高 雪，勞廣術(shù)，譚 崢，方渝凱，劉文波，靳鵬飛，繆衛(wèi)國(guó)

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228）

水稻（Oryza sativaL.）白葉枯病是一種由黃單胞菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo）引起的細(xì)菌性病害，在各水稻種植區(qū)均有發(fā)生，并且危害嚴(yán)重，是我國(guó)水稻重要病害之一[1]。發(fā)病后葉片產(chǎn)生黃綠色病斑，最終變黃枯死，每年造成水稻產(chǎn)量減少20%～30%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)50%，甚至絕收[2]。雖然目前有一些抗病品種，但是抗病性易隨著時(shí)間而逐漸減弱。防治白葉枯病的化學(xué)藥劑有銅制劑、有機(jī)磷、有機(jī)氮、噻唑類等[3-8]，這些藥劑大部分在田間使用時(shí)易使病菌產(chǎn)生抗藥性，對(duì)環(huán)境有影響。如噻枯唑在田間已有明顯抗性[9]；5-氧吩嗪類藥劑持效期短，病害易復(fù)發(fā)，水稻白葉枯病的防治形勢(shì)依舊嚴(yán)峻。

生物防治是一種高效且對(duì)環(huán)境友好的策略，可以用于植物病害的治理[10]。生防芽孢桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的生防細(xì)菌之一，對(duì)各種真菌、細(xì)菌和病毒的侵染造成的植物病害，都能夠有效地抑制[11]，并且還具有良好的促進(jìn)植物增產(chǎn)、誘導(dǎo)植物抗病的能力。目前，越來(lái)越多生防芽孢桿菌被開(kāi)發(fā)成農(nóng)藥，得到商品化產(chǎn)品[12]。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生次級(jí)代謝物質(zhì)來(lái)抑制和殺滅有害微生物，這些活性代謝物質(zhì)主要包括酶類、細(xì)菌素類，以及受到關(guān)注最多的脂肽類等[13-14]，如地衣形芽孢桿菌（Bacillus licheni formus）可以發(fā)酵產(chǎn)生一種具有良好的抑制細(xì)菌活性的脂肽類物質(zhì)——桿菌肽。桿菌肽目前作為一種多肽類抗生素已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)[15]。有研究[16]表明芽胞桿菌屬（Bacillusspp.）能夠產(chǎn)生具有較強(qiáng)拮抗Xoo的脂肽類活性物質(zhì)。Bacillusstrain D13可以產(chǎn)生一種揮發(fā)性物質(zhì)，該揮發(fā)性物質(zhì)具有較好的抑制Xoo的活性[17]。解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensFZB42分泌的抗生素類物質(zhì)bacilysin和difficidin對(duì)水稻黃單胞菌Xoo具有顯著的抑菌作用[18]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室的研究[19]發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌HN-2產(chǎn)生的C15surfactin A對(duì)Xoo具有較強(qiáng)抗菌活性，能抑制Xoo的生長(zhǎng)，并通過(guò)介導(dǎo)抗氧化劑相關(guān)酶的活性而引發(fā)過(guò)敏性反應(yīng)，有效地誘導(dǎo)水稻對(duì)Xoo的抗性。雖然目前已經(jīng)有一些關(guān)于芽孢桿菌抑制Xoo的研究，然而貝萊斯芽孢桿菌抑制Xoo的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究以HN-2菌株發(fā)酵液正丁醇提取物處理12 h后的Xoo為研究對(duì)象，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，擬求得Xoo應(yīng)對(duì)HN-2抑菌活性成分的代謝途徑基因表達(dá)差異圖譜，為后續(xù)進(jìn)一步揭示貝萊斯芽孢桿菌HN-2的抑植物病原細(xì)菌Xoo機(jī)理提供前期數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及樣品準(zhǔn)備貝萊斯芽孢桿菌HN-2為本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離保存，稻黃單胞菌Xoo（PXO99A）由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室提供保存。桿菌肽（98%，分析純）購(gòu)自日本和光純藥株式會(huì)社有限公司。（1）HN-2發(fā)酵活性物質(zhì)的提取：接種HN-2菌株于LB培養(yǎng)基37 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h后，離心10 min棄去菌體，得到HN-2發(fā)酵液上清液。等比例并充分混合正丁醇和HN-2發(fā)酵上清液后，室溫下靜置過(guò)夜，用分液漏斗分離有機(jī)相得到上層正丁醇萃取液。在67 ℃下將得到的上層正丁醇萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，蒸發(fā)濃縮后的沉淀用少量甲醇充分溶解并進(jìn)行冷凍干燥12 h，得到HN-2抑菌活性成分粉末粗提物，-80 ℃保存?zhèn)溆?，使用前稱取0.01 g粗提物加入1 mL的超純水充分溶解，并用一次性細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾。（2）樣品處理：從平板上挑取黃單胞菌的單菌落接種至PSA液體培養(yǎng)基中，共接種9瓶，在28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期（OD600=0.300）。此時(shí)向第一組菌液中加入HN-2正丁醇提取物至終濃度為MIC50值（2.36 mg·mL-1），第二組菌液加入桿菌肽至終濃度為MIC50值（11.96 mg·mL-1），第三組菌液不做任何處理，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12 h，3次重復(fù)，將HN-2正丁醇提取物處理12 h的樣品命名為“Xoo-HN-2”，桿菌肽處理12 h的樣品命名為“Xoo-G”，對(duì)照組命名為“Xoo-CK”。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析樣品Xoo總RNA的提取使用天根RNA提取試劑盒，并將提取的RNA送到廣州基地奧生物科技公司進(jìn)行質(zhì)檢，以保證所有樣品最終都獲得高質(zhì)量的總RNA。利用Illumina HiSeq X Ten 測(cè)序平臺(tái)（Illumina Inc, CA, USA）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)測(cè)序及分析。步驟：（1）去除核糖體RNA；（2）RNA隨機(jī)打斷為200 nt片段；（3）加入六堿基隨機(jī)引物、緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶Ⅰ合成cDNA第一條鏈；（4）使用dUTP代替dTTP，合成cDNA第二條鏈；（5）末端修復(fù)3′、5′端，加A尾，連接接頭；（6）使用UNG酶降解cDNA第二條鏈，以保留RNA方向信息；（7）PCR擴(kuò)增產(chǎn)生DNA的聚集片段，完成文庫(kù)制備；（8）利用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序，將所得數(shù)據(jù)過(guò)濾后用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組分析[20]。

1.3 差異基因表達(dá)分析對(duì)樣品中的Mapped reads數(shù)目和轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度進(jìn)行歸一化處理，使用RAEM軟件，采用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作為衡量轉(zhuǎn)錄本的指標(biāo)[21]，采用皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson Correlation Coefficient，PCC）法檢測(cè)重復(fù)樣品之間的相關(guān)性，并利用DESeq R包分析不同處理后Xoo的差異表達(dá)基因。為進(jìn)一步控制該過(guò)程中的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR），使用edgeR[22]軟件對(duì)不同樣品間差異表達(dá)基因定量分析。采用FDR（false discovery rate）與log2(FoldChange)（log2FC）來(lái)作為差異表達(dá)基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)，篩選條件為FDR＜0.05且|log2FC|＞1。

1.4 基因功能富集分析將篩選得到的差異基因進(jìn)行GO富集分析，用特定的GO terms給差異表達(dá)基因的表達(dá)模式注釋；利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)找出在差異表達(dá)基因中，富集最顯著的前20條代謝通路畫(huà)圖展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)質(zhì)控過(guò)濾前后的黃單胞菌Xoo（PXO99A）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)情況見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，CK組、HN-2組、桿菌肽組的樣本通過(guò)測(cè)序獲得的原始?jí)A基數(shù)（Raw Data）分別為3 669 218 400、3 356 470 200和5 089 554 000。3組原始序列經(jīng)過(guò)質(zhì)控后獲得的Clean data分別為3 490 096 417、3 232 110 301和502 049 243。過(guò)濾后的總堿基數(shù)占原始序列的比例分別為98.55%、98.53%和97.32%，Q20分別為98.03%、98.03%和97.32%，Q30分別為94.89%、94.89%和92.0%，GC含量分別為61.61%、61.06%和60.93%，這些結(jié)果表明過(guò)濾后所獲得的序列質(zhì)量較好，可靠性高，Clean reads可以用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

表1 Reads過(guò)濾前后堿基信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 樣品重復(fù)性相關(guān)性檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)共有3個(gè)樣本（CK組，HN-2組，G組），通過(guò)主成分分析（PCA）可以評(píng)價(jià)樣品重復(fù)性、找出離群樣品、評(píng)估組間差異等。使用R語(yǔ)言獲得各個(gè)樣本在第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）2個(gè)綜合變量中的數(shù)值大小，作二維坐標(biāo)圖。如圖1所示，PC1可以解釋原所有基因的表達(dá)量總體方差的71.3%，PC2可以解釋原所有基因的表達(dá)量總體方差的28.7%，PC1與PC2共可以解釋總體方差的100%，表明樣品重復(fù)性高，組間差異小。通過(guò)R計(jì)算3個(gè)樣本及每個(gè)樣本的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)間的皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson Correlation Coefficient，PCC）。如圖2所示，可以看到每個(gè)樣本的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)系數(shù)呈對(duì)角線分布，表明測(cè)序數(shù)據(jù)具有較強(qiáng)的重復(fù)性和較高的可信度，可以用于后續(xù)的差異表達(dá)分析。

圖1 主成分分析PCA圖

圖2 相關(guān)性熱圖

2.3 差異基因表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析如圖3所示，HN-2組和桿菌肽組相比，共篩選到1 226個(gè)差異基因，其中有612個(gè)基因在HN-2組中上調(diào)，614個(gè)基因在HN-2組中下調(diào)。桿菌肽組和CK組相比，共篩選到1 146個(gè)差異基因，其中，有730個(gè)基因在桿菌肽組中上調(diào)，416個(gè)基因在桿菌肽組中下調(diào)。HN-2組和CK組相比，共篩選到1 512個(gè)差異基因，其中有871個(gè)基因在HN-2組中上調(diào)，641個(gè)基因在HN-2組中下調(diào)。此外無(wú)論是加入HN-2還是桿菌肽，上調(diào)表達(dá)基因都多于下調(diào)表達(dá)基因，并且HN-2組表達(dá)差異的表達(dá)基因總數(shù)多于桿菌肽組，說(shuō)明經(jīng)HN-2處理后，Xoo有更多的基因被調(diào)控來(lái)參與到對(duì)HN-2處理后的適應(yīng)過(guò)程中。本研究重點(diǎn)關(guān)注的是不同處理之間的差異，因此對(duì)兩兩比較的差異基因繪制了韋恩圖（圖4）。圖4可見(jiàn)，與桿菌肽組相比，HN-2組有275個(gè)差異表達(dá)基因?yàn)槠涮赜?，是HN-2提取物與桿菌肽抑菌機(jī)制不同導(dǎo)致，這些HN-2組特有的差異基因有助于進(jìn)一步研究HN-2對(duì)Xoo的作用機(jī)理。因此，在后續(xù)對(duì)于HN-2組的差異表達(dá)基因定性分析時(shí)，這275個(gè)差異基因?qū)⒆鳛橹攸c(diǎn)研究分析對(duì)象。

圖3 樣品間差異基因統(tǒng)計(jì)

圖4 差異表達(dá)基因韋恩圖

2.4 GO功能分析和KEGG通路分析

2.4.1 差異表達(dá)基因的GO統(tǒng)計(jì)從圖5～7中可以看出，在生物過(guò)程中，HN-2組的差異基因主要集中在單體有機(jī)體過(guò)程、代謝過(guò)程和細(xì)胞進(jìn)程等功能條目中，其中，單體有機(jī)體過(guò)程包含33個(gè)差異基因，代謝過(guò)程包含35個(gè)差異基因；細(xì)胞進(jìn)程中包含20個(gè)差異基因，在細(xì)胞組分中，HN-2組的差異基因主要富集在細(xì)胞、細(xì)胞成分和大分子復(fù)合物等功能條目中，其中，細(xì)胞核細(xì)胞成分均包含17個(gè)差異基因；在分子功能中，HN-2組的差異基因主要富集在結(jié)合、催化活性和結(jié)構(gòu)分子活性等功能條目中，其中，結(jié)合過(guò)程包含26個(gè)差異基因，催化活性包含24個(gè)差異基因，結(jié)構(gòu)分子活性包含9個(gè)差異基因。此外，可以看到雖然HN-2組和桿菌肽組的富集結(jié)果大致相似，但是HN-2組的差異基因數(shù)目（共148個(gè)差異基因）顯著多于桿菌肽組的差異基因數(shù)目（共117個(gè)差異基因）。

圖5 樣品間差異基因GO分類圖（CK vs 桿菌肽）

圖6 樣品間差異基因GO分類圖（CK vs HN-2）

圖7 樣品間差異基因GO分類圖（桿菌肽vs HN-2）

2.4.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的KEGG通路分析對(duì)桿菌肽與HN-2正丁醇提取物處理后，菌株Xoo的代謝通路顯著性富集分析，選取了富集最為顯著的20條代謝通路畫(huà)圖（圖8～10）展示。圖8表明，與對(duì)照組相比，桿菌肽處理后，富集程度較高、富集較為顯著且包含差異基因數(shù)目較多的途徑有鞭毛組裝、核糖體途徑、細(xì)菌趨化性和雙組分系統(tǒng)氧化磷酸化等；圖9表明，與對(duì)照組相比，HN-2正丁醇提取物處理后，核糖體途徑所包含的差異表達(dá)基因富集的程度最高、富集最顯著且差異表達(dá)基因的數(shù)目最多，其余主要參與的代謝途徑有淀粉和蔗糖代謝、苯甲酸降解、甘油磷脂降解、細(xì)菌趨化性等。因此，在后續(xù)對(duì)相關(guān)代謝途徑的生物學(xué)驗(yàn)證中，可以重點(diǎn)關(guān)注和研究核糖體途徑的淀粉蔗糖代謝中的差異表達(dá)基因。

圖8 差異表達(dá)基因KEGG 顯著富集通路結(jié)果圖（CK vs 桿菌肽）

圖9 差異表達(dá)基因KEGG 顯著富集通路結(jié)果圖（CK vs HN-2）

圖10 差異表達(dá)基因KEGG 顯著富集通路結(jié)果圖（桿菌肽 vs HN-2）

3 討 論

黃單胞菌能夠引起的水稻白葉枯病，是水稻生產(chǎn)上的一類重要細(xì)菌病害[1]。生防細(xì)菌貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis由Ruiz-Garcia等[23]發(fā)現(xiàn)并命名，因其具有對(duì)人畜和環(huán)境友好，菌株不易產(chǎn)生抗藥性、在自然環(huán)境中易降解等特點(diǎn)而受到廣泛的研究和關(guān)注[24]。貝萊斯芽孢桿菌具有優(yōu)越的抑制細(xì)菌能力，它能夠產(chǎn)生許多抑菌活性物質(zhì)，其中關(guān)注度最高的是脂肽類物質(zhì)[15]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌HN-2菌株發(fā)酵液的正丁醇提取物對(duì)Xoo具有很強(qiáng)的抑菌活性，通過(guò)分離純化，得到了正丁醇提取物中的主要活性成分，并利用高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HN-2正丁醇提取物中的C15surfactin A對(duì)Xoo具有較強(qiáng)抗菌活性，能抑制Xoo的生長(zhǎng)[19]，但其具體的抑菌機(jī)制尚不明確。

已有研究通過(guò)對(duì)藥劑處理前后轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)探究抑菌物質(zhì)對(duì)Xoo的作用機(jī)理，如Fan等[25]對(duì)鄰香豆酸處理30 min、1 h、3 h、6 h的Xoo菌與DMSO對(duì)照處理的Xoo菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，KEGG聚類分析結(jié)果表明：在處理30 min后，差異表達(dá)基因沒(méi)有明顯聚類，主要都集中在代謝途徑方面；處理1 h后，氧化磷酸化途徑富集最顯著；處理3 h后，差異表達(dá)基因聚類在氧化磷酸化和蛋白質(zhì)合成途徑中；處理6 h后，差異表達(dá)基因集中在糖代謝途徑、組氨酸代謝途徑和細(xì)菌趨化性等方面。并且還發(fā)現(xiàn)，MarR家族蛋白基因簇在4個(gè)時(shí)間段內(nèi)都顯著上調(diào)表達(dá)。據(jù)報(bào)道[25]MarR家族蛋白與病原細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素有關(guān)。Liang等[26]對(duì)經(jīng)過(guò)噻枯唑處理4.5 h和9 h后的Xoo轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Xoo的組氨酸代謝途徑顯著被噻枯唑所抑制。Chen等[27]為了研究褪黑激素作為抗生素如何抑制黃單胞菌的生長(zhǎng)，分析了200 μg·mL-1濃度褪黑素處理21 h的Xoo的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，138個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化，以應(yīng)對(duì)褪黑激素的攻擊。上調(diào)基因主要集中在鞭毛成分、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等途徑，而催化活性、金屬結(jié)合活性、碳水化合物代謝和氨基酸代謝等途徑顯著下調(diào)表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，為進(jìn)一步明確HN-2的抑菌機(jī)制，將桿菌肽和HN-2正丁醇提取物處理12 h后的Xoo菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。桿菌肽（Bacitracin）是一類由地衣芽孢桿菌（Bacillus licheni formus）發(fā)酵生產(chǎn)的一類脂肽類物質(zhì)，具有良好的抑制細(xì)菌活性[28]。桿菌肽的作用機(jī)制明確，它通過(guò)抑制細(xì)胞壁的合成，對(duì)細(xì)胞膜造成損傷，使細(xì)胞質(zhì)中離子和氨基酸外泄來(lái)發(fā)揮抑菌作用[29]。與地衣芽孢桿菌一樣，貝萊斯芽孢桿菌也能夠通過(guò)非核糖體途徑合成一些具有抑菌活性的脂肽類物質(zhì)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇桿菌肽作為對(duì)比來(lái)檢驗(yàn)貝萊斯芽孢桿菌HN-2的主要抑菌機(jī)制與桿菌肽是否具有相似性。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)Xoo的核糖體途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、細(xì)菌趨化性途徑等在受到HN-2正丁醇提取物的影響后顯著上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明HN-2正丁醇提取物很可能通過(guò)影響這些代謝途徑而發(fā)揮抑菌能力。由圖4可以看到，HN-2組與桿菌肽組中相同的差異基因僅占HN-2組所有差異基因的45.3%，HN-2組還有54.7%差異基因?yàn)槠涮赜校虼?，可以得出結(jié)論，HN-2正丁醇提取物的抑菌活性與桿菌肽可能有部分相似性，但是其主要抑菌機(jī)理仍需要進(jìn)一步探究與分析。通過(guò)KEGG富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HN-2正丁醇提取物處理后，核糖體途徑富集的程度最高、富集最顯著、且包含的差異表達(dá)基因數(shù)目最多。在核糖體途徑中發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)的rpoB，rpoB基因是結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）中編碼RNA聚合酶β亞基的基因。萬(wàn)智敏等[30]的研究結(jié)果表明，rpoB基因耐藥決定區(qū)（rifampin resistance-determining region，RRDR）的突變可以引起96%以上的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)利福平耐藥，并且rpoB基因不同的突變模式對(duì)利福平產(chǎn)生的耐藥程度有顯著的差異。由此可以推測(cè)菌株HN-2正丁醇提取物與利福平的抑菌機(jī)理可能存在一定相似性。此外，還發(fā)現(xiàn)核糖體途徑中secY、secE和secG基因顯著上調(diào)表達(dá)，secY、secE和secG基因所編碼的蛋白是分泌途徑中主要的3種膜蛋白[31]，大多數(shù)細(xì)菌蛋白的運(yùn)送都由secYEG復(fù)合體完成，可以推測(cè)HN-2正丁醇提取物可能影響了Xoo中蛋白的分泌與運(yùn)輸，從而影響Xoo菌與外界的物質(zhì)交換。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)HN-2正丁醇提取物處理后Xoo內(nèi)淀粉和蔗糖代謝途徑中的差異基因數(shù)目較多，差異較顯著，可以推測(cè)HN-2正丁醇提取物可能使Xoo對(duì)淀粉和蔗糖等物質(zhì)的代謝利用能力發(fā)生了改變。

本研究中，對(duì)Xoo經(jīng)過(guò)HN-2正丁醇提取物和桿菌肽處理12 h轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果表明，HN-2正丁醇提取物主要影響Xoo的核糖體途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、細(xì)菌趨化性途徑。為進(jìn)一步明確HN-2對(duì)Xoo的抑菌機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。