◎ 徐哲萱，楊海龍

（溫州大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

在微生物發(fā)酵過程中，微生物可能對植物源基質(zhì)中的活性物質(zhì)進(jìn)行一系列氫化、去糖基化、脫脂等反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對功能活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和利用[1]。真菌固態(tài)發(fā)酵常用來增加植物源材料的營養(yǎng)價(jià)值，如提高總酚、黃酮類化合物含量[2-3]，水分、溫度和發(fā)酵時(shí)間等發(fā)酵工藝參數(shù)直接影響著發(fā)酵產(chǎn)物中功能性成分含量及其生物活性[4-5]。梅玉立[6]在研究中發(fā)現(xiàn)，桑葉經(jīng)最優(yōu)發(fā)酵條件處理后生物堿含量和黃酮含量與發(fā)酵前相比分別增加了26.53%和29.56%，為桑葉活性成分的開發(fā)利用提供了參考。曹璐蕾[7]將由最優(yōu)發(fā)酵工藝獲得的大豆加工副產(chǎn)物制作成飼料飼喂肉雞，增強(qiáng)了肉雞的免疫力。夏雨等[8]采用釀酒酵母等多種益生菌復(fù)合發(fā)酵苦蕎和鐵皮石斛葉兩種原料，以酒精度和總酸含量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化苦蕎石斛葉發(fā)酵酒的生產(chǎn)工藝，結(jié)果表明其最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間9 d，接種量1.5%，發(fā)酵溫度32 ℃，白砂糖添加量18%，在此條件下開發(fā)出了風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富的苦蕎石斛葉發(fā)酵酒 。因此，發(fā)酵工藝優(yōu)化是一種最大化提升發(fā)酵效果的有效手段。

米曲霉是傳統(tǒng)發(fā)酵和食品加工中的重要菌種[9]，應(yīng)用于醬油[10]、大豆醬[11]和白酒等傳統(tǒng)食品生產(chǎn)中[12]的歷史較為悠久。近些年，隨著人們健康意識的增強(qiáng)，研究者開始關(guān)注米曲霉發(fā)酵在提升發(fā)酵產(chǎn)物功能活性方面的應(yīng)用，如抗氧化[13]、降血糖[14]等。研究表明，米曲霉在固態(tài)發(fā)酵過程中能產(chǎn)生多種水解酶，如纖維素酶和果膠酶等[15]，產(chǎn)生的酶可降解植物細(xì)胞壁從而促進(jìn)有效成分的釋放，并可能對其中的成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，提高其生物活性。本研究通過單因素試驗(yàn)，確定初始含水率（v/w）、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間的適宜范圍，再以α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標(biāo)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)獲得米曲霉發(fā)酵鐵皮石斛葉的最優(yōu)條件，以期為高活性鐵皮石斛葉制劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鐵皮石斛葉，采收于浙江省樂清市綠豐鐵皮石斛種植專業(yè)合作社，55 ℃干燥后壓碎；米曲霉（Aspergillus oryzae）CGMCC 23295，溫州大學(xué)發(fā)酵工程研究室篩選，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心。p-硝基苯酚葡萄糖苷（4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）、α-Glucosidase，購自美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BT124S型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ-300VDV超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FW80粉碎機(jī)，江陰市保利科研儀器有限公司；HH-4A數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；TDL-80-2B低速離心機(jī)，上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；GXZ-260A光照培養(yǎng)箱，寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司；Telstar LyoQuest-85冷凍干燥機(jī)，泰事達(dá)科技公司。

1.3 發(fā)酵方法

1.3.1 米曲霉菌種活化和種子制備

將保藏的米曲霉菌種接種于豆芽培養(yǎng)基（新鮮豆芽20 g蒸煮取汁、葡萄糖2 g、蛋白胨0.2 g、磷酸二氫鉀0.06 g、硫酸鎂0.03 g、瓊脂2 g、水100 mL），30 ℃培養(yǎng)3 d。活化后的菌種接種于液體豆芽培養(yǎng)基，30 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)3 d制成種子液。

1.3.2 鐵皮石斛葉的固態(tài)發(fā)酵

稱取干燥鐵皮石斛葉碎片20 g置于三角瓶內(nèi)，加入葡萄糖0.8 g，水20 mL，配制成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后按12.5%的接種量接入米曲霉種子液，攪拌均勻，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)。以鐵皮石斛葉醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制活性為考察指標(biāo)，以初始含水率、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為單因素變量進(jìn)行試驗(yàn)。發(fā)酵溫度固定在30 ℃，發(fā)酵時(shí)間固定在4 d，設(shè)置初始含水率為40%、50%、60%、70%、80%；初始含水率固定在70%，發(fā)酵時(shí)間固定在4 d，設(shè)置發(fā)酵溫度為22 ℃、26 ℃、30 ℃、34 ℃、38 ℃；初始含水率固定在70%，發(fā)酵溫度固定在30 ℃，設(shè)置發(fā)酵時(shí)間為2 d、4 d、6 d、8 d、10 d。

（2）響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇初始含水率、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的優(yōu)化范圍，以鐵皮石斛葉對α-葡萄糖苷酶抑制活性為響應(yīng)值，優(yōu)化鐵皮石斛葉發(fā)酵工藝參數(shù)。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

發(fā)酵樣品取樣后進(jìn)行冷凍干燥、粉碎、過40目篩。稱取干燥粉末0.5 g，加入80%乙醇25 mL，50 ℃超聲提取2 h。離心取上清液，真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后加入7.5 mL二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）溶解，用于α-葡萄糖苷酶抑制活性分析。

α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定參照FRANCO等[16]的試驗(yàn)方法并稍進(jìn)行修改。用磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH值為6.8）配制活性為2.419 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶溶液和5 mmol·L-1的pNPG溶液。取PBS緩沖液3 mL、樣品溶液0.2 mL、α-葡萄糖苷酶液0.1 mL加入試管中，充分混勻，37 ℃孵育10 min后，加入PNPG 0.2 mL，充分混勻，37 ℃反應(yīng)30 min后，加入0.2 mol·L-1Na2CO3溶液1 mL終止反應(yīng)，然后在405 nm處測定吸光度，記為A1。相同條件下，用緩沖液代替酶溶液測定吸光值，記為A2，再取0.2 mL DMSO代替鐵皮石斛樣品測定吸光值，記為A3。抑制率按照公式抑制率=[1-(A1-A2)/A3]×100%進(jìn)行計(jì)算，以阿卡波糖（Acarbose，ACE）作為陽性對照并以阿卡波糖濃度為橫坐標(biāo)，α-葡萄糖苷酶抑制率為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=1 154x+1.736 8，R2=0.998 7，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線將樣品的抑制率轉(zhuǎn)化成阿卡波糖當(dāng)量，單位為mg ACE·g-1。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析采用方差分析(One-way ANOVA)、Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。Design Expert 12用于響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)基初始含水率

水分對微生物的生長、生物轉(zhuǎn)化和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生及分泌具有重大影響[17]。培養(yǎng)基的含水率通常在30%～85%，較低的濃度會導(dǎo)致微生物產(chǎn)生孢子，而較高的濃度會限制氧氣供應(yīng)并增加細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)[18]。如圖1所示，隨著培養(yǎng)基中初始含水率的增加，米曲霉發(fā)酵鐵皮石斛葉樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢，最適初始含水率為70%，在此條件下，發(fā)酵樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性最強(qiáng)。

圖1 初始含水率對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

2.1.2 發(fā)酵溫度

溫度是真菌生長和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的至關(guān)重要因素之一[19]。米曲霉屬于中溫菌，在30 ℃左右的環(huán)境下生長最好，過高或過低的溫度均會對其產(chǎn)生抑制作用[20]。由圖2所示，當(dāng)發(fā)酵溫度處于22～26 ℃時(shí)，發(fā)酵樣品對α-葡萄糖苷酶抑制活性較低。在培養(yǎng)過程中可以觀察到，相較于更高的溫度，米曲霉處于低溫時(shí)菌絲生長速度較為緩慢，表明較低的發(fā)酵溫度對米曲霉的生長代謝有抑制作用。當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，鐵皮石斛葉樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性達(dá)到最大值。隨著發(fā)酵溫度的升高，在34 ℃和38 ℃條件下，發(fā)酵過程初期米曲霉生長速度較快，但發(fā)酵后期可能由于溫度高，抑制了米曲霉生長，最終導(dǎo)致發(fā)酵樣品對酶抑制活性減弱。

圖2 發(fā)酵溫度對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵時(shí)間是影響固態(tài)發(fā)酵的重要因素之一[21]。圖3展示了鐵皮石斛葉經(jīng)米曲霉不同時(shí)間的發(fā)酵后對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，該指標(biāo)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在第2天后開始急劇上升，在第4天時(shí)達(dá)到峰值，此后逐漸下降。發(fā)酵初期，鐵皮石斛葉對α-葡萄糖苷酶抑制活性逐步提升，可能是由于微生物生長代謝活動旺盛，產(chǎn)生的一系列水解酶可以將植物細(xì)胞壁的纖維成分或者多酚、黃酮物質(zhì)與其他物質(zhì)之間結(jié)合的共價(jià)鍵破壞掉，促進(jìn)這類物質(zhì)的釋放和轉(zhuǎn)化[22]，活性成分含量增加，從而提高了發(fā)酵樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。發(fā)酵后期，微生物生長進(jìn)入消亡期，加上底物中的營養(yǎng)物質(zhì)被不斷消耗，導(dǎo)致發(fā)酵樣品對α-葡萄糖苷酶抑制活性下降。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

本試驗(yàn)在前期米曲霉發(fā)酵鐵皮石斛葉單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取了各因素的優(yōu)化范圍，進(jìn)一步確定米曲霉發(fā)酵鐵皮石斛葉的最優(yōu)發(fā)酵條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。利用Design Expert 12軟件，通過表2中葡萄糖苷酶抑制活性試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得鐵皮石斛葉酶抑制活性對編碼自變量初始含水率、發(fā)酵溫度和時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程為

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果表

從該模型的方差分析（表3）可見，本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.406 9），表明模型是可靠的，未知因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響較小。通過數(shù)據(jù)分析獲得的模型決定系數(shù)R2為0.990 9，表明樣品對α-葡萄糖苷酶抑制活性的實(shí)測值與預(yù)測值之間具有較好的擬合優(yōu)度，可用于鐵皮石斛葉發(fā)酵條件優(yōu)化的分析和預(yù)測。校正決定系數(shù)(R2adj=0.979 1)與預(yù)測決定系數(shù)（R2Pred=0.922 2）差值＜0.2，模型信噪比為25.1703＞4，表明該模型具有較好的相關(guān)性，可信度高，有良好的穩(wěn)定性與足夠的分辨力。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果表

由表3可知，因素B（發(fā)酵溫度）、因素C（發(fā)酵時(shí)間）、二次項(xiàng)A2、B2和C2的P＜0.05，表明這些都是模型的顯著項(xiàng)，都對米曲霉發(fā)酵鐵皮石斛葉樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性有顯著影響。根據(jù)F值，3種因素對發(fā)酵鐵皮石斛葉體外降血糖活性的影響大小依次為發(fā)酵時(shí)間（C）＞發(fā)酵溫度（B）＞初始含水率（A）。綜上可知，該模型可用于鐵皮石斛葉發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)的理論預(yù)測。

2.2.2 響應(yīng)面分析

基于回歸模型分析，通過各因素的兩兩相互作用，對米曲霉發(fā)酵鐵皮石斛葉降血糖能力進(jìn)行3D響應(yīng)面和等高線圖分析，建立三維模型圖，如圖4、圖5和圖6所示。響應(yīng)面開口向下凹越明顯，曲面越陡，表示響應(yīng)值對于因素的敏感性越高，因素間的交互作用越顯著，反之則交互作用不顯著；等高線圖的形狀差異代表各因素之間的相互作用的強(qiáng)度不同，等高線越接近圓形，相應(yīng)的因素之間的相互作用越弱。相反，等高線圖越近似橢圓形，各因素之間的相互作用越強(qiáng)[23]。由圖4可知，等高線接近圓形，說明初始含水率與發(fā)酵溫度的交互作用不顯著，對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響不顯著。如圖5所示，在初始含水率為70%～80%和發(fā)酵時(shí)間為4～6 d的條件下，米曲霉發(fā)酵鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性更高。如圖6所示，當(dāng)初始含水率不變時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高和發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵鐵皮石斛葉體外降血糖活性先增強(qiáng)后減弱。通過3D響應(yīng)面的曲面陡峭程度可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間對于發(fā)酵后鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性影響最為顯著。

圖4 初始含水率與發(fā)酵溫度的交互作用對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

圖5 初始含水率與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

圖6 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

2.2.3 發(fā)酵最優(yōu)工藝參數(shù)預(yù)測與模型驗(yàn)證

應(yīng)用Design-Expert 12軟件對二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行分析，得到米曲霉發(fā)酵鐵皮石斛葉最優(yōu)工藝為初始含水率71.90%，發(fā)酵溫度29.35 ℃，發(fā)酵時(shí)間4.40 d。在此條件下，預(yù)期的α-葡萄糖苷酶抑制活性為57.99 mg ACE·g-1。因考慮到實(shí)際操作情況，將其調(diào)整為初始含水率72%，發(fā)酵溫度29 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d。按照前述調(diào)整后的條件，開展5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，鐵皮石斛葉的α-葡萄糖苷酶抑制活性平均為（56.69±0.14）mg ACE·g-1，與理論預(yù)測值相比相對誤差為2.24%，表明該最優(yōu)工藝參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

α-葡萄糖苷酶的抑制是治療Ⅱ型糖尿病的策略之一，采用米曲霉CGMCC 23295固態(tài)發(fā)酵鐵皮石斛葉，可顯著提升其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，從而使其具有開發(fā)降血糖功能產(chǎn)品的潛力。米曲霉發(fā)酵鐵皮石斛葉的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為初始含水率72%，發(fā)酵溫度29 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d，鐵皮石斛葉的α-葡萄糖苷酶抑制活性達(dá)（56.69±0.14）mg ACE·g-1，較優(yōu)化前的樣品提升了31.3%。