◎ 王乾麗，黃永橋，簡(jiǎn)銀池，扶 勝，朱明燕

（1.貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽(yáng) 550000；2.食品安全與營(yíng)養(yǎng)（貴州）信息科技有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550000）

棉酚俗稱棉毒素，是錦葵科棉屬植物色素腺產(chǎn)生的多酚二萘衍生物[1]，易溶于丙酮、乙腈等有機(jī)溶劑[2]。研究表明，游離棉酚是一種神經(jīng)性、血管性、細(xì)胞性有毒物質(zhì)[3]，人們食用含有棉酚的食物后可引起低血鉀癥，損傷內(nèi)臟器官以及可能導(dǎo)致不孕等癥狀[4-6]。我國(guó)是食用菌栽培生產(chǎn)大國(guó)，食用菌的培養(yǎng)基材料一般為有機(jī)廢料或其副產(chǎn)品，如鋸末、玉米稈、棉稈、果殼、茶副產(chǎn)品等，而棉籽殼作為萬(wàn)能的培養(yǎng)基被廣泛應(yīng)用于食用菌的栽培中，棉籽殼中含有大量的棉酚，食用菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)吸收富集棉籽殼中的游離棉酚，人們食用含有棉酚的食用菌后可能會(huì)影響身體健康。因此對(duì)食用菌中的游離棉酚進(jìn)行檢測(cè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，關(guān)于研究食用菌中棉酚的檢測(cè)方法較少，也未有相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，棉酚檢測(cè)方法采用比色法、分光光度法、高效液相色譜法等，以上方法存在方法選擇性不強(qiáng)、操作復(fù)雜、基質(zhì)干擾大，測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確的問(wèn)題，高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度好等特點(diǎn)，近幾年也被廣泛應(yīng)用于棉酚的檢測(cè)，研究較多的是棉酚在動(dòng)物源食品、植物源食品、農(nóng)副產(chǎn)品以及飼料中的檢測(cè)，但采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食用菌中的游離棉酚較少。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1290-6470超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有ESI源（美國(guó)Agilent公司）；攪拌機(jī)Blixer3（法國(guó)ROBOT COUPA公司）；LT2002電子天平（常熟市天量?jī)x器有限公司）；離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.1.2 主要試劑

棉酚（純度＞95%，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；丙酮（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲酸（色譜純，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；乙酸銨（分析純、西亞試劑）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，純度36.0%～38.0%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取10 mg棉酚（精確至0.01 mg）于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解混勻并定容至刻度線，配制成質(zhì)量濃度為1 000.0 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要移取不同標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于棕色容量瓶中，避光備用。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)Agilent公司）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水（含2 mmol·L-1乙酸銨）溶液，流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度表

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：4.5 kV；霧化器壓力：40 psi；干燥氣流速：10 L·min-1；干燥氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：10 L·min-1；鞘氣溫度：300 ℃；其他質(zhì)譜條件見表2。

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)表

1.5 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.01 g）搗碎后的組織樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入15 mL丙酮-鹽酸（0.5 mol·L-1）-水（13∶1∶6，v/v/v）混合溶劑，加入1粒陶瓷均質(zhì)子，渦旋振蕩20 min后離心，取出上清液，用10 mL提取液重復(fù)提取一次，用提取液定容至25 mL。靜置片刻后，取上清液過(guò)0.22 μm PTFE濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取液的選擇

不同提取液的提取效率是不同的，提取液的選擇除了要考慮目標(biāo)化合物的理化性質(zhì)外，還要考慮不同基質(zhì)、提取量、提取環(huán)境等因素。張文華等[7]比較了丙酮和乙腈的提取效率，其中以丙酮-水混合溶劑的提取效果較理想。張靜等[8]比較了游離棉酚在純丙酮溶液、丙酮-水溶液、丙酮-磷酸溶液中的穩(wěn)定性差異，其中丙酮水的變異系數(shù)較小，穩(wěn)定性好。本文比較了丙酮-水（7∶3，v/v）、丙酮、丙酮冰乙酸、丙酮-鹽酸-水（13∶1∶6，v/v/v）的提取效率。由表3可知，丙酮-水和丙酮-鹽酸-水的提取效率較好，同時(shí)考慮棉酚為多酚化合物在偏酸性環(huán)境中降解不明顯，穩(wěn)定性高，因此本試驗(yàn)樣品前處理提取液選定丙酮-鹽酸-水。

表3 不同提取溶劑回收率比較表

2.1.2 提取液最佳鹽酸濃度的選擇

棉酚的穩(wěn)定性受pH的影響，本實(shí)驗(yàn)就鹽酸濃度對(duì)回收率的影響及其精密度進(jìn)行了比較，將濃鹽酸稀釋成0.1 mol·L-1、0.2 mol·L-1、0.5 mol·L-1、0.8 mol·L-1和1.0 mol·L-1共5個(gè)濃度，與丙酮和水配制成丙酮-鹽酸-水（13∶1∶6，v/v/v）的混合提取液，在空白香菇中添加2.5 ng·mL-1棉酚，用上述不同鹽酸濃度的混合溶液提取，依次進(jìn)樣測(cè)定回收率，每個(gè)樣品做平行試驗(yàn)6次。由表4可知，當(dāng)鹽酸濃度為0.5 mol·L-1時(shí)，回收率最高，隨著鹽酸濃度的增加，回收率開始降低，當(dāng)鹽酸濃度為1.0 mol·L-1時(shí)，回收率降至60.4%。

表4 不同鹽酸濃度下香菇提取液的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（n=6）

為選擇更合適的提取液，本文選取陰性香菇樣品，添加0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1共3個(gè)不同濃度棉酚，每個(gè)濃度分別用鹽酸濃度為0.4 mol·L-1、0.5 mol·L-1、0.6 mol·L-1的丙酮-鹽酸-水（13∶1∶6，v/v/v）混合提取液充分提取，3個(gè)鹽酸濃度混合提取液的回收率都比較理想，鹽酸濃度為0.5 mol·L-1時(shí)回收率略高，比較3個(gè)濃度的回收率精密度，當(dāng)鹽酸濃度為0.4 mol·L-1時(shí)各添加量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%～8.9%，鹽酸濃度為0.5 mol·L-1時(shí)各添加量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%～6.1%，鹽酸濃度為0.6 mol·L-1時(shí)各添加量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.8%～9.8%，即鹽酸濃度為0.5 mol·L-1時(shí)的回收率精密度較好，說(shuō)明提取液為丙酮-鹽酸（0.5 mol·L-1）-水（13∶1∶6，v/v/v）時(shí)，穩(wěn)定性更好，見表5。

表5 3種不同鹽酸濃度的回收率和精密度表（n=6）

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限

本方法采用基質(zhì)工作曲線作為定量曲線對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)償，結(jié)果表明，棉酚在0.25～25.00 μg·L-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.997，方法的檢出限（S/N=3）為1.0 μg·kg-1，定量限（S/N=10）為3.0 μg·kg-1，結(jié)果見表6。

表6 棉酚的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、檢出限及定量限表

2.2.2 加標(biāo)回收及精密度考察

選取香菇、平菇和金針菇陰性樣品，分別添加2 μg·kg-1、4 μg·kg-1、10 μg·kg-13個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化條件進(jìn)行提取和分析。如表7所示，方法的平均回收率為86.1%～99.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～8.2%，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足食用菌樣品中痕量游離棉酚的含量測(cè)定。

表7 食用菌中樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表（n=6）

3 結(jié)論

本研究針對(duì)食用菌具有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)及棉酚易氧化降解的特點(diǎn)，對(duì)前處理提取液進(jìn)行了優(yōu)化，建立了食用菌中游離棉酚殘留量的分析檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)的樣品前處理步驟簡(jiǎn)單省時(shí)，具有易用性和較高分析效率，該方法回收率高，檢出限低、靈敏度和重現(xiàn)性好，能夠滿足食用菌中痕量棉酚檢測(cè)要求，為食用菌的安全監(jiān)管提供可靠的技術(shù)支撐。