夏影影，于燕燕，陶 均

（海南大學(xué) 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室/熱帶作物學(xué)院，?？?570228）

調(diào)查結(jié)果表明，我國農(nóng)業(yè)土壤的鎘（Cd）含量在過去一段時間內(nèi)呈急劇增加態(tài)勢[1-2]。由于鎘的不可降解性，土壤鎘污染已成為嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)污染問題，并威脅著人們的身體健康，急需高效的修復(fù)措施[3]。在土壤重金屬污染修復(fù)策略中，生物修復(fù)被廣泛關(guān)注。其中，微生物修復(fù)通過土壤中重金屬的吸附富集，溶解沉淀以及氧化還原等機(jī)理，降低或去除土壤中過量的重金屬[4]。不同的微生物可以通過不同的機(jī)制來修復(fù)土壤鎘污染，如吸收和螯合[5]、胞內(nèi)積累[6]以及礦化[7]等。能修復(fù)鎘污染的微生物主要包括細(xì)菌、真菌與藻類。土壤細(xì)菌也可以通過改變土壤環(huán)境條件，產(chǎn)生促進(jìn)植物生長物質(zhì)等多種方式以提高土壤重金屬遷移率和生物利用度[8]。在高鎘的環(huán)境中，通過加入可高抗鎘并具有鎘吸附能力的細(xì)菌可修復(fù)土壤的鎘污染[9]。因此，獲得高抗鎘菌是利用細(xì)菌修復(fù)鎘污染土壤的前提。但大多已報道的抗性菌株并沒有表現(xiàn)出特別高的鎘抵抗能力[10-11]。此外，多數(shù)菌株只對少數(shù)重金屬具有抗性[10]，而土壤重金屬污染多為多金屬污染[12]，這導(dǎo)致細(xì)菌在重金屬環(huán)境中難以生存或繁殖，因此很難達(dá)到理想的修復(fù)效果。筆者所在實驗室前期也從海南昌江礦區(qū)分離獲得抗鎘、銅、鋅、錳、鈷等多種重金屬的陰溝腸桿菌Cu6[13]，并通過馴化獲得了其他重金屬抗性未發(fā)生顯著變化而抗鎘能力顯著增強(qiáng)的菌株LPY6[14]。本研究以糧食作物小麥（Triticum aestivum）為植物材料，擬分析LPY6能否緩解鎘對小麥生長的抑制作用以及可能的機(jī)制，旨在為進(jìn)一步開發(fā)鎘污染修復(fù)工程菌提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株供試菌株為筆者所在實驗室前期從海南昌江石碌礦區(qū)分離出的陰溝腸桿菌Cu6[13]以及馴化后得到的高抗鎘菌株LPY6[14]。

1.2 試劑鹽酸（HCl，優(yōu)級純）、硝酸（HNO3，優(yōu)級純）、水合氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）、硫酸銅（CuSO4）、硫酸鉛（PbSO4）和氯化錳（MnCl2）、過氧化氫（H2O2）、二乙三胺五乙酸（DTPA）、三乙醇胺（TEA）和氯化鈣（CaCl2）。所使用試劑均購自廣州化學(xué)試劑公司。

1.3 培養(yǎng)基Luria-Bertani （LB）培養(yǎng)基（液體）：10 g Tryptone ，10 g NaCl ，5 g Yeast Extract，蒸餾水1 L。LB固體培養(yǎng)基： 液體LB+1.5%瓊脂。含金屬離子的LB培養(yǎng)基加相應(yīng)濃度的各種金屬。MS培養(yǎng)基為實驗室購買的粉末狀成品，使用時可以直接溶于超純水中，本實驗使用1/4含量的MS液體培養(yǎng)基。

1.4 植株供試植株為小麥（T.aestivum），品種為‘銅麥6號’，購于陜西大唐種業(yè)股份有限公司。

1.5 菌株LPY6對金屬抗性的測定細(xì)菌鎘最低抑制濃度（抑制細(xì)菌生長的最低鎘濃度）和最大耐受濃度（仍有部分細(xì)菌生長的最大鎘濃度）的測定。Cd2+、Pb2+、Cu2+和Mn2+的質(zhì)量濃度均設(shè)置為0、300、500、1 000、2 000、3 000、5 000 mg·L-1，然后將LPY6菌株分別接種到含各濃度不同金屬的LB液體（30 ℃，180 r·min-1）和LB固體培養(yǎng)基（30 ℃）中，每組處理設(shè)置3個重復(fù)，觀察并記錄菌株生長情況。

1.6 小麥種子萌發(fā)實驗將濾紙放置在培養(yǎng)皿中，添加20 mL含不同濃度（0、50、100、200、300、500 mg·L-1）CdCl2·2.5H2O溶液到培養(yǎng)皿中，待濾紙完全浸濕后，選取較為飽滿且大小較一致的小麥種子放置于濾紙上（每皿放12粒）。蓋上蓋子，在光照培養(yǎng)箱里靜置3～5 d （28 ℃，16 h光照、8 h黑暗，80%濕度），以伸出種皮的胚根等于或長于種子長度為標(biāo)準(zhǔn)，確定計算種子發(fā)芽率。然后，以顯著抑制種子萌發(fā)的鎘濃度來處理種子，分析LPY6是否有緩解鎘對種子萌發(fā)的影響，設(shè)置4個處理（每處理3個重復(fù)）：CK（對照：1/4 MS培養(yǎng)基）、Cd、Cd+Cu6、Cd+LPY6（CdCl2·2.5H2O：500 mg·L-1，菌液濃度：OD600=0.1），進(jìn)行萌發(fā)率統(tǒng)計（種子發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%）。

1.7 小麥盆栽實驗首先檢測小麥種子在土壤中的耐鎘能力。采用營養(yǎng)土與紅土混合土壤（V營養(yǎng)土∶V紅土= 1∶2），干燥一段時間（室溫、通風(fēng)、30 d）待土壤平衡穩(wěn)定后，分裝至聚乙烯塑料盆（7 cm×7 cm×8 cm），每盆約110 g，設(shè)置土壤鎘含量為0、360、720、1 000、1 500、1 800、2 200、2 500 mg·kg-1，每處理3個重復(fù)。挑取顆粒飽滿小麥種子進(jìn)行育苗，4 d后移栽長勢一致的小麥幼苗于處理后的土壤中，每盆6棵（14 h光照、8 h黑暗，26 ℃）。每4天觀察記錄植物苗的生長狀況，直至16 d。小麥生長在含有不同鎘含量的土壤中。然后以此鎘含量（1 000、1 500 mg·kg-1）來分析LPY6是否有緩解鎘對小麥的毒害作用，設(shè)置9個處理（每處理3個重復(fù)）：鎘和細(xì)菌2個因素，每個因素3個水平（鎘濃度：0、1 000、1 500 mg·kg-1；細(xì)菌：不加菌、加Cu6、加LPY6），完全隨機(jī)設(shè)計。菌液終濃度OD600=0.1。觀察并統(tǒng)計小麥生長狀況。

1.8 測定指標(biāo)與方法

1.8.1 小麥生物量、生長指標(biāo)測定按步驟1.7處理，待小麥生長至14 d后，小心分別取出各處理的小麥苗，將其根部沖洗干凈，然后擦拭干凈，進(jìn)行稱重、記錄鮮質(zhì)量。測量株高，根長以及根毛數(shù)并記錄。然后將小麥苗整株放入65 ℃烘箱，3 d后取出（此時已完全烘干），記錄其干質(zhì)量。

1.8.2 小麥苗鎘含量測定采用原子吸收光譜法測定[15]。將上述烘干的小麥苗充分研磨粉碎，每個處理稱取0.1 g置于試管中，分別加入1 mL HNO3和0.5 mL的H2O2，設(shè)空白對照。用安東帕Multiwave 7 000 超級微波消解系統(tǒng)消解（海南大學(xué)分析測試中心）。消解樣品轉(zhuǎn)入15 mL離心管，分別加超純水定容至10 mL，使用原子吸收光譜儀（海南大學(xué)分析測試中心）測定鎘含量。

1.8.3 培養(yǎng)基中游離鎘濃度測定LPY6單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)（30 ℃，180 r·min-1），16 h后按1∶1 000（體積比）的比例轉(zhuǎn)接于新鮮預(yù)熱的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600=0.8），制備OD600=2.0的菌懸液。以2 %的接種量將LPY6菌液接種到含不同質(zhì)量濃度鎘（0、150、250、500、1 250、1 500 mg·L-1）的液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h，以不接菌空白培養(yǎng)基為對照，每組處理3個重復(fù)，每隔12 h取菌液，菌液先測OD600值，然后進(jìn)行離心（10 000 r·min-1,5 min），使用原子吸收光譜儀對上清液中的鎘含量進(jìn)行測定。計算LPY6菌降低游離鎘的能力：

式中：q為吸附率；C1為空白對照組上清液中鎘的濃度；C2菌處理組上清液中鎘的濃度；單位：mg·L-1。

1.8.4 土壤有效鎘含量測定采取DTPA作提取劑用原子吸收光譜法測定土壤中有效態(tài)鎘[15]。設(shè)置土壤鎘含量為0、360、720、1 000、1 500mg·kg-1。設(shè)置4個處理：CK（對照，不含鎘），只有鎘，鎘加Cu6，鎘加LPY6分別處理土壤。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。17 d后，將處理的土壤風(fēng)干后過篩（2 mm）。1 g土壤加入25 mL DTPA提取劑，放入培養(yǎng)箱（25 ℃，180 r·min-1）, 2 h后取樣，上清液過濾（0.22 μm）后，加1% HCl定容至10 mL，火焰法測得樣品的鎘含量。以DTPA為對照，土壤中有效態(tài)鎘含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w表示：

式中：C為鎘校準(zhǔn)曲線上查的質(zhì)量濃度（mg·L-1）；C0為空白對照濃度；V2為定容體積（mL）；V為樣品所使用的提取液體積；V1為提取液體積;m：為試樣質(zhì)量（g）。

1.9 數(shù)據(jù)分析采用 GraphPad Prism 9進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖，實驗重復(fù)3次，計算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LPY6具有多種重金屬抗性鎘（CdCl2·2.5H2O）、銅（CuSO4）、鉛（PbSO4）和錳（MnCl2）的抗性實驗表明，菌株LPY6對4種金屬均具有較強(qiáng)抗性(耐性)。LPY6對 Cd2+的最小抑制質(zhì)量濃度為2 500 mg·L-1，Cu2+為400 mg·L-1，Mn2+為500 mg·L-1。LPY6對Cd2+的最大耐受質(zhì)量濃度為3 000 mg·L-1，Cu2+為 450 mg·L-1，Mn2+為2 000 mg·L-1。實驗中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度高于1 000 mg·L-1的含鉛培養(yǎng)液容易生成白色沉淀，所以無法確定Pb2+對LPY6的最小抑制濃度以及LPY6對Pb2+的最大耐受濃度，但菌株LPY6對鉛有較高抗性（＞1 000 mg·L-1）。

2.2 LPY6緩解鎘對小麥種子萌發(fā)的抑制作用

為分析LPY6是否具有緩解鎘污染的潛力，首先找出抑制小麥種子發(fā)芽的臨界CdCl2·2.5H2O質(zhì)量濃度為500 mg·L-1后，選用此濃度進(jìn)行種子萌發(fā)實驗。如圖1所示，小麥種子在無鎘條件下，其萌發(fā)率約為80%；單獨添加500 mg·L-1CdCl2·2.5H2O時，種子萌發(fā)率顯著被抑制；加鎘同時添加Cu6時，萌發(fā)率沒有明顯提高；但同時添加LPY6和鎘時，萌發(fā)率恢復(fù)到65%左右，只是萌發(fā)速度比對照要慢，結(jié)果說明，LPY6具有一定的緩解鎘抑制小麥種子萌發(fā)的能力。

圖1 LPY6緩解鎘對小麥種子萌發(fā)的抑制作用

2.3 LPY6對鎘毒害小麥幼苗生長的緩解作用

用盆栽實驗來分析LPY6緩解鎘毒害小麥的作用。同萌發(fā)實驗一樣，首先測定盆栽條件下顯著抑制小麥生長（株高、葉長和葉色）的土壤鎘含量為1 000 mg·kg-1，導(dǎo)致小麥枯黃死亡的土壤鎘含量為1 500 mg·kg-1。因此選擇1 000和1 500 mg·kg-1作為后續(xù)實驗。如圖2所示，鎘處理土壤中小麥幼苗的生長明顯受到抑制，LPY6緩解了鎘對小麥幼苗生長的抑制作用。當(dāng)土壤鎘含量為1 000 mg·kg-1時，解毒效果較好，但Cu6沒有明顯降低鎘對小麥幼苗生長抑制的作用（圖2-a）。當(dāng)土壤鎘含量為1 000和1 500 mg·kg-1時，LPY6對小麥的減毒效果如下：（1） LPY6增加了小麥株高（圖2-b），根長（圖2-c）以及根毛數(shù)（圖2-d），且當(dāng)土壤鎘含量為1 000 mg·kg-1時，效果比較明顯。（2）LPY6明顯增加了小麥的鮮質(zhì)量（圖2-e）與干質(zhì)量（圖2-f），且在土壤鎘含量為1 000 mg·kg-1時效果較好。（3）LPY6降低了小麥幼苗的鎘含量（圖2-g），當(dāng)土壤鎘含量為1 000 mg·kg-1時，對小麥的減毒效果較好。

圖2 LPY6對鎘抑制小麥生長的緩解作用

2.4 LPY6對培養(yǎng)基中游離Cd2+濃度的影響具重金屬抗性的微生物一般對此金屬有吸附能力，能夠通過細(xì)胞膜官能團(tuán)將重金屬離子吸附在細(xì)胞表面或通過一系列生命活動將重金屬離子富集在細(xì)胞內(nèi)[16]。如圖3所示，具有高鎘抗性的LPY6能降低培養(yǎng)基中游離鎘的濃度。在含150 mg·L-1鎘的LB培養(yǎng)液中，鎘對LPY6生長抑制作用弱，LPY6生長良好，在48 h時，LPY6生長處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)液中鎘含量降至100 mg·L-1，降低率為33%（圖3 -a）。在含250 mg·L-1鎘的LB培養(yǎng)液中，LPY6生長依舊沒有受到顯著抑制，生長良好；在48 h時，LPY6生長處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)液中鎘含量降至180 mg·L-1，降低率為28%（圖3-b）。在含500 mg·L-1鎘的LB培養(yǎng)液中，鎘對LPY6的生長表現(xiàn)出抑制作用，在48 h時，LPY6生長處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)液中鎘含量降至385 mg·L-1，降低率為23%（圖3-c）。在含1 250 mg·L-1鎘的LB培養(yǎng)液中，鎘對LPY6生長有抑制作用，在36 h時OD值最大，培養(yǎng)液中鎘含量降低至633 mg·L-1，降低率為49%（圖3-d）。在含1 500 mg·L-1鎘的LB培養(yǎng)液中，鎘對LPY6的生長抑制作用比較明顯，在36 h時OD值最大，培養(yǎng)液中鎘含量降低至930 mg·L-1，降低率為38%（圖3-e）。這說明LPY6可以減少培養(yǎng)基中游離鎘的含量。

圖3 LPY6在含不同濃度鎘的培養(yǎng)基中的生長情況及對游離鎘濃度的影響

2.5 LPY6對土壤中有效鎘的影響小麥盆栽實驗測定小麥種子在土壤中的耐鎘能力為1 000 mg·kg-1。因此筆者分析了土壤鎘含量為360 、720、1 000和1 500 mg·kg-1時LPY6對土壤中有效鎘的影響。如圖4所示，在以上鎘含量的土壤中，外施LPY6均可以使土壤中有效鎘含量減少，但Cu6幾乎沒有降低土壤有效鎘的能力。

圖4 LPY6對土壤中有效鎘的影響

3 討 論

本研究分析了LPY6在小麥上的作用，發(fā)現(xiàn)其具有緩解鎘對小麥萌發(fā)和生長抑制作用的能力，不僅可以增加鎘環(huán)境中小麥的株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，還能增加根長和根的數(shù)目。更重要的是，LPY6能降低植物體內(nèi)鎘的含量，說明LPY6具有直接或間接抑制鎘進(jìn)入植物體內(nèi)的作用。產(chǎn)生這種作用的原因可能是LPY6降低了土壤中可利用的鎘含量或降低了植物吸收鎘的能力。為此筆者分析了LPY6是否對其生存環(huán)境中自由鎘（可利用鎘）的含量有影響。在液體培養(yǎng)基中，LPY6能夠顯著降低游離鎘的濃度，表明其可能具有高效的鎘吸附、沉淀或吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力。在土壤中，LPY6同樣可以顯著減少有效鎘的含量。這可能是LPY6緩解鎘毒害作用的原因。但LPY6是通過吸附、沉淀還是吸收作用來降低環(huán)境中有效鎘

的濃度還不清楚。在實驗過程中，沒有發(fā)現(xiàn)LPY6有促進(jìn)明顯可見的沉淀形成的能力，通過沉淀作用來降低環(huán)境有效鎘濃度的可能性不大。在環(huán)境中溶液只有水時，菌株LPY6也能緩解鎘對小麥種子萌發(fā)的抑制作用。因此，LPY6也可能通過改變根際環(huán)境來降低植物吸收鎘的能力[17]。

綜上所述，菌株LPY6很有可能通過吸附或內(nèi)吸作用降低環(huán)境中可利用鎘的含量來緩解鎘對植物生長的毒害作用，也可能通過改變植物根際環(huán)境來降低其鎘吸收能力，保護(hù)植物在高鎘環(huán)境中的生長，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。雖然LPY6離應(yīng)用還有很多問題要解決，但是本研究發(fā)現(xiàn)其具有在土壤中緩解鎘對植物的毒害作用，表明其可能具有鎘污染修復(fù)的潛力，為進(jìn)一步開發(fā)高效的修復(fù)工程菌奠定了基礎(chǔ)。