聶雪純，李思鵬，劉玉涵，繆衛(wèi)國(guó)，李 瀟

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228）

我國(guó)是天然橡膠消費(fèi)大國(guó)。天然橡膠90%以上的產(chǎn)量都是產(chǎn)自于橡膠樹（Hevea brasiliensis）。該樹是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)云南、廣東和海南均有大面積種植，在東南亞和南美等地區(qū)也廣泛種植。在全球的植膠區(qū)，白粉病是危害橡膠樹較嚴(yán)重的一個(gè)病害[1]。橡膠樹白粉菌（Erysiphe quercicola）是橡膠樹白粉病的病原物，在分類上屬于子囊菌門白粉菌目（Erysiphes），白粉病發(fā)病初期在幼嫩組織以及葉表面會(huì)產(chǎn)生由菌絲產(chǎn)生的白色粉狀物，粉狀物下的葉片會(huì)有病斑出現(xiàn)。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致橡膠樹的花序和葉片畸形，葉片大量脫落[2]。每年橡膠樹白粉病都造成天然橡膠嚴(yán)重的損失[3]。對(duì)植物免疫系統(tǒng)的研究有助于人類利用該機(jī)制來(lái)對(duì)抗植物病害。植物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的防衛(wèi)反應(yīng)包括活性氧水平提高、胼胝質(zhì)積累和超敏反應(yīng)（一種植物組織上局部發(fā)生的細(xì)胞程序性死亡）等。這些防衛(wèi)反應(yīng)可被植物識(shí)別到病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）或病原效應(yīng)子（effectors）而激發(fā)。目前，可激發(fā)植物防衛(wèi)反應(yīng)的病原因子有細(xì)菌鞭毛蛋白的flg22（flagellin domain of a synthetic 22-amino-acid peptide）、幾丁質(zhì)（chitin）和卵菌激發(fā)素INF1等[4]。蛋白MLO（Mildew resistance locus o）在大麥（Hordeum vulgare）上被用作對(duì)抗白粉菌等子囊菌侵染的武器[5]。MLO基因被缺失突變后，大麥獲得了廣譜的白粉菌抗性，表明MLO是一類感病蛋白[5]。BI-1（BAX INHIBITOR-1）和LFG（LIFEGUARD）也被認(rèn)為屬于感病蛋白，具有類似MLO的作用。敲除突變BI-1基因抑制了白粉菌的侵染，而過(guò)表達(dá)BI-1能加速侵染[6]。在哺乳動(dòng)物和植物中，LFG蛋白也被稱為GAAP蛋白（Golgi antiapoptotic proteins），屬于BI-1蛋白亞家族，含有BI-1蛋白功能域。大麥和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中各含有5個(gè)LFG。已證明大麥的LFG蛋白HvLFGa和擬南芥的2個(gè)LFG蛋白AtLFG1和AtLFG2都參與了影響植物和白粉菌的互作，具有負(fù)調(diào)控植物抗白粉病的作用[7]。對(duì)于這些LFG蛋白編碼基因，過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)白粉菌侵染，而沉默會(huì)抑制白粉菌侵染。BI-1具有抗細(xì)胞凋亡活性，而LFG和BI-1之間可能發(fā)生互作，具有協(xié)同抗凋亡活性[8]。AtLBI-1和AtLFG2在擬南芥中可發(fā)生共表達(dá)[7]，為此可以推測(cè)BI-1和LFG蛋白可能共同調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡信號(hào)通路。

在橡膠樹中，前期已通過(guò)生物信息學(xué)方法，鑒定了2個(gè)LFG，包括HbLFG1和HbLFG2[9]。這2個(gè)LFG蛋白編碼基因HbLFG1和HbLFG2的轉(zhuǎn)錄水平在白粉菌侵染前期發(fā)生明顯上調(diào)，尤其HbLFG1上調(diào)更顯著，并且這2個(gè)LFG基因轉(zhuǎn)錄水平與病害發(fā)生程度呈正相關(guān)。在本氏煙草（Nicotiana benthamiana）表達(dá)HbLFG1可抑制疫霉激發(fā)子INF1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫藥劑DTT、TM誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，但不能像BI-1一樣抑制細(xì)胞壞死誘導(dǎo)蛋白（Bax）誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死[10]。在擬南芥Col-0表達(dá)HbLFG1可抑制幾丁質(zhì)（chitin）和細(xì)菌flg22誘導(dǎo)的植物免疫反應(yīng)，并促進(jìn)橡膠樹白粉菌侵染擬南芥Col-0，而野生型的Col-0是不能被該菌侵染的[10]。以上結(jié)果表明，HbLFG1在橡膠樹中是潛在的感病蛋白，影響了植物免疫的激發(fā)水平，但是，目前對(duì)HbLFG2仍缺乏研究和了解。

本研究利用本氏煙瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和擬南芥轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，探究HbLFG2在植物免疫中的作用，以增加對(duì)感病蛋白影響橡膠樹白粉病抗性的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步了解橡膠樹LFG蛋白調(diào)控的植物免疫機(jī)制，為橡膠樹的抗白粉病育種和白粉病新農(nóng)藥研發(fā)靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)使用大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)載體的構(gòu)建，使用根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101作為轉(zhuǎn)化介導(dǎo)體。載體pCAMBIA-35S-FLAG，攜帶INF1基因、Bax基因、pBIN空載體（可表達(dá)GFP基因）的根癌農(nóng)桿菌均由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室提供；含pBIN空載體的擬南芥轉(zhuǎn)化子為實(shí)驗(yàn)室原有植物材料。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)植物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的植物為本氏煙草和Col-0野生型擬南芥。植物養(yǎng)育條件：溫度24 ℃，光照16 h/黑暗8 h。

1.1.3 試劑限制性內(nèi)切酶BamHI（南京，Vazyme）; DNA片段回收試劑盒（上海，TaKaRa）；質(zhì)粒小量提取試劑盒（美國(guó)，Omega）；RNA提取試劑盒（北京，Solarbio）。

1.1.4 自配試劑LB培養(yǎng)基：Tryptone 10 g·L-1、Yeast extract 5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1，調(diào)pH為7（制備固體培養(yǎng)基需要另外加入Agar 15 g·L-1）。0.5 g慶大霉素硫酸鹽，5 mL去離子水（已除菌），振蕩混勻制成慶大霉素溶液，將該溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌，儲(chǔ)存于-20 ℃。0.25 g卡那霉素，5 mL去離子水（已除菌），振蕩混勻制成卡那霉素溶液，將該溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌，儲(chǔ)存于-20 ℃。0.5 g利福平，5 mL DMSO（二甲基亞砜），振蕩混勻制成利福平溶液，將該溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌，遮光，儲(chǔ)存于-20 ℃中。擬南芥轉(zhuǎn)化懸浮液：蔗糖2.5 g、Silwet L-77 12.5 mL、ddH20 50 mL。脫色液：3∶1體積比例的無(wú)水乙醇和冰醋酸混液。苯胺藍(lán)染色液：0.1 g水溶性苯胺藍(lán)、0.1 mol·L-1K2HPO410 mL。DAB染液：吐溫-20 25 mL、NaHPO40.2 g、ddH2O 50 mL、DAB（diaminobezidin-3，3-二氨基聯(lián)苯胺） 0.05 g。20×10-6mol·L-1flg22：0.000 45 g flg22、10 mL ddH2O。

1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化

1.2.1 HbLFG2基因的克隆，重組載體的構(gòu)建以及DH5α轉(zhuǎn)化以橡膠樹總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成橡膠樹的cDNA序列，并以此為模板，用引物對(duì)cDNA進(jìn)行HbLFG2基因PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 ， 56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s（30個(gè)循環(huán)），4 ℃，冷卻10 min。將PCR擴(kuò)增得到的DNA片段進(jìn)行試劑盒回收，隨后，用BamHI將載體pCAMBIA-35S-FLAG切開，再將片段和切開的載體進(jìn)行連接。37 ℃反應(yīng)30 min，再將連接好的質(zhì)粒進(jìn)行大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，涂板點(diǎn)板驗(yàn)證菌落。最后用相同的引物對(duì)菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證是否轉(zhuǎn)化成功。同理，使用同樣的方法，將煙草壞死實(shí)驗(yàn)對(duì)照基因HbLFG1進(jìn)行克隆和載體構(gòu)建。本實(shí)驗(yàn)所用的引物見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化

將含有HbLFG2-FLAG質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，用試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行GV3101農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，得到含有HbLFG2-FLAG質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。把慶大霉素、卡那霉素、利福平這3種抗生素加到用于培養(yǎng)農(nóng)桿菌的液體LB培養(yǎng)基中，備用。將含有目的基因的農(nóng)桿菌，加入5 mL 的含3種抗生素的 LB 培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的菌液轉(zhuǎn)到2 mL離心管中，4 700 r·min-1離心2 min，棄上清，用移 液槍取2 mL 0.01 mol·L-1氯化鎂對(duì)農(nóng)桿菌進(jìn)行吸打懸浮，4 700 r·min-1離心2 min，保留菌塊。再次懸浮農(nóng)桿菌，稀釋菌液到OD600=0.6。向本氏煙的 葉片中注射稀釋后的農(nóng)桿菌緩沖液，標(biāo)記注射區(qū)域，遮光處理48 h，隨后進(jìn)行蛋白表達(dá)驗(yàn)證或進(jìn)行形態(tài)觀察[10]。

1.2.3 蛋白提取和表達(dá)驗(yàn)證將含有目的基因的農(nóng)桿菌注射到煙草葉片上之后，用馬克筆對(duì)注射區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記。遮光過(guò)后，剪下標(biāo)記區(qū)域進(jìn)行蛋白提取。將剪下的葉片組織用液氮進(jìn)行研磨。研磨成粉后，加入到含有植物裂解液的1.5 mL離心管中，在30 min內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行多次振蕩混勻，隨后4 ℃，11 000 r·min-1離心5 min，將上清收集到新的離心管中，再次低溫離心，然后再次收集上清。將100 μL的植物蛋白上清加入蛋白上樣液20 μL，100 ℃處理10 min，此時(shí)的蛋白樣品可以進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。將處理好的蛋白樣加入到SDS-PAGE凝膠電泳的膠孔中，電泳完成后切下蛋白膠，蛋白膠經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜后，獲得含有目的蛋白條帶的PVDF膜。然后對(duì)該膜依次進(jìn)行封閉牛奶，一抗，二抗處理。處理完成后用掃膜儀器進(jìn)行掃描，觀察掃膜結(jié)果。

1.2.4 擬南芥轉(zhuǎn)化子制備將含有目的基因的農(nóng)桿菌保菌液加到含3種抗性的LB培養(yǎng)基擴(kuò)增。4 700 r·min-1離心10 min富集菌體。將富集好的菌體使用轉(zhuǎn)化懸浮液重懸，并稀釋到OD600=0.8。4周齡的擬南芥需要將果莢去除干凈，再將花浸泡在菌懸液處理20 s～30 s，隨后進(jìn)行保濕遮光處理24 h。直至培養(yǎng)處理過(guò)的擬南芥長(zhǎng)出葉片，待苗長(zhǎng)出葉片后提取RNA，通過(guò)RT-PCR得到cDNA，再用引物進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證，標(biāo)記PCR驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性的擬南芥轉(zhuǎn)化子植株。對(duì)轉(zhuǎn)化成功的擬南芥進(jìn)行標(biāo)記，等到其果莢成熟，獲得擬南芥轉(zhuǎn)化子T1代的種子。再將收集到的種子催化成苗，待苗長(zhǎng)出葉片后提取RNA，再次進(jìn)行引物驗(yàn)證，并對(duì)驗(yàn)證得到的擬南芥做標(biāo)記，收集果莢成熟后的種子T2代。此時(shí)的擬南芥轉(zhuǎn)化子種子經(jīng)過(guò)了2代的篩選，能穩(wěn)定遺傳，可以開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)[10]。

1.2.5 胼胝質(zhì)積累實(shí)驗(yàn)苯胺藍(lán)熒光染料可標(biāo)記病原菌PAMPs誘導(dǎo)而積累的胼胝質(zhì)，使其在植物中能被清晰地觀察到。在本氏煙的實(shí)驗(yàn)中，注射pbin-GFP、HbLFG2-FLAG農(nóng)桿菌于葉片，標(biāo)記好區(qū)域，遮光處理24 h，然后用20×10-6mol·L-1flg22處理葉片。flg22處理葉片36 h后，先用脫色液對(duì)對(duì)照及處理的葉片進(jìn)行8 h脫色，接著用苯胺藍(lán)溶液染色8 h染色。把染好色的葉片放在熒光顯微鏡（OLYMPUS CX21，發(fā)射波長(zhǎng)：461 nm）下觀察，選擇DAPI濾光片拍照。照片用 ImageJ軟件來(lái)測(cè)定胼胝質(zhì)積累量。每個(gè)處理使用至少3片葉，并從每個(gè)葉片上隨機(jī)選取3個(gè)區(qū)域進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)照片中每1 mm2面積胼胝質(zhì)累積個(gè)數(shù)。在擬南芥的實(shí)驗(yàn)中，先用20×10-6mol·L-1flg22處理4周齡的擬南芥植株葉片36 h[10]，然后用乙醇乙酸脫色液對(duì)擬南芥葉片進(jìn)行脫色，再將擬南芥葉片放入苯胺藍(lán)溶液中進(jìn)行8 h染色。熒光顯微鏡下觀察，選擇DAPI濾光片，拍照[11-12]。最后用ImageJ軟件測(cè)定胼胝質(zhì)累積量。每個(gè)處理使用至少3片葉，并從每個(gè)葉片上隨機(jī)選取3個(gè)區(qū)域進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)照片中1 mm2面積胼胝質(zhì)累積個(gè)數(shù)。

1.2.6 ROS活性氧積累實(shí)驗(yàn)DAB能與葉片中含有的過(guò)氧化氫反應(yīng)，表現(xiàn)為棕色，觀察到的棕色小塊即積累的活性氧。用水和20×10-6mol·L-1flg22分別處理Col-0野生型擬南芥、GFP擬南芥轉(zhuǎn)化子和HbLFG2擬南芥轉(zhuǎn)化子的葉片表面36 h，2 d后取下葉片放于DAB溶液中避光處理10 h進(jìn)行染色。配置乙醇乙酸脫色液，常溫脫色2 h，再對(duì)樣品進(jìn)行拍照，用ImageJ 軟件計(jì)算照片中活性氧積累面積。樣本重復(fù)葉片數(shù)為9，統(tǒng)計(jì)照片中每片葉子活性氧面積占比。

1.2.7 植物細(xì)胞壞死實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)4周齡的本氏煙葉片的表皮用注射器針頭劃出小傷后，用去除針頭的注射器在葉片傷口處注入農(nóng)桿菌稀釋液或者藥液，遮光處理24～72 h，觀察葉片壞死情況并進(jìn)行明場(chǎng)和紫外光下拍照。藥物DTT的共注射處理是在注射完農(nóng)桿菌48 h后進(jìn)行藥劑注射[10]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理采用軟件SPSS20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)，利用Excel對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行作圖[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbLFG2對(duì)植物免疫反應(yīng)的影響western blot結(jié)果顯示，HbLFG2,GFP蛋白在煙草上均有表達(dá)（圖1-A）。之后，為測(cè)定HbLFG2是否能影響flg22誘導(dǎo)的植物免疫。用水和flg22分別處理空白對(duì)照煙草組織、表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的組織和表達(dá)HbLFG2-FLAG的煙草組織。水處理組為陰性對(duì)照；flg22處理空白對(duì)照煙草組織和表達(dá)GFP的組織為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果（圖1-B,1-C）顯示，在陽(yáng)性對(duì)照的葉片組織中出現(xiàn)大量的胼胝質(zhì)積累，而HbLFG2-FLAG表達(dá)能顯著降低本氏煙上胼胝質(zhì)積累量。說(shuō)明HbLFG2能抑制煙草中flg22誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)產(chǎn)生。

圖1 在本氏煙草中，HbLFG2-FLAG對(duì)flg22誘導(dǎo)產(chǎn)生的胼胝質(zhì)積累的影響

2.2 HbLFG2對(duì)植物防衛(wèi)反應(yīng)的影響圖2-A的結(jié)果顯示HbLFG2擬南芥轉(zhuǎn)化子T2代的基因組中存在HbLFG2，說(shuō)明HbLFG2擬南芥轉(zhuǎn)化子制備成功。對(duì)野生型擬南芥、GFP擬南芥轉(zhuǎn)化子、HbLFG2-FLAG擬南芥轉(zhuǎn)化子進(jìn)行水處理為陰性對(duì)照。flg22處理下，陽(yáng)性對(duì)照Col-0擬南芥和GFP擬南芥轉(zhuǎn)化子的葉片激發(fā)出了大量胼胝質(zhì)。在flg22處理下的HbLFG2-FLAG擬南芥轉(zhuǎn)化子葉片中則只有少量的胼胝質(zhì)積累（圖2-B）。在flg22處理下的胼胝質(zhì)積累量（圖2-C）表明，HbLFG2-FLAG擬南芥轉(zhuǎn)化子與Col-0擬南芥、GFP擬南芥轉(zhuǎn)化子存在顯著差異。這表明HbLFG2可抑制擬南芥中激發(fā)的胼胝質(zhì)產(chǎn)生。

圖2 在擬南芥中，HbLFG2-FLAG對(duì)flg22誘導(dǎo)產(chǎn)生的胼胝質(zhì)積累的影響

2.3 HbLFG2對(duì)植物防御反應(yīng)的影響對(duì)Col-0野生型擬南芥、GFP擬南芥轉(zhuǎn)化子和驗(yàn)證過(guò)的HbLFG2轉(zhuǎn)化子進(jìn)行水處理為對(duì)照。經(jīng)過(guò)活性氧染色可知，作為陰性對(duì)照的水處理，該處理下的野生型擬南芥、GFP轉(zhuǎn)化子和HbLFG2轉(zhuǎn)化子葉片有少量的活性氧積累。作為陽(yáng)性對(duì)照的flg22處理下的未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的擬南芥和GFP轉(zhuǎn)化子葉片，有大面積的活性氧被激發(fā)，而flg22處理下，HbLFG2轉(zhuǎn)化子活性氧積累面積與前兩者相比較?。▓D3-A）。由統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可知，在flg22處理組中，野生型擬南芥和GFP轉(zhuǎn)化子活性氧積累面積占比情況，與HbLFG2-FLAG轉(zhuǎn)化子相比存在顯著差異，這表明HbLFG2減弱了擬南芥中flg22誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧積累（圖3-B）。

圖3 在擬南芥上，HbLFG2-FLAG對(duì)flg22誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧積累的影響

2.4 HbLFG2基因?qū)NF1,Bax,DTT所誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死的影響疫霉激發(fā)素INF1，細(xì)胞壞死誘導(dǎo)蛋白Bax和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫劑DTT能在植物上造成細(xì)胞程序性死亡[13-15]。在本氏煙草上，測(cè)試HbLFG2對(duì)這些因子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是否具有抑制作用。

對(duì)HbLFG1，HbLFG2，GFP蛋白進(jìn)行western blot表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)HbLFG1，HbLFG2，GFP蛋白在煙草上發(fā)生了表達(dá)（圖4-A）。作為單獨(dú)注射對(duì)照，在煙草葉片上單獨(dú)注射表達(dá)INF1，Bax基因的農(nóng)桿菌位點(diǎn)以及藥物DTT均發(fā)生了壞死，單獨(dú)注射表達(dá)GFP，HbLFG1，HbLFG2基因的農(nóng)桿菌位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生壞死，說(shuō)明對(duì)照處理正常（圖4-B，表2）。

圖4 在本氏煙中，HbLFG2基因?qū)NF1,Bax,DTT所誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死的影響

表2 壞死發(fā)生情況統(tǒng)計(jì)

在INF1的共注射實(shí)驗(yàn)中，作為INF1的共注射對(duì)照，將含有GFP基因的農(nóng)桿菌與含INF1基因的農(nóng)桿菌共注射，注射位點(diǎn)均壞死，這說(shuō)明載體并不會(huì)影響INF1誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死；INF1與HbLFG1基因共表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)HbLFG1能夠抑制INF1導(dǎo)致的細(xì)胞壞死，這與Li等[10]的報(bào)道結(jié)果相同。而HbLFG2與INF1基因共表達(dá)則不能抑制INF1誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死（圖4-B，表2）。

在Bax的共注射實(shí)驗(yàn)中，作為Bax的共注射對(duì)照，將含有空載pBIN載體的農(nóng)桿菌與含Bax基因的農(nóng)桿菌共注射，注射位點(diǎn)均壞死，說(shuō)明載體并不會(huì)影響B(tài)ax誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死；Bax與HbLFG1基因共表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)HbLFG1不能夠抑制Bax導(dǎo)致的細(xì)胞壞死，與Li等[10]的報(bào)道結(jié)果一致；但HbLFG2與Bax基因共表達(dá)，細(xì)胞壞死受到抑制（圖4-B，表2）。

在藥物DTT的共注射實(shí)驗(yàn)中，作為DTT的共注射對(duì)照，將含有空載pBIN載體的農(nóng)桿菌間隔48 h后與藥物DTT共注射，注射位點(diǎn)均壞死，說(shuō)明載體并不會(huì)影響DTT誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死；DTT與HbLFG1基因共表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)HbLFG1可以抑制DTT導(dǎo)致的細(xì)胞壞死這與Li等[10]的報(bào)道結(jié)果相吻合；但HbLFG2與藥物DTT共注射的位點(diǎn)壞死不受抑制（圖4-B，表2）。

3 討 論

橡膠樹中存在2個(gè)預(yù)測(cè)的LFG蛋白HbLFG1和HbLFG2，2021年文獻(xiàn)[10]報(bào)道，HbLFG1在本氏煙草和擬南芥的表達(dá)可以抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫引起的細(xì)胞死亡。在本研究中，HbLFG2表現(xiàn)出具有類似HbLFG1的功能，可以抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)，因此該蛋白可能促進(jìn)植物的感病性，是潛在的感病蛋白。

類似HbLFG1[10]，在煙草或擬南芥中過(guò)表達(dá)HbLFG2可以抑制flg22激發(fā)的胼胝質(zhì)，減少了活性氧的產(chǎn)生。植物感知flg22的是激酶類受體FLS2和BAK1[16]，并且flg22可以誘導(dǎo)植物中免疫信號(hào)分子水楊酸的積累[17]，胼胝質(zhì)的積累發(fā)生在細(xì)胞壁，水楊酸能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)胼胝質(zhì)的積累并增強(qiáng)活性氧爆發(fā)[12,18]。而擬南芥LFG/GAAP蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫條件下可以抑制水楊酸產(chǎn)生[18]，植物BI-1也能抑制水楊酸誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死[19]。據(jù)此，筆者推測(cè)HbLFG2或HbLFG1蛋白的積累可能干擾了flg22誘導(dǎo)的水楊酸途徑，從而產(chǎn)生抑制防衛(wèi)反應(yīng)的效果。

在植物中，Bax、DTT和INF1造成細(xì)胞壞死的原因不完全相同。Bax能引起活性氧積累，進(jìn)一步引起細(xì)胞離子滲漏、細(xì)胞色素c釋放和脂質(zhì)氧化反應(yīng)[19]，DTT會(huì)造成過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫[20]，而INF1會(huì)激活絲裂原蛋白激酶通路和誘導(dǎo)活性氧迸發(fā)[21]。植物BI-1可能主要通過(guò)降低改變細(xì)胞鈣離子流、抑制細(xì)胞色素c的釋放和脂質(zhì)氧化反應(yīng)來(lái)抑制細(xì)胞壞死[19]。植物BI-1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，因此，還可能通過(guò)降低對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的敏感度來(lái)干擾Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，鑒于細(xì)胞會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫條件下啟動(dòng)自動(dòng)死亡程序[22-23]。類似的，擬南芥LFG蛋白LFG1/GAAP1和LFG3/GAAP3也定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫條件下抑制細(xì)胞壞死[23]，而且擬南芥LFG通過(guò)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受體IRE1互作，負(fù)調(diào)控IRE1途徑來(lái)影響對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的敏感度，借此發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞壞死的作用[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)HbLFG2可以抑制Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，但不能抑制DTT和INF1誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。相比之下，HbLFG1不能抑制Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，卻能抑制DTT和INF1誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。這些結(jié)果表明2個(gè)橡膠樹LFG蛋白雖然都具有抑制植物細(xì)胞壞死的功能，但二者作用的方式不太相同。二者在功能上可能互相補(bǔ)充，共同調(diào)節(jié)植物免疫。