邢薿文，謝 言，覃 堯

（海南大學(xué) 動物科技學(xué)院，?？?570228）

抗原呈遞細(xì)胞（Antigen presenting cell，APC）如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及B細(xì)胞等是免疫系統(tǒng)中完成捕獲與傳遞抗原信號、激活免疫應(yīng)答的重要組成部分。APC分泌的外體可通過傳遞膜結(jié)合分子、細(xì)胞因子以及微RNA等組分參與調(diào)控免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，主要有吞噬、抗原呈遞和分泌炎癥相關(guān)細(xì)胞因子等[1]。巨噬細(xì)胞具有可塑性，表現(xiàn)出不同的表型和功能。其中，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)常用于誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，是由脂質(zhì)和多糖構(gòu)成的細(xì)菌內(nèi)毒素。在免疫系統(tǒng)中，巨噬細(xì)胞通過Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)識別革蘭氏陰性菌的脂多糖，激活細(xì)胞內(nèi)途徑，如核因子κB途徑，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)抗原呈遞以及炎性反應(yīng)。有研究結(jié)果[2-4]表明，在細(xì)菌感染情況下的巨噬細(xì)胞會釋放攜帶病原體相關(guān)分子模式（PAMP）的外體，并通過Toll樣受體激活巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，進(jìn)一步誘導(dǎo)記憶CD4+T和CD8+T細(xì)胞的成熟。

外體是由細(xì)胞分泌的含有多種生物活性物質(zhì)，主要由蛋白質(zhì)、核苷酸和脂類等組成的具有膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡。作為天然納米結(jié)構(gòu)，外體的直徑為30 ～150 nm，是參與細(xì)胞間通信的重要物質(zhì)。免疫細(xì)胞分泌的外體可以通過傳遞膜結(jié)合分子和miRNAs等來實現(xiàn)調(diào)節(jié)免疫功能。LPS刺激的巨噬細(xì)胞所分泌的外體參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[5-6]。此類外體具有免疫佐劑的潛能。據(jù)報道，LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞系分泌的外體可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量的IFN-γ，促進(jìn)Th1型細(xì)胞免疫[7]。并且，LPS刺激的雞巨噬細(xì)胞（HD11）所分泌的外體通過MyD88/NF-κB信號通路促進(jìn)免疫應(yīng)答[8]。目前，對脂多糖刺激雞巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外體對免疫應(yīng)答的影響并不完全清楚。成熟的樹突狀細(xì)胞能有效激活幼稚T細(xì)胞，也可以直接激活CD4+T和CD8+T 細(xì)胞，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)[9]。因此，作為重要的抗原呈遞細(xì)胞，禽類樹突狀細(xì)胞能否被LPS誘導(dǎo)的HD11源外體活化是決定此類外體能否作為免疫佐劑用于家禽的疫病防控的關(guān)鍵因素。

家禽品種多且MHC分子等基因具有多態(tài)性，免疫性狀及免疫相關(guān)分子應(yīng)答亦有一定差異，因此不同品種的雞對HD11源外體的免疫應(yīng)答調(diào)控可能也存在差異。海南地方優(yōu)良肉雞品種文昌雞（Gallus domesticus）與其他雞種間存在較大差異的免疫性狀，特別是在抗禽流感和新城疫病毒感染過程中，文昌雞免疫性狀明顯優(yōu)于國外引進(jìn)雞種[10]。文昌雞與其他種雞之間MHC分子抗原呈遞結(jié)構(gòu)也存在差異[11]。由于HD11細(xì)胞并不來源于文昌雞，而外體的功能與外體來源及其作用的靶細(xì)胞息息相關(guān)。據(jù)此，本研究以文昌雞骨髓源樹突狀細(xì)胞作為研究對象，探究LPS刺激的HD11源外體對其活化作用，為后期以LPS誘導(dǎo)的HD11源外體作為免疫佐劑用于文昌雞疫病防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系雞源巨噬細(xì)胞系（HD11細(xì)胞），文昌雞骨髓源樹突狀細(xì)胞。

1.2 實驗動物14日齡文昌雞，用于提取骨髓源樹突狀細(xì)胞。

1.3 主要儀器超凈工作臺（蘇州凈化），高速離心機(jī)（力康發(fā)展有限公司），各個規(guī)格移液槍（Eppendorf），超速離心機(jī)Optima L-100XP(Beckman Coulter)，全波長酶標(biāo)儀Infinite M200 PRO[瑞士TECAN勒菲生物科技（上海）有限公司]，熒光顯微鏡BX51（OLYMPUS公司），熒光定量PCR儀Q2000B（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司），PCR儀S100TMThermal Cycler（美國 Bio-Rad）。

1.4 主要試劑脂多糖、淋巴細(xì)胞分離液購自索萊寶生物科技有限公司；RIPA裂解液購自博士德生物公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；PKH67染料試劑盒、高糖培養(yǎng)基購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；無外體血清購自SBI；雞脂多糖ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。重組雞 GM-CSF、IL-4 細(xì)胞因子購于 Abcam 公司；總RNA提取試劑盒、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑和SuperReal熒光定量預(yù)混試劑購于天根生化科技有限公司；上下游引物由生工生物合成。

1.5 脂多糖誘導(dǎo)的HD11源外體的分離、提取與鑒定

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)及刺激用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱（37 ℃，含5% CO2）中培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的HD11細(xì)胞，并在無菌條件下進(jìn)行傳代等操作。待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時，進(jìn)行細(xì)胞傳代操作，將HD11細(xì)胞分別按照 5×106個·mL-1細(xì)胞密度 5×106個·mL-1接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并更換細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清，配制2%含有無外體血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，并將細(xì)胞分為試驗組（脂多糖組）與對照組。試驗組的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為20 μg·mL-1的脂多糖刺激細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5.2 外體的分離與提取將未加脂多糖刺激的HD11細(xì)胞和加入脂多糖刺激的HD11細(xì)胞分別按照 5×106個·mL-1細(xì)胞密度接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，以 2% 無外體胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng) 24 h后，每種細(xì)胞收集 100 mL細(xì)胞培養(yǎng)上清。在 4 ℃，2 000×g 離心 30 min 條件下離心去除雜質(zhì)，保留上清。將上清液移至新的離心管中，10 000 × g，4 ℃離心 45 min去除較大的囊泡或細(xì)胞碎片，然后經(jīng)無菌 0.45 μm 濾膜過濾，收集過濾產(chǎn)物。將上述濾液加入100 kDa的超濾管中，于 4 ℃進(jìn)行離心濃縮，將 100 mL細(xì)胞上清總體積濃縮至 5 mL，經(jīng)無菌 0.45 μm濾膜過濾，收集過濾液。將過濾液移至超速離心管中，4 ℃，100 000 × g 離心70 min，去除上清，用 10 mL預(yù)冷的 1×PBS 重懸后，再次以4 ℃， 100 000 ×g 條件，超速離心70 min后，收集沉淀即得到外體。收集全程均在超凈臺中完成，整個過程中使用的相關(guān)耗材及試劑均需高壓滅菌或使用商品化無菌一次性材料。

1.5.3 脂多糖殘留檢測分析收集超速離心洗滌外體的PBS上清液，用于檢測其中的脂多糖殘留量。配制脂多糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)加樣、洗板等操作。隨后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算洗滌外體后PBS上清液中的脂多糖含量。

1.5.4 外體的鑒定外體的透射電鏡鑒定用 150 μL 預(yù)冷的 1×PBS（經(jīng) 0.22 μm）均勻重懸外體，吸取樣品 10 μL 滴加于銅網(wǎng)上沉淀 1 min，濾紙吸去浮液。然后用磷鎢酸 10 μL 滴加于銅網(wǎng)上沉淀 1 min，濾紙吸去浮液。常溫干燥數(shù)分鐘后，以 100 kv 進(jìn)行電鏡檢測成像，獲得透射電鏡成像結(jié)果。外體的粒徑分析與納米顆粒濃度測定取 10 μL外體樣本于 25 ℃水浴解凍，用 PBS 進(jìn)行稀釋（V∶V=1∶1），直接用于粒徑大小檢測（Flow NanoAnalyzer），剩余外體于-80 ℃保存。

1.5.5 外體濃度測定梯度稀釋牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品，制備 BCA 工作液（具體操作按說明書進(jìn)行）。將各個稀釋濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白質(zhì)樣品加入酶標(biāo)板中，分別加入 200 μL BCA 工作液混勻。37 ℃ 孵育30 min。測定品在562 nm波長的吸光值。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出外體樣品的蛋白濃度。

1.5.6 外體染色取無菌 1.5 mL離心管，加入稀釋液C以及 PKH67 染料 （PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit, MERCK），配制成染料工作液。在無菌條件下，向每管分別加入稀釋液C至總體積為 250 μL。用槍輕柔吹打混勻30次，再振蕩15 s?？焖賹?50 μL外體稀釋液加入到250 μL PKH67（MINI67，購于 Sigma-Aldrich）染料工作液中，立即用槍輕柔吹打混勻30次?；旌弦悍跤? min 后，每管加入500 μL無外體血清并吹打混勻30次，終止反應(yīng)后并再次使用超速離心分離純化外體，以去除殘留的染料。

1.6 文昌雞骨髓源樹突狀細(xì)胞的制備將在隔離器中飼養(yǎng)的 14 日齡文昌雞麻醉處死后，從其脛骨骨髓中分離得到骨髓，制成骨髓細(xì)胞懸液備用。將骨髓細(xì)胞懸液 1 500 r·min-1離心 10 min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，加入 PBS 緩沖液離心洗滌2～3次，棄上清后重懸，制備單細(xì)胞懸液。然后，加入與單細(xì)胞懸液等量的雞骨髓淋巴細(xì)胞分離液（購自索萊寶），按說明書操作提取骨髓細(xì)胞后，于10%胎牛血清 FBS，RM1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)（均購自Gibco），培養(yǎng)24 h后，加入含細(xì)胞因子重組雞 GMCSF、IL-4 細(xì)胞因子（25 μg ·mL-1，購于 Abcam 公司）培養(yǎng)液，持續(xù)培養(yǎng)作用 7 d ～ 10 d，前3 d每天換1次培養(yǎng)液，之后可2 d換1次培養(yǎng)液。

1.7 LPS-Exo、Nor-Exo刺激樹突狀細(xì)胞用50 ng·mL-1終濃度的Nor-Exo、LPS-Exo刺激樹突狀細(xì)胞，在刺激24 h 后通過熒光顯微鏡觀察LPSExo、Nor-Exo是否被樹突狀細(xì)胞攝取以及攝取后發(fā)生的形態(tài)變化。

1.8 熒光定量PCR分別收集無外體刺激的樹突狀細(xì)胞（Ctrl組）以及經(jīng)外體Nor-Exo、LPSExo作用后的樹突狀細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于熒光定量PCR。根據(jù)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，通過熒光定量PCR，以βactin為內(nèi)參，檢測細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12p40表達(dá)。IFN-γ、IL-12p40、β-actin引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 脂多糖誘導(dǎo)的HD11源外體的分離、提取與鑒定

2.1.1 HD11細(xì)胞系的培養(yǎng)及刺激生長狀態(tài)良好的HD11細(xì)胞在更換培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)，可見經(jīng)脂多糖刺激后的HD11細(xì)胞形態(tài)與刺激前相比發(fā)生了明顯的變化。對照組HD11細(xì)胞并未發(fā)生明顯的活化，而脂多糖組HD11細(xì)胞大量活化（圖1）。

2.1.2 外體的提取與鑒定將已經(jīng)制備好的脂多糖組（LPS-Exo）以及對照組（Nor-Exo）外體樣本，用于透射電鏡以及粒徑分析。通過透射電鏡觀察外體形態(tài)、粒徑大?。▓D2）。在透射電鏡中觀察到2組樣本的形態(tài)（圖中白色箭頭所指）均為一側(cè)凹陷的半球型（圖2-A）。此外，通過粒徑分析（圖2-B），樣本中的顆粒均符合外體粒徑范圍（30～150 nm）（圖2-B）。綜上所述，2組樣本的外體的形態(tài)與粒徑大小均符合外體的描述，由此可以證明通過超速離心法分離得到了外體。

圖2 透射電鏡及粒徑分析

2.1.3 脂多糖殘留檢測分析脂多糖殘留的檢測根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，隨后用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm波長的OD值。依據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出Nor-Exo組、LPSExo組外體經(jīng)過洗滌后PBS上清中的脂多糖殘留量。經(jīng)過1次洗滌后，若洗滌外體的PBS中無脂多糖殘留，則可以證明提取到的外體中無脂多糖殘留。結(jié)果顯示，Nor-Exo組上清中脂多糖含量為0.011 8 EU·mL-1，LPS-Exo組上清中脂多糖含量為0.012 8 EU·mL-1（EU為內(nèi)毒素單位），2組外體中脂多糖含量相近。由于Nor-Exo組在實驗過程中并未加入脂多糖，且2組脂多糖殘留濃度無明顯差異，通過對比2組外體洗滌后PBS上清中LPS含量可知LPS-Exo組的LPS含量屬于正常范圍。能夠激活免疫細(xì)胞的LPS最小劑量為0.2 EU·mL-1，而本試驗中檢測到的脂多糖殘留量不足以刺激細(xì)胞使其生理狀態(tài)發(fā)生改變。綜上所述，LPS-Exo組中所添加的脂多糖已基本去除，且其殘留量對后續(xù)試驗結(jié)果沒有影響。

2.2 文昌雞骨髓源樹突狀細(xì)胞的提取提取文昌雞骨髓源細(xì)胞，并且加入細(xì)胞因子（GM-CSF、IL-4）刺激誘導(dǎo)其分化，懸浮的骨髓源細(xì)胞經(jīng)過刺激7 d后出現(xiàn)貼壁的情況，有明顯的細(xì)胞集落形成（圖3中黑色箭頭所指）。

圖3 文昌雞骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后

2.3 樹突狀細(xì)胞攝取LPS-Exo、Nor-Exo后的形態(tài)變化PKH67是一種膜染料，可對細(xì)胞膜進(jìn)行染色，使被染色的膜結(jié)構(gòu)帶有綠色熒光。外體經(jīng)PKH67染色后，再次通過超速離心法去除游離的染料分子，將制備好的外體經(jīng)PKH67染色后按照50 ng·mL-1的終濃度刺激樹突狀細(xì)胞。通過熒光顯微鏡觀察樹突狀細(xì)胞對這兩種外體的攝取情況（圖4）。存在樹突狀細(xì)胞的位置，在熒光視野下可以檢測到由PKH67標(biāo)記外體的綠色熒光信號，由此可以證明2組外體均被樹突狀細(xì)胞攝取，并且，LPS-Exo刺激的樹突狀細(xì)胞偽足形成明顯強(qiáng)于Nor-exo處理組，說明LPS-Exo處理的樹突狀細(xì)胞活化水平較高。

圖4 樹突狀細(xì)胞攝取外體

2.4 細(xì)胞因子表達(dá)水平通過熒光定量PCR檢測樹突狀細(xì)胞活化后產(chǎn)生誘導(dǎo)輔助型T淋巴細(xì)胞分型的相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12p40和IL-4的表達(dá)水平（圖5）。與Nor-Exo組對比，經(jīng)LPS-Exo刺激后，活化的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)輔助型T細(xì)胞向Th1型分化的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12p40表達(dá)量均上調(diào)，而Th2型細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)量無明顯差異。該結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞的外體可體外誘導(dǎo)文昌雞樹突狀細(xì)胞活化產(chǎn)生分泌Th1型細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖5 熒光定量PCR檢測相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)量

3 討 論

本研究通過體外實驗探究LPS刺激的雞巨噬細(xì)胞的外體對文昌雞骨髓樹突狀細(xì)胞活化的影響，結(jié)果表明，LPS刺激雞巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外體可被文昌雞樹突狀細(xì)胞攝取并誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞活化，同時分泌大量的Th1型細(xì)胞因子以促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果為開發(fā)脂多糖刺激巨噬細(xì)胞源外體（作為一種新型疫苗佐劑）用于文昌雞的疫病防控提供了理論基礎(chǔ)。

雞的樹突狀細(xì)胞與哺乳動物類似，也具有主導(dǎo)輔助型T細(xì)胞向Th1型和Th2型分化的功能[12]。其中，Th1型細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)以及活化巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生針對內(nèi)源性抗原如病毒、胞內(nèi)寄生菌和原蟲感染的免疫應(yīng)答。Th2型細(xì)胞主要介導(dǎo)針對外源性抗原如胞外寄生蟲、細(xì)菌、過敏原和毒素的體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量抗體以及抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的活化。Th2型細(xì)胞在一定程度上抑制Th1型細(xì)胞的功能，以維持一定的炎癥以及細(xì)胞損傷穩(wěn)態(tài)。IFN-γ、IL-12p40均為Th1型細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1型活化；而IL-4為Th2型細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2型活化；其中IL-12p40可誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞的增殖以及IFN-γ的產(chǎn)生，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的作用[13]；IFN-γ可增強(qiáng)MHC-Ⅱ類分子的作用，可拮抗IL-4，抑制Th2增殖[14]；IL-4可以下調(diào)IL-12的水平而抑制Th1型分化[15]。

有學(xué)者利用雞重組GM-CSF、IL-4細(xì)胞因子實現(xiàn)了雞骨髓源樹突狀細(xì)胞的體外構(gòu)建，并用LPS誘導(dǎo)該類樹突狀細(xì)胞活化后檢測到IFN-γ、IL-12p40等Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)以及Th2型細(xì)胞因子IL-4的下調(diào)表達(dá)，并通過淋巴細(xì)胞混合實驗證實經(jīng)LPS激活的樹突狀細(xì)胞具有提高T淋巴細(xì)胞增殖能力的功能[16]。與上述研究結(jié)果相似，本研究通過熒光定量PCR分析mRNA水平的數(shù)據(jù)顯示，與未加入外體刺激的樹突狀細(xì)胞相比，外體作用條件下，無論Nor-Exo或LPS-Exo均能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12p40的表達(dá)增多，而IL-4表達(dá)量無明顯差異。Nor-Exo對樹突狀細(xì)胞的活化作用可能由于其本身來源于非文昌雞細(xì)胞，因此某些差異蛋白可能作為抗原被文昌雞骨髓源樹突狀細(xì)胞識別而活化并發(fā)生抗原呈遞反應(yīng)。但LPS-Exo刺激樹突狀細(xì)胞活化產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平要顯著高于Nor-Exo，這也與本研究在光鏡下觀察到LPS-Exo誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞偽足形成較多的結(jié)果相符。由于已排除殘留LPS的干擾，因此，本研究表明LPS誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞源外體與LPS有相同的作用，可體外誘導(dǎo)文昌雞樹突狀細(xì)胞活化并促進(jìn)下游Th1免疫應(yīng)答。由于LPS具有一定的毒性，使其作為佐劑使用受到限制。而外體的生物相容性好，所以LPSExo有望成為有效替代LPS的新型佐劑。

已有研究表明，被病原體感染的巨噬細(xì)胞會釋放更多的外體，而攜帶MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ復(fù)合物等分子的這些巨噬細(xì)胞源外體特別是在存在樹突狀細(xì)胞的情況下，可以刺激T細(xì)胞使其活化[2,17-18]。另一方面，有學(xué)者對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的外體進(jìn)行了蛋白組學(xué)的分析，結(jié)果顯示其中含有大量促炎因子，并且該外體參與了多種炎癥信號通路的激活[19]。據(jù)此，LPS刺激的雞巨噬細(xì)胞源外體也可能由其攜帶的促炎因子或膜表面免疫復(fù)合物介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞活化，誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子以促進(jìn)清除病原感染細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)。后續(xù)需進(jìn)一步探究雞巨噬細(xì)胞源外體在免疫應(yīng)答反應(yīng)中參與的分子事件以及相關(guān)機(jī)制。

綜上所述，脂多糖刺激雞巨噬細(xì)胞釋放的外體可被文昌雞樹突狀細(xì)胞攝取，并且可以誘導(dǎo)文昌雞樹突狀細(xì)胞活化，該外體具有作為免疫佐劑的潛在功能，有著良好的應(yīng)用前景。