guān)，且NR32C，ZEB1 表達(dá)水平對甲狀腺癌患者預(yù)后評估具有重要意義。