郭琳坤，祖海月，孫 江，覃 堯，韓 謙，王金花

（1.海南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，?？?570208; 2.海之大寵物醫(yī)院，海口 570105）

股骨頭缺血性壞死或無菌性壞死，又稱累-卡-佩斯病(Legg-Calvé-Perthes Disease，LCPD)，此病常見于約克夏犬(Yorkshire terrier)、臘腸犬(Dachshund)、吉娃娃犬(Chihuahua)、貴賓犬(Poodle)等小型犬種，其中6～10月齡犬只高發(fā)[1]；此病發(fā)病的主要原因是血供破壞，但主要發(fā)病機(jī)制目前還不清楚，主要的病理過程是以股骨頭部分或完全性缺血和成骨細(xì)胞凋亡壞死，骨小梁萎縮，進(jìn)而導(dǎo)致股骨頭塌陷、形變。在人類臨床上，LCPD是常見又難以治愈的骨科疾病，尚沒有公認(rèn)的根本治愈的方法[2]，其治療一般會(huì)根據(jù)不同發(fā)展階段采用相適應(yīng)的治療方法，其早中期的治療一般采用雙膦酸鹽類藥物保守治療或?qū)嵤┧枞餃p壓術(shù)、鉭棒植入支撐、富血小板血漿（platelet rich plasma, PRP）等保髖治療，后期則采用全髖置換術(shù)(Total hip replacement，THR）。但臨床上，對(duì)于犬 LCPD保髖治療的方法研究甚少，去髖療法股骨頭和股骨頸切除術(shù)( femoral head and neck excision，F(xiàn)HNE)及THR仍然是該病普遍采用的治療方法。

雙磷酸鹽對(duì)骨代謝的作用首次報(bào)道于1968年[3]，目前已經(jīng)出了第三代藥，比如依替磷酸鹽、阿倫磷酸鹽，第三代藥無論是活性還是抗骨吸收能力還是治療范圍都比前兩代更強(qiáng)，甚至比第一代活性強(qiáng)幾萬倍[4]。由于雙膦酸鹽類藥物能夠抑制破骨細(xì)胞活性加速其凋亡，預(yù)防骨質(zhì)吸收，同時(shí)又能防止成骨細(xì)胞凋亡，增加新骨形成在人類臨床上被廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移、早期LCPD的治療；富血小板血漿（platelet rich plasma, PRP）由于其富含具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化、抑制破骨細(xì)胞對(duì)骨吸收等功能的同源性生長因子（growth factors, GFs），被廣泛應(yīng)用于治療股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of femoral head, ANFH)[5-8]，但在獸醫(yī)臨床上雙膦酸鹽類藥物及PRP對(duì)犬LCPD的研究甚少。本試驗(yàn)研究阿侖膦酸鈉及PRP治療LCPD模型犬的效果，為臨床治療缺血性股骨頭壞死提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料12只髖關(guān)節(jié)健康6月齡中華田園犬(Canis lupus familiaris)[（10±0.5 ）kg]購自?？卩弻欀覍櫸镌\療中心；福善美阿倫膦酸鈉片（70 mg），購買自杭州默沙東制藥有限公司；PRP采集容器，購自瀏陽市三力醫(yī)用科技發(fā)展有限公司。

1.2 犬LCPD模型的建立參照建立幼犬股骨頭壞死模型的試驗(yàn)研究[9]的犬股骨頭缺血性壞死液氮建模法，隨機(jī)對(duì)12只中華田園犬一側(cè)股骨頭建立LCPD模型，對(duì)側(cè)健肢作對(duì)照。60 d后運(yùn)用DR儀對(duì)12只犬的股骨頭進(jìn)行X線掃描評(píng)估，再取X影像結(jié)果不明顯的犬只實(shí)施股骨頭外科摘除術(shù)，肉眼觀察股骨頭外形特點(diǎn)，進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)估。同時(shí)運(yùn)用Ficat and Arlet classification(Ficat)分期體系[4]對(duì)建模結(jié)果進(jìn)行分期分析。

1.3 活化PRP制備犬只用異氟烷行呼吸麻醉，用含有檸檬酸鈉的PRP采血管在犬前肢橈外側(cè)皮靜脈采集5 mL血樣，放入離心管中，以3 000 r·min-1，離心6 min，取血漿與紅細(xì)胞之間的高濃度血小板1 mL，并加入0.98 mg葡萄糖酸鈣進(jìn)行活化。

1.4 臨床治療試驗(yàn)把建模成功且影像學(xué)特征明顯的9只犬隨機(jī)分為A、B、C 3組，A組為阿倫磷酸鈉口服治療組，以每周3 mg·kg-1的劑量進(jìn)行口服阿侖膦酸鈉治療，為期12 周；B組為葡萄糖酸鈣活化的PRP注射組，通過外科手術(shù)打開試驗(yàn)患肢關(guān)節(jié)囊，暴露髖關(guān)節(jié)，再用注射器將事先準(zhǔn)備好已經(jīng)活化的血小板血漿注入關(guān)節(jié)囊內(nèi)，最后閉合傷口。每只犬每2周注射1次，一共注射3次。C組為對(duì)照組，不做任何治療。90 d后對(duì)A、B、C 3 組試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行左右髖關(guān)節(jié)DR儀腹背位X線掃描檢查，并運(yùn)用Ficat分期體系及解剖患肢髖關(guān)節(jié)評(píng)估治療效果。

1.5 Ficat分期Ficat分期是根據(jù)股骨頭缺血性壞死不同時(shí)期X線掃描的影像變化，把股骨頭缺血性壞死分為0、Ⅰ、Ⅱ、過渡、Ⅲ、Ⅳ期，6個(gè)不同時(shí)期[4]。本研究把建模及治療試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Ficat分期體系對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析評(píng)估。

1.6 數(shù)據(jù)分析運(yùn)用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)差異分析SPSS Statistics 17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LCPD建模結(jié)果

2.1.1 X線掃描影像結(jié)果建模前、后X線掃描對(duì)比（圖1、圖2）。在12只犬中，9 只犬DR影像不同程度地出現(xiàn)骨密度不均勻、囊性變、股骨頭形態(tài)輕微改變等異常變化，其中1、8、12號(hào)犬股骨頭DR影像無明顯變化。

圖2 建模后DR影像結(jié)果

2.1.2 股骨頭外觀特點(diǎn)外科解剖無DR影像學(xué)變化的犬股骨頭，外觀形態(tài)結(jié)果見圖3。圖3可見，1號(hào)犬股骨頭關(guān)節(jié)面出現(xiàn)瘀斑，8、12號(hào)犬關(guān)節(jié)面出現(xiàn)不同程度的軟骨磨損和塌陷。

圖3 股骨頭解剖圖

2.1.3 建模后Ficat分期建模12只犬中，8只犬在Ficat分期體系中屬于I期，1只犬屬于II期，3只犬為0期，結(jié)果成功建立12只犬 0～I(xiàn)I期LCPD模型（表1）。

表1 建模后Ficat分期評(píng)估表

2.2 評(píng)估股骨頭壞死模型治療后的結(jié)果

2.2.1 影像學(xué)評(píng)估A組治療前、后股骨頭X線片檢查結(jié)果（圖4）可見，5號(hào)犬X線片顯示較治療前股骨頭骨密度不均勻得到改善，但關(guān)節(jié)間隙變窄；6號(hào)犬患肢髖關(guān)節(jié)X線片與治療前X線片對(duì)比囊性病變縮小，髖臼窩與股骨頭界限清晰；9號(hào)犬只患肢髖關(guān)節(jié)X線片與治療前X線片對(duì)比形態(tài)更為光滑，骨密度更均勻，髖臼窩與股骨頭界限更為清晰。B組治療前、后股骨頭X線片檢查結(jié)果（圖5）可見，2號(hào)犬患肢X線片較治療前，髖臼窩與股骨頭界限更為清晰，關(guān)節(jié)間隙無差異；3號(hào)犬患肢較治療前囊性病變減輕，髖臼窩與股骨頭界限清晰；4號(hào)犬骨密度不均勻，治療后無明顯改善，關(guān)節(jié)界限不清，無其他異常。C組治療前、后股骨頭X線片檢查結(jié)果（圖6）可見，7號(hào)犬患肢X線片較治療前股骨頭密度變得不均勻，下骨塌陷形成新月征；10號(hào)犬股骨頭骨密度不均勻與治療前無差異；11號(hào)犬股骨頸出現(xiàn)囊性病變，股骨頭形狀發(fā)生改變。9只犬治療后X線片對(duì)比結(jié)果見圖7。

圖4 A組治療前、后股骨頭X線片

圖5 B組治療前、后右側(cè)股骨頭X線片

圖6 C組治療前、后股骨頭X線片

圖7 9只犬治療后X線片對(duì)比結(jié)果

2.2.2 解剖外觀評(píng)估如圖8和表2所示，經(jīng)治療后A組（阿倫磷酸鈉組）5號(hào)犬潰瘍狀軟骨塌陷，其他犬只股骨頭均光滑無塌陷。B組（PRP組）3只犬股骨頭表面光滑無異常。C組對(duì)照組10號(hào)犬出現(xiàn)溝渠狀軟骨塌陷，7、11號(hào)犬出現(xiàn)環(huán)形軟骨塌陷。

表2 治療試驗(yàn)股骨頭解剖癥狀評(píng)估表

圖8 犬治療后右側(cè)股骨頭解剖圖

2.2.3 治療后Ficat分期評(píng)估治療后A組中，5、9號(hào)犬從I期變?yōu)?期，6號(hào)仍是I期；B組2號(hào)犬從I期變?yōu)?期，3、4號(hào)仍是I期；C組7號(hào)犬從I期變?yōu)檫^渡期，10號(hào)犬從I期變?yōu)镮II期，11號(hào)犬從I期變?yōu)棰羝冢ū?）。

表3 治療效果 Ficat分期評(píng)估表

2.2.4 數(shù)據(jù)分析3 組試驗(yàn)動(dòng)物治療后X線片影像結(jié)果Ficat分期分析依據(jù)為比治療前好或無差異及股骨頭解剖未出現(xiàn)股骨頭塌陷或者形變則認(rèn)為治療有效，否則為無效。數(shù)據(jù)分析結(jié)果（表4）表明，A組2只動(dòng)物治療有效，B組3只動(dòng)物治療有效，C組3只動(dòng)物病情逐漸加重，軟骨嚴(yán)重塌陷，治療無效。

表4 A、B、C組治療有效性組間差異性的分析

統(tǒng)計(jì)差異分析結(jié)果表明(表4)，A組與B組差異不顯著，B組與C組差異極顯著，A與C組差異顯著。

3 討 論

3.1 液氮冷凍性股骨頭壞死模型的建立獸醫(yī)臨床上創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機(jī)理已經(jīng)明確，而非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的機(jī)制尚未完全明確，目前仍未建立一種理想的動(dòng)物模型。液氮冷凍股骨頭壞死動(dòng)物模型具有造模時(shí)間較快、動(dòng)物存活率高的優(yōu)點(diǎn)而成為比較常見采用的股骨頭壞死造模方法。Jin等[10]對(duì)12只成年比格犬建模，術(shù)后8周其股骨頭出現(xiàn)了塌陷形成了蘑菇云。Velez等[11]聯(lián)合使用血管結(jié)扎及液氮冷凍技術(shù)建立了羊模型，最后顯示試驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)股骨頭壞死特征性雙線征和股骨頭塌陷。建模試驗(yàn)結(jié)果顯示：建模8周后，12只犬中有9 只犬DR影像不同程度地出現(xiàn)骨密度不均勻、囊性變、股骨頭形態(tài)輕微改變等異常變化。其余3只犬解剖股骨頭后發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)不同程度的瘀斑、軟骨磨損和塌陷等現(xiàn)象，說明12只犬均成功建模，但建模后部分模型股骨頭X線片出現(xiàn)骨密度不均勻，可能是由于關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在纖維組織修復(fù)而導(dǎo)致的。建模后6號(hào)犬DR影像出現(xiàn)關(guān)節(jié)半脫位現(xiàn)象可能是建模時(shí)為了能充分暴露股骨頭而對(duì)圓韌帶進(jìn)行部分分離而導(dǎo)致的，但這并不影響建模結(jié)果，因?yàn)閳A韌帶主要起到固定股骨防止脫位的作用，在整個(gè)試驗(yàn)周期動(dòng)物采取固定區(qū)域飼養(yǎng)，限制活動(dòng)，沒有出現(xiàn)關(guān)節(jié)脫位導(dǎo)致股骨頭損傷的情況。另外在許多建模方法中，有剪斷圓韌帶充分暴露股骨頭，也有對(duì)圓韌帶進(jìn)行保留的，都能取得不錯(cuò)的效果[12-16]。此外，應(yīng)用液氮冷凍法誘導(dǎo)犬股骨頭壞死更加接近犬非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死的特點(diǎn)，且方法簡單、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，能夠?yàn)檠芯糠莿?chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制和治療方法等方面提供幫助，可作為有效的建模方法進(jìn)行推廣。

3.2 阿侖膦酸鈉和PRP治療LCPD模型的作用相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4]雙磷酸鹽能夠抑制破骨細(xì)胞活性加速其凋亡，預(yù)防骨質(zhì)吸收，同時(shí)又能防止成骨細(xì)胞凋亡，增加新骨形成，在人類臨床上被廣泛應(yīng)用于早期ANFH的治療。PRP及其類似物富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrinogen，PRF），由于它們富含具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化、抑制破骨細(xì)胞對(duì)骨吸收等功能的同源性生長因子，不但應(yīng)用于治療股骨頭缺血性壞死癥，還應(yīng)用于牙槽骨的促生長及抗牙槽骨吸收[17-18]。Agarwala 等[19]對(duì) 294 名早期 ANFH患者采用阿倫磷酸鈉治療，每位患者每日口服 10 mg·d-1預(yù)防劑量的阿倫磷酸鈉，同時(shí)補(bǔ)充 500～1 000 mg鈣劑和10～20 μg 的維生素D，連續(xù)服用3 a，平均隨訪4 a，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服二磷酸鹽類藥物(阿倫磷酸鈉)能有效抑制股骨頭壞死病程的發(fā)展，改善患肢功能，降低股骨頭塌陷的幾率，減少人工關(guān)節(jié)置換的需求。劉松等[20]對(duì)18例ONFH患者行 PRP 聯(lián)合髖關(guān)節(jié)外科脫位頭頸開窗植骨術(shù)治療，術(shù)后平均隨訪時(shí)間 （12.40±3.12）個(gè)月，末次隨訪時(shí) Harris 評(píng)分較術(shù)前顯著改善，優(yōu)良率達(dá) 90.91%，影像學(xué)評(píng)價(jià)改善率為95.45%，這些數(shù)據(jù)都與本試驗(yàn)結(jié)果阿倫磷酸鈉及PRP能夠有效治療LCPD結(jié)果相一致。

本研究是基于X線掃描以及Ficat分期體系、股骨頭解剖形態(tài)去評(píng)估阿侖膦酸鈉以及PRP對(duì)犬ANFH模型治療的效果，阿倫膦酸鈉組雖然1只犬治療后解剖出現(xiàn)股骨頭表面凹陷，但光滑無骨贅生成，這與C組3只犬出現(xiàn)大面積塌陷且表面粗糙的病變特征存在明顯差異，這可能是由于個(gè)體差異造成的愈合時(shí)間延長，也可能是由于藥物的作用減緩了塌陷的進(jìn)程，這有待深入研究。PRP組中3只犬在治療后影像、解剖結(jié)果都明顯改善，而阿倫磷酸鈉組只有2只犬在治療后得到明顯改善，從數(shù)量上PRP組優(yōu)于阿倫磷酸鈉組，但整體治療數(shù)據(jù)結(jié)果二者差異不顯著。C組的10號(hào)犬與A組的5號(hào)犬股骨頭解剖病變都出現(xiàn)綠豆及米粒大小的小面積塌陷，但DR影像并未發(fā)現(xiàn)它們股骨頭塌陷的病變特征，而C組的7、11號(hào)犬出現(xiàn)大面積塌陷在X線片中卻得到有效診斷，說明DR影像對(duì)小面積股骨頭塌陷敏感度低，那么，是否可以通過建立犬ANFH模型測量DR影像對(duì)犬股骨頭塌陷敏感的臨界值，從而為DR評(píng)估犬LCPD股骨頭塌陷程度開發(fā)新的方法，這還有待深入研究。

4 結(jié) 論

阿侖膦酸鈉及PRP能夠有效治療犬LCPD，但無法區(qū)分阿侖膦酸鈉與PRP的優(yōu)劣性。