劉 芳，王 密，喬 柱，陳菁菁，趙 虎（保定市第一中心醫(yī)院，河北保定 071000）

糖尿病人群牙周病發(fā)病率較高，約超過非糖尿病人群的三倍，且近年來(lái)呈上升趨勢(shì)[1]。既往有研究發(fā)現(xiàn)牙周炎與糖尿病?；ハ嘤绊憽殡S發(fā)生，牙周炎不僅影響糖尿病患者的咀嚼功能，還可加重其機(jī)體代謝紊亂，增加并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；而糖尿病患者對(duì)牙周炎的易感性增強(qiáng)，可加重炎癥反應(yīng)和骨吸收，二者互為疾病的高危因素和促進(jìn)因素，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量[2-3]。炎癥反應(yīng)是糖尿病伴慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展中的重要機(jī)制，齦溝液（gingival crevicular fluid,GCF）炎癥因子水平與牙周炎癥程度密切相關(guān)，并對(duì)該病的診斷治療具有重要意義[4-5]?？谇痪涸诼匝乐苎装l(fā)生發(fā)展中起重要作用，細(xì)菌在齦溝液中生長(zhǎng)繁殖，可附著于牙周袋或牙齒表面構(gòu)成以細(xì)菌為主體的微生態(tài)體系損害牙周組織，當(dāng)宿主環(huán)境、pH 值等發(fā)生改變，其微生態(tài)平衡被打破，菌斑屬性也隨之發(fā)生變化[6]，但其在糖尿病伴慢性牙周炎患者中的變化以及與齦溝液炎癥因子的關(guān)系尚少有研究報(bào)道。鑒于此，本研究探討口腔菌群在糖尿病伴慢性牙周炎患者中的變化，并分析其與齦溝液炎癥因子水平的關(guān)系，旨在為臨床治療減輕糖尿病伴慢性牙周炎患者炎癥反應(yīng)提供新方向。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取保定市第一中心醫(yī)院2022 年6～12 月收治的86 例糖尿病伴慢性牙周炎患者、88 例不伴糖尿病的慢性牙周炎患者分別作為A 組和B組，另于同期招募85例健康志愿者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①A 組均符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，且糖尿病病情穩(wěn)定，空腹血糖≤7.0mmol/L；②A，B兩組均確診為慢性牙周炎[8]且全口剩余牙齒≥16顆；③對(duì)照組均經(jīng)全面體檢確認(rèn)健康；④均對(duì)本研究知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①侵襲性牙周炎或伴有牙髓病變者；②接受牙齒矯正、牙周潔治和抗生素治療者；③近期使用抗菌漱口液者；④有免疫系統(tǒng)疾病、骨質(zhì)疏松癥等需持續(xù)使用抗炎和免疫抑制藥物治療者；⑤長(zhǎng)期吸煙者；⑥孕期、哺乳期或圍絕經(jīng)期婦女。對(duì)照組男性50 例，女性35 例；年齡30～68（45.88±7.26）歲。A 組男性53 例，女性33 例；年齡33～69（46.17±8.03）歲；糖尿病病程2～10（8.43±1.47）年；慢性牙周炎病程5～23（12.58±2.17）個(gè)月；牙周炎嚴(yán)重程度[9]：輕度12例，中度47 例和重度27 例。B 組男性48 例，女性40 例；年齡30～68（46.29±7.88）歲；慢性牙周炎病程4～29（13.02±2.26）個(gè)月；牙周炎嚴(yán)重程度：輕度14 例，中度45 例和重度29 例。三組性別、年齡對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.912，t=0.064，P＞0.05），A 組與B 組慢性牙周炎病程及程度對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.309，χ2=0.246，P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 微生物DNA 提取試劑盒（天津科斯莫生物技術(shù)有限公司），PCR 儀[樂普（北京）醫(yī)療器械股份有限公司）]，齦溝液炎癥因子檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 口腔微生物屬水平相對(duì)豐度檢測(cè)：選擇探診深度不低于4mm 且有附著喪失的磨牙，刮去齦上菌斑后采用無(wú)菌Gracey 刮治器刮取牙周袋全部齦下菌斑，加入免疫組織化學(xué)磷酸鹽緩沖液洗滌后取洗滌液于-80℃下保存?zhèn)溆茫话凑丈唐坊⑸顳NA 提取試劑盒說明書提取菌斑DNA；采用16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)微生物屬水平相對(duì)豐度，PCR 擴(kuò)增目的片段引物：1 492R（5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）和27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液5μl，無(wú)菌去離子水50μl，dNTP 4μl，模板1μl，引物1492R 1μl，引物27F 1μl，Taq 酶0.5μl；反應(yīng)程序：94℃5min，94℃45s，55 ℃40s，72 ℃90s 循環(huán)30 次，72 ℃10min。將獲得的目的片段進(jìn)行克隆后轉(zhuǎn)化陽(yáng)性的克隆子構(gòu)建文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，分析菌群屬水平的相對(duì)豐度，采用QIIME 軟件分析菌群α 多樣性，計(jì)算菌群Shahnon，Simpson，Chao1 多樣性指數(shù)。

1.3.2 齦溝液炎癥因子的檢測(cè)：用濾紙條于頰側(cè)近中、遠(yuǎn)中和舌側(cè)近中、遠(yuǎn)中四個(gè)位點(diǎn)吸取齦溝液后將紙尖浸泡于200μl 磷酸鹽緩沖液中30min，然后離心10min 取洗脫液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)超敏C 反應(yīng)蛋白（high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0 軟件作為統(tǒng)計(jì)學(xué)工具，計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，需要調(diào)整檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α，α=α’/c，其中α’=0.05，c 為比較次數(shù)；計(jì)數(shù)資料以“率（%）”描述，采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 法分析糖尿病伴慢性牙周炎患者口腔菌群屬水平的相對(duì)豐度與齦溝液炎癥因子的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組口腔菌群屬水平的相對(duì)豐度比較 見表1。三組乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、酵母菌屬、腸球菌屬、卟啉單胞菌屬、韋榮球菌屬、普氏菌屬、奈瑟菌屬、密螺旋體屬水平相對(duì)豐度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），A 組乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、酵母菌屬和腸球菌屬水平相對(duì)豐度均低于B 組（t=8.220，15.774，8.217，9.362，均P=0.000）和對(duì)照組（t=29.680，35.305，32.720，37.617，均P=0.000），B 組均低于對(duì)照組（t=23.775，25.609，28.678，29.378，均P=0.000），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)學(xué)意義。A 組卟啉單胞菌屬、韋榮球菌屬、普氏菌屬、奈瑟菌屬和密螺旋體屬水平相對(duì)豐度均高于B 組（t=2.984，3.161，2.945，3.021，3.766，P=0.003，0.002，0.004，0.003，0.000）和對(duì)照組（t=23.179，14.742，12.199，10.780，26.805，均P=0.000），B 組均高于對(duì)照組（t=22.373，11.875，9.742，8.370，24.172，均P=0.000），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。

表1 三組口腔菌群屬水平的相對(duì)豐度比較[±s（%）]

表1 三組口腔菌群屬水平的相對(duì)豐度比較[±s（%）]

菌 屬A 組（n=86）B 組（n=88）對(duì)照組（n=85）F 值P 值乳桿菌屬3.52±0.614.38±0.768.50±1.43611.5110.000雙歧桿菌屬8.47±1.7613.54±2.4228.95±5.08846.5260.000酵母菌屬1.44±0.271.83±0.354.96±0.96865.0540.000腸球菌屬1.51±0.261.99±0.404.58±0.72944.5800.000卟啉單胞菌屬20.28±3.4318.84±2.9210.53±1.82300.2210.000韋榮球菌屬9.35±1.788.53±1.645.95±1.17111.4090.000普氏菌屬27.29±5.4624.99±4.8318.73±3.4976.8540.000奈瑟菌屬13.17±2.5212.10±2.149.71±1.5660.0780.000密螺旋體屬12.68±2.2811.44±2.065.64±0.82356.3610.000其它2.35±0.432.42±0.462.45±0.491.0640.347

2.2 三組口腔菌群α 多樣性分析 見表2。三組Simpson 指數(shù)、Chao1 指數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.044,2.789,均P＞0.05），Shahnon 指數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.537，P=0.002），A組和B 組Shahnon 指數(shù)均高于對(duì)照組（t=3.599，2.528，P=0.000，0.012）。

表2 三組口腔菌群屬α 多樣性分析（±s）

表2 三組口腔菌群屬α 多樣性分析（±s）

類別A 組（n=86）B 組（n=88）對(duì)照組（n=85）F 值P 值Shahnon 指數(shù)5.44±0.485.35±0.365.24±0.186.5370.002 Simpson 指數(shù)0.93±0.070.91±0.180.95±0.251.0440.354 Chao1 指數(shù)2 496.26±718.222 574.13±745.372 736.98±558.062.7890.063

2.3 三組齦溝液炎癥因子水平比較 見表3。三組齦溝液hs-CRP，TNF-α，IL-10，IL-6 和IL-4 水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。A 組齦溝液IL-10 水平均低于B 組和對(duì)照組（t=4.657，11.559，均P=0.000），B 組均低于對(duì)照組（t=7.378，P=0.000）。A 組齦溝液hs-CRP，TNF-α，IL-6，IL-4 水平均高于B 組（t=17.065，27.033，5.863，3.461，P=0.000，0.000，0.000，0.001）和對(duì)照組（t=38.806，39.822，14.549，6.327，均P=0.000），B 組均高于對(duì)照組（t=26.347，10.909，9.081，2.949，P=0.000，0.000，0.000，0.004），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 三組齦溝液炎癥因子水平比較（±s）

表3 三組齦溝液炎癥因子水平比較（±s）

項(xiàng)目A 組（n=86）B 組（n=88）對(duì)照組（n=85）F 值P 值hs-CRP（mg/g）1.29±0.170.91±0.120.50±0.08804.3880.000 TNF-α（ng/g）1.43±0.180.77±0.140.58±0.08875.1240.000 IL-10（pg/ml）7.54±1.518.65±1.6310.73±2.0673.4100.000 IL-6（pg/ml）9.35±1.787.88±1.526.02±1.14105.1480.000 IL-4（pg/ml）3.98±0.733.62±0.643.35±0.5620.3970.000

2.4 A 組口腔菌群屬水平的相對(duì)豐度與齦溝液炎癥因子的相關(guān)性 見表4。A 組乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、酵母菌屬和腸球菌屬水平相對(duì)豐度與齦溝液IL-10 水平均呈正相關(guān)（均P＜0.05），與齦溝液hs-CRP，TNF-α，IL-6 和IL-4 水平均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05）；A 組卟啉單胞菌屬、韋榮球菌屬、普氏菌屬、奈瑟菌屬和密螺旋體屬水平相對(duì)豐度與齦溝液IL-10 水平均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），與齦溝液hs-CRP，TNF-α，IL-6 和IL-4 水平均呈正相關(guān)（均P＜0.05）。

表4 A 組口腔菌群屬水平的相對(duì)豐度與齦溝液炎癥因子的相關(guān)性

3 討論

近年來(lái)，糖尿病伴慢性牙周炎逐漸多發(fā)，越來(lái)越受臨床關(guān)注。目前臨床對(duì)于糖尿病伴慢性牙周炎患者常采取潔治、刮治、抗感染等治療，雖能改善癥狀，但長(zhǎng)期療效不佳[10]。糖尿病與牙周炎在免疫、代謝紊亂方面聯(lián)系密切，有研究指出，糖尿病和牙周炎共同作用使得患者口腔長(zhǎng)期處于炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致牙周組織發(fā)生病理改變，加重牙周組織損傷；另外糖尿病伴慢性牙周炎患者在糖脂代謝紊亂和炎癥作用下會(huì)導(dǎo)致口腔菌群發(fā)生改變，致病菌大量繁殖產(chǎn)生毒性物質(zhì)，加重牙周損害和疾病進(jìn)展，對(duì)患者健康造成嚴(yán)重影響[11-12]?；诖?，本研究嘗試探討糖尿病伴慢性牙周炎患者口腔菌群變化及其與齦溝液炎癥因子的關(guān)系，以為臨床治療提供新思路。

本研究結(jié)果顯示A 組乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、酵母菌屬和腸球菌屬水平相對(duì)豐度均低于B 組和對(duì)照組，B 組均低于對(duì)照組；A 組卟啉單胞菌屬、韋榮球菌屬、普氏菌屬、奈瑟菌屬和密螺旋體屬水平相對(duì)豐度均高于B 組和對(duì)照組，B 組均高于對(duì)照組，提示口腔菌群失調(diào)參與糖尿病伴慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程?？谇晃⑸锇喾N細(xì)菌、真菌和病毒等，是牙周炎發(fā)病的始動(dòng)因子，微生物堆積在牙齦和牙齒結(jié)合面以及牙齦溝內(nèi)，微生物之間相互作用影響牙菌斑微生物的性質(zhì)、毒力以及在生物膜中的定植，導(dǎo)致口腔微生態(tài)改變，其中乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、酵母菌屬和腸球菌屬均是口腔有益菌，可維持口腔酸性環(huán)境，幫助抑制有害菌群的滋生，還能與有害菌群競(jìng)爭(zhēng)牙斑生物膜位點(diǎn)，減少有害菌群的定植；而卟啉單胞菌屬、韋榮球菌屬、普氏菌屬、奈瑟菌屬和密螺旋體均屬有害致病菌，可定植在牙菌斑中形成致病性生物膜，釋放毒性產(chǎn)物，造成免疫紊亂，引起牙周組織破壞，是牙周炎的主要致病因素[13-14]。在正常人群中牙周菌斑量相對(duì)較低，多以共生菌為主，但當(dāng)牙周菌斑堆積過多時(shí)刺激牙周組織引發(fā)慢性炎癥，同時(shí)含有營(yíng)養(yǎng)成分的齦溝液為牙周致病菌的繁殖提供良好的培養(yǎng)基，口腔微生態(tài)逐漸失衡，致病菌群成為優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，破壞牙周組織，導(dǎo)致牙周組織附著喪失、牙槽骨吸收。另外有研究發(fā)現(xiàn)[15]，糖尿病中糖基化血紅蛋白能夠促進(jìn)細(xì)菌生物膜形成，增加口腔卟啉單胞菌的致病潛力，并且糖尿病患者唾液中微生物代謝途徑中ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路遭到破壞，可能是糖尿病患者牙周病發(fā)生的重要機(jī)制。既往謝芬等[16]報(bào)道，2 型糖尿病并發(fā)牙周炎患者變黑普氏菌、中間普氏菌和牙齦卟啉單胞菌等病原菌水平均高于單純牙周炎患者，這與本研究結(jié)果一致，證實(shí)了糖尿病伴慢性牙周炎患者口腔菌斑微生物的占比會(huì)發(fā)生改變，致病菌取代有益菌成為優(yōu)勢(shì)菌，造成口腔菌群失調(diào)，破壞牙周組織。另外，口腔菌群α 多樣性分析結(jié)果顯示，三組Simpson 指數(shù)、Chao1 指數(shù)無(wú)明顯差異，A 組和B 組Shahnon 指數(shù)均高于對(duì)照組，提示糖尿病伴慢性牙周炎和單純慢性牙周炎患者相較于健康人群口腔菌群多樣性升高，可能由于糖尿病、牙周炎病理改變更有助于菌群在牙周附著和生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌群多樣性增加。另外，研究結(jié)果顯示A組和B 組Shahnon 指數(shù)相近，既往相關(guān)研究[17-18]也均報(bào)道糖尿病伴慢性牙周炎和單純慢性牙周炎患者菌群多樣性相似，菌群差異主要體現(xiàn)在相對(duì)豐度和代謝功能方面。但口腔菌群多種多樣，目前建立的菌群數(shù)據(jù)庫(kù)信息有限，菌群測(cè)序分析技術(shù)也有一定的局限性，可能部分低豐富度的菌群尚未檢出，將來(lái)仍需進(jìn)一步充分分析口腔菌群的多樣性，深入了解糖尿病伴慢性牙周炎的口腔菌群變化情況。

本研究結(jié)果顯示A 組齦溝液IL-10 水平均低于B 組和對(duì)照組，B 組均低于對(duì)照組；A 組齦溝液hs-CRP，TNF-α，IL-6 和IL-4 水平均高于B 組和對(duì)照組，B 組高于對(duì)照組，表明炎癥反應(yīng)是糖尿病伴慢性牙周炎發(fā)生的關(guān)鍵因素，炎癥因子在其發(fā)病進(jìn)程中起重要作用。慢性牙周炎患者齦溝液中可檢測(cè)到多種炎癥因子，其中hs-CRP 是反映機(jī)體炎癥最常用的敏感指標(biāo)；TNF-α 是多功能細(xì)胞因子，不但激活破骨細(xì)胞活性，同時(shí)抑制牙周膜纖維細(xì)胞堿性磷酸酶活性，進(jìn)而損傷牙周組織，促進(jìn)牙槽骨吸收[19]；IL-4，IL-6 均是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，均具有促炎癥反應(yīng)作用，而IL-10 是一種調(diào)節(jié)免疫的抗炎因子，能夠抑制多種炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)造成的病理?yè)p害[20]。糖尿病患者處于氧化應(yīng)激激活、慢性微炎癥狀態(tài)，同時(shí)糖脂代謝紊亂削弱白細(xì)胞趨化防御功能，增加單核細(xì)胞高反應(yīng)性，刺激單核細(xì)胞分泌大量的炎性細(xì)胞因子，放大細(xì)菌引起的炎性反應(yīng)，促進(jìn)牙周炎的發(fā)生發(fā)展。MIRANDA 等[21]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病會(huì)促使慢性牙周炎患者促炎因子與抗炎因子比例轉(zhuǎn)變，患者齦溝液TNF-α，IL-6和IL-4等促炎細(xì)胞因子水平顯著升高，加重炎癥負(fù)擔(dān)；武瑋等[22]通過降低CRP，TNF-α和IL-6 水平，升高IL-10 水平來(lái)治療糖尿病伴慢性牙周炎患者，明顯改善了牙周情況，以上研究均證實(shí)了炎癥因子參與糖尿病伴慢性牙周炎的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)該病的診斷和治療具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示A 組乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、酵母菌屬和腸球菌屬水平相對(duì)豐度與齦溝液IL-10水平均呈正相關(guān)，與齦溝液hs-CRP，TNF-α，IL-6，IL-4 水平均呈負(fù)相關(guān)；A 組卟啉單胞菌屬、韋榮球菌屬、普氏菌屬、奈瑟菌屬和密螺旋體屬水平相對(duì)豐度與齦溝液IL-10 水平均呈負(fù)相關(guān)，與齦溝液hs-CRP，TNF-α，IL-6 和IL-4 水平均呈正相關(guān)，說明糖尿病伴慢性牙周炎患者口腔菌群失調(diào)與齦溝液炎癥因子水平有密切相關(guān)性，提示臨床可通過改善口腔菌群平衡來(lái)減輕患者炎癥反應(yīng)。在糖尿病伴慢性牙周炎患者中口腔微生態(tài)紊亂，乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、酵母菌屬和腸球菌屬等有益菌相對(duì)豐度降低，其對(duì)致病菌黏附定植的阻礙作用也隨之降低[23]；而齦下卟啉單胞菌屬、韋榮球菌屬、普氏菌屬、奈瑟菌屬和密螺旋體屬水平相對(duì)豐度增加，此類致病菌取代有益菌大量定植于牙周組織并釋放丁酸鹽、戊糖、抗壞血酸等代謝物，刺激牙周組織產(chǎn)生過敏反應(yīng)，引發(fā)免疫應(yīng)答；同時(shí)附著在牙周的致病菌可通過損傷的牙周內(nèi)壁進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致牙周局部血管發(fā)生炎癥，刺激牙周分泌更多的促炎因子釋放到齦溝液中，加重牙周組織損害，促進(jìn)牙周炎疾病進(jìn)展[24-25]。

綜上，糖尿病伴慢性牙周炎患者口腔致病菌占比升高而有益菌占比降低，齦溝液促炎癥因子水平升高而抗炎癥因子水平降低，較單純慢性牙周炎患者改變更為顯著，且糖尿病伴慢性牙周炎患者口腔菌群屬水平相對(duì)豐度與齦溝液炎癥因子水平均有密切相關(guān)性。因而，通過改善口腔菌群平衡，提高有益菌水平、降低致病菌水平可能有助于抑制促炎因子的釋放，提高抗炎因子水平，進(jìn)而減少糖尿病伴慢性牙周炎患者炎癥反應(yīng)。不足之處：僅對(duì)患者進(jìn)行一次口腔菌群和齦溝液炎癥因子檢測(cè)，未持續(xù)監(jiān)測(cè)；針對(duì)此類患者通過調(diào)節(jié)口腔菌群水平來(lái)減輕牙周炎炎癥反應(yīng)的效果如何尚未研究明確，需進(jìn)一步進(jìn)行臨床試驗(yàn)明確，為臨床干預(yù)提供更有力的支持。