李亞南 劉小勇

(1河南省中醫(yī)院周圍血管科,河南 鄭州 450003;2洛陽市第一中醫(yī)院周圍血管科)

糖尿病血管病變是一種高血糖持續(xù)的慢性血管系統(tǒng)疾病,長(zhǎng)期在高糖條件下,血管內(nèi)皮細(xì)胞功能代謝紊亂,與糖尿病的并發(fā)癥和發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),如神經(jīng)病變、腎病、心力衰竭和視網(wǎng)膜病變等〔1,2〕。糖尿病引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是糖尿病性周圍血管病變疾病發(fā)生的重要原因,長(zhǎng)期血糖濃度不穩(wěn)定,易造成血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)破壞,影響其正常功能〔3〕。薯蕷皂苷(DIO)具有護(hù)肝、調(diào)節(jié)糖尿病性周圍血管病變功能、降血脂、抗炎和抗腫瘤等藥理疾病〔4〕。DIO可以通過抑制Wnt通路進(jìn)而影響脂多糖誘導(dǎo)對(duì)大鼠系膜細(xì)胞MC增殖的作用〔5〕。蘇健等〔6〕研究結(jié)果顯示,DIO可以抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞EC的凋亡,進(jìn)而起到保護(hù)的作用,但是在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中的研究機(jī)制尚不清楚。程序性細(xì)胞死亡(PDCD)4位于染色體10q24上,是細(xì)胞凋亡因子,可以抑制細(xì)胞的凋亡〔7〕,PDCD4在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中表達(dá)上調(diào),下調(diào)PDCD4可以促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中增殖,抑制其細(xì)胞凋亡〔8〕。本研究通過選取HUVECs建立高糖模型,研究薯蕷皂苷通過調(diào)控PDCD4對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 HUVECs購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;DIO購(gòu)自廣州左克生物公司;葡萄糖購(gòu)自北京百歐博偉公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)、凋亡試劑盒自上海碧云天生物公司;PDCD4抗體、p21抗體、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;Trizol試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。si-NC、si-PDCD4、pcDNA和PDCD4購(gòu)自廣州瑞博公司;引物購(gòu)自上海吉瑪公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HUVECs常規(guī)復(fù)蘇后,置于培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃、5%CO2進(jìn)行培養(yǎng),且含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,并加入胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs調(diào)整密度至5×105個(gè)/ml后,接種到96孔板中,然后將HUVECs分組,分為對(duì)照組(加入葡萄糖濃度為5 mmol/L處理)、高糖組(加入葡萄糖濃度為30 mmol/L處理)、高糖+DIO-L組(加入DIO 5 μg/ml,進(jìn)行高糖處理)、高糖+DIO-M組(加入DIO 15 μg/ml,進(jìn)行高糖處理)、高糖+DIO-H組(加入DIO 30 μg/ml,進(jìn)行高糖處理),高糖+si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC后進(jìn)行高糖處理)、高糖+si-PDCD4組(轉(zhuǎn)染si-PDCD4后進(jìn)行高糖處理)、高糖+DIO+pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA后進(jìn)行高糖和DIO 30 μg/ml處理)、高糖+DIO+PDCD4組(轉(zhuǎn)染PDCD4后進(jìn)行高糖和DIO 30 μg/ml處理)。HUVECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作進(jìn)行,轉(zhuǎn)染48 h,收集HUVECs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 收集HUVECs,加入胰蛋白酶消化后,將重懸的細(xì)胞調(diào)整密度至5×104個(gè)/ml,接種到96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔以20 μl加入MTT溶液,然后繼續(xù)培養(yǎng)4 h,繼續(xù)加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μl,震蕩后在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞的光度值,并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集HUVECs,消化重懸細(xì)胞后,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/ml,然后加入500 μl磷酸鹽緩沖液。參照凋亡試劑盒說明書,分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和10 μl碘化丙啶(PI),15 min后在流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5Western印跡檢測(cè)PDCD4、p21、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 收集HUVECs,加RIPA蛋白裂解液,冰上反應(yīng)30 min后,提取各組細(xì)胞總蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)試劑檢測(cè)蛋白的濃度。然后將蛋白樣品上樣凝膠電泳處理后,轉(zhuǎn)膜后,脫脂牛奶封閉培養(yǎng)1.5 h。加入一抗PDCD4抗體、p21抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體,孵育過夜后,加入二抗,孵育2 h后,加入電化學(xué)發(fā)光液,顯影。通過Quatity One軟件蛋白條帶灰度值。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)PDCD4 mRNA的表達(dá) 收集HUVECs,通過Trizol法提取細(xì)胞的總RNA,檢測(cè)其RNA濃度,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后以cDNA模板按照熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參,通過2-△△Ct計(jì)算PDCD4 mRNA表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1DIO對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs增殖的影響 與對(duì)照組相比,高糖組細(xì)胞活力明顯降低,p21蛋白表達(dá)明顯增加(均P<0.05);與高糖組相比,高糖+DIO-L組、高糖+DIO-M組和高糖+DIO-H組細(xì)胞活力均明顯增加,p21蛋白表達(dá)均明顯降低(均P<0.05),見圖1、表1。

表1 DIO對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs增殖的影響

1～4:對(duì)照組、高糖組、高糖+DIO-L組、高糖+DIO-M組、高糖+DIO-H組;圖2同圖1 DIO對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞的p21蛋白的影響

2.2DIO對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs凋亡的影響 與對(duì)照組相比,高糖組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均明顯增加,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.05);與高糖組相比,高糖+DIO-L組、高糖+DIO-M組和高糖+DIO-H組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯增加(均P<0.05),見圖2、圖3、表2。因此,本研究以DIO濃度選取30 μg/ml進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 DIO對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs凋亡的影響

圖2 DIO對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡的影響

1～5:對(duì)照組,高糖組,高糖+DIO-L組,高糖+DIO-M組,高糖+DIO-H組圖3 Western印跡檢測(cè)各組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.3DIO對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs PDCD4表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,高糖組PDCD4 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05);與高糖組相比,高糖+DIO組PDCD4 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05),見圖4、表3。

表3 DIO對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs PDCD4表達(dá)的影響

圖4 DIO對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECsPDCD4蛋白表達(dá)的影響

2.4抑制PDCD4對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs增殖的影響 與對(duì)照組相比,高糖組的PDCD4、p21蛋白表達(dá)均明顯增加,細(xì)胞活力明顯降低(均P<0.05);與高糖+si-NC組相比,高糖+si-PDCD4組的PDCD4、p21蛋白表達(dá)均明顯降低,細(xì)胞活力明顯增加(均P<0.05),見圖5、表4。

表4 抑制PDCD4對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs增殖的影響

圖5 抑制PDCD4對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECsPDCD4、p21蛋白表達(dá)的影響

2.5抑制PDCD4對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs凋亡的影響 與對(duì)照組相比,高糖組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均明顯增加,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.05);與高糖+si-NC相比,高糖+si-PDCD4組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(均P<0.05),見圖6、表5。

表5 抑制PDCD4對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs凋亡的影響

1～4:對(duì)照組、高糖組、高糖+si-NC組、高糖+si-PDCD4組

2.6過表達(dá)PDCD4可以逆轉(zhuǎn)DIO對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs增殖、凋亡的影響 與高糖組相比,高糖+DIO組PDCD4蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)均明顯降低,細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(均P<0.05);與高糖+DIO+pcDNA組相比,高糖+DIO+PDCD4組PDCD4蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)均明顯增加,細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.05),見圖7、表6。

表6 過表達(dá)PDCD4可以逆轉(zhuǎn)DIO對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞增殖、凋亡的影響

1～4:高糖組、高糖+DIO組、高糖+DIO+pcDNA組、高糖+DIO+PDCD4組

3 討 論

糖尿病受遺傳、環(huán)境和飲食習(xí)慣等因素的影響,糖尿病引起的一系列糖尿病性周圍血管病變系統(tǒng)疾病并發(fā)癥嚴(yán)重威脅著人類的生命健康〔9,10〕。目前,中國(guó)糖尿病的患病率是世界上排行最高的,1990～2016年中國(guó)糖尿病患病率由3.7%上升至6.6%〔11〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞增殖和凋亡中處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài),如果血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡超過負(fù)荷,造成血管內(nèi)皮細(xì)胞抗凝功能受阻,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,是糖尿病血管疾病發(fā)病的主要原因〔12,13〕。DIO藥用價(jià)值很高,廣泛存在于薯蕷科、石竹科和百合科等植物中,在薯蕷科根莖中含量最高,具有消食利水、祛痰和舒筋活血等功效〔14〕。DIO在降低血糖方面效果作用明顯,研究結(jié)果顯示,DIO可以降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大鼠糖尿病血脂和氧化應(yīng)激,提高促胰液素GLP-1釋放〔15〕。吳貴福等〔16〕研究發(fā)現(xiàn),DIO可以明顯抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC凋亡和氧化損傷。本研究結(jié)果說明,DIO可以促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HUVECs的增殖和抑制其細(xì)胞凋亡。

PDCD4在糖尿病性周圍血管病變疾病、癌癥中廣泛表達(dá),是一種促凋亡的基因,可以通過基因轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制疾病的生長(zhǎng)和凋亡等過程〔17〕。鄭華峰等〔18〕研究結(jié)果顯示,miR-155通過調(diào)控PDCD4表達(dá)調(diào)控高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。在男性糖尿病并發(fā)癥的研究中發(fā)現(xiàn),PDCD4在高糖誘導(dǎo)的大鼠海綿體組織中高表達(dá),下調(diào)PDCD4表達(dá)可以抑制海綿體平滑肌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)其細(xì)胞增殖〔19〕,這與本研究結(jié)果相似。Zhang等〔20〕研究結(jié)果顯示,敲減PDCD4可以改善高糖誘導(dǎo)的糖尿病性周圍血管病變大鼠的胰島素抵抗和功能障礙,抑制心肌細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)。敲低PDCD4可以明顯促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的增殖,抑制其細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激〔21〕,這與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果說明PDCD4在糖尿病中發(fā)揮著重要的作用。DIO可以通過調(diào)控PDCD4影響高糖誘導(dǎo)的HUVECs增殖和凋亡。