趙華棟 李君 朱勇

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院,遼寧 錦州 121000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以老年人為主要發(fā)病人群的慢性氣流受限性疾病,目前其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,有研究發(fā)現(xiàn)肺組織細(xì)胞凋亡參與COPD的發(fā)生發(fā)展過程,COPD患者肺組織細(xì)胞凋亡數(shù)量增加進(jìn)一步導(dǎo)致了肺組織結(jié)構(gòu)的破壞和肺氣腫的形成〔1〕。他汀類藥物已被證實(shí)能夠減輕COPD肺部及系統(tǒng)性炎癥反應(yīng),然而對COPD肺組織細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制尚不十分明確。本研究通過鼻內(nèi)滴注煙草提取物和氣管內(nèi)滴入脂多糖(LPS)建立COPD模型,探討辛伐他汀對COPD大鼠肺組織細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量(240±20)g 30只,購于錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,許可證號:SCXK(遼)2017-0003,喂養(yǎng)于該校實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物房。辛伐他汀膠囊(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)四川海蓉藥業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號:19122910),LPS(Eshefichia coli 055:B5,美國Sigma公司);黃山牌香煙(安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,每只含焦油量:10 mg,煙氣煙堿量:0.9 mg,煙氣一氧化碳量:11 mg);膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI,聯(lián)科生物)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與建立模型 30只SD大鼠在動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,隨機(jī)分為對照組、COPD組、辛伐他汀組,每組10只。對照組:每周經(jīng)氣管內(nèi)滴入生理鹽水0.2 ml兩次,余時間正常喂養(yǎng);COPD組:在4 w內(nèi),每周5次經(jīng)鼻滴入煙草提取物〔自制,方法為每次連續(xù)點(diǎn)燃10支黃山牌香煙,去過濾嘴,進(jìn)氣口處的香煙煙霧在持續(xù)負(fù)壓下通過裝有4 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)的氣體收集瓶,待煙霧完全溶解后,用0.22 μm 的過濾器除去雜質(zhì)和細(xì)菌,然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。煙草提取物于每次實(shí)驗(yàn)前30 min制備〕0.3 ml和每周2次經(jīng)氣管內(nèi)滴入LPS 0.2 ml,每次操作結(jié)束后,對照組和COPD組在相同的環(huán)境中喂養(yǎng);辛伐他汀組:建立COPD模型方法同上,每次經(jīng)鼻滴入煙草提取物后,給予辛伐他汀灌胃治療,5 mg/kg,余步驟同COPD組。

1.3標(biāo)本采集 麻醉后將大鼠固定于平板后,暴露大鼠雙肺和心臟,將靜脈針插入右心室進(jìn)行灌流,用生理鹽水沖洗,然后取出大鼠左肺,用4%多聚甲醛固定,待后面行蘇木素-伊紅(HE)染色;右肺用液氮迅速冷凍后-80 ℃保存,待需要時提取蛋白質(zhì)。

1.4大鼠肺組織病理檢測 大鼠肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定72 h后,制作石蠟標(biāo)本后再行HE染色:脫蠟、染色、脫水透明、封片等,在顯微鏡下觀察肺組織病理變化并采集圖片。

1.5免疫組化法檢測大鼠肺組織中半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白的表達(dá) 將制作的石蠟切片脫蠟水化后,用蒸餾水清洗后進(jìn)行抗原熱修復(fù)、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、封閉,滴加一抗后放在4 ℃冰箱中過夜;第2天經(jīng)洗滌后加二抗,然后放在37 ℃恒溫箱中40 min;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液滴加顯色數(shù)分鐘,蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。以顯微圖像處理系統(tǒng),對染色陽性物質(zhì)(棕黃色顆粒)進(jìn)行平均光密度值測定,以平均吸光密度值表示caspase-3的相對含量。

1.6Western印跡法檢測大鼠肺組織中caspase-3蛋白的表達(dá) 從-80 ℃的冰箱取出冰凍的組織,冰上緩慢解凍后,每組取肺組織組織約50 mg放入干凈EP管,剪碎組織加入200 μl裂解液和2 μl蛋白酶抑制劑,冰上靜置30 min后放在離心機(jī)上離心后取上清液至新的EP管,即為蛋白提取物,通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量計算出蛋白濃度,配制分離膠、濃縮膠后逐個加樣進(jìn)行電泳(恒壓240 V,100 mA 30 min)、冰上電轉(zhuǎn)(恒流300 mA,約1 h)、常溫封閉(封閉液:2.5 g脫脂牛奶粉+50 ml TBST,1.5～2.0 h)、雜交、孵一抗搖床4 ℃過夜、孵二抗搖床上雜交1 h,最后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。

1.7流式檢測細(xì)胞凋亡 用70%的乙醇溶液將各組大鼠肺組織塊固定后,放在4 ℃保存。用生理鹽水將固定后的組織塊沖洗干凈后剪碎。放在100目的網(wǎng)上輕搓組織塊同時用 PBS沖洗后,收集沖洗液用300目的尼龍網(wǎng)過濾后,收集懸浮液,600 r/min離心10 min,將上清液吸除后,用PBS洗滌3 次后將細(xì)胞調(diào)整為每1 ml含105個細(xì)胞的懸浮液,取1 ml的細(xì)胞懸浮液,600 r/min離心10 min后加入結(jié)合緩沖液200 μl混合后,依次加入5 μl的PI和Annexin V-FITC,在避光條件下孵育20 min,加入200 μl的結(jié)合緩沖液,用500目的濾網(wǎng)過濾后60 min內(nèi)用流式檢測細(xì)胞凋亡。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組一般情況及體質(zhì)量變化比較 造模前,3組大鼠活潑程度、呼吸狀態(tài)、毛發(fā)色澤及外界反應(yīng)均無明顯差異;造模后,對照組活潑好動,呼吸正常,毛發(fā)光亮;COPD組、辛伐他汀組動作相對遲緩,反應(yīng)慢,呼吸較急促,毛發(fā)褶皺。3組體質(zhì)量在造模前無明顯差異(P>0.05)。造模后,COPD組和辛伐他汀組較對照組體質(zhì)量均明顯降低(P<0.05),辛伐他汀組較COPD組體質(zhì)量有增加,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 3組體質(zhì)量變化

2.23組肺組織HE染色 對照組氣管壁和肺泡結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)規(guī)則, 周圍未見炎性細(xì)胞浸潤,肺血管壁無增厚。COPD組可見各級氣管、支氣管壁增厚,氣管有纖毛粘連、倒伏,周圍有炎癥改變,肺泡擴(kuò)張,肺血管壁較對照組增厚。辛伐他汀組支氣管壁略增厚,結(jié)構(gòu)較完整,肺泡擴(kuò)張、肺血管壁增厚均較COPD組減輕。見圖1。

圖1 3組肺組織病理(HE染色,×400)

2.3免疫組化檢測各組肺組織中caspase-3平均吸光度 辛伐他汀組肺組織的caspase-3表達(dá)較COPD組顯著減少(P<0.05),而兩組caspase-3平均光密度均較對照組顯著增多(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 免疫組化檢測各組肺組織中caspase-3表達(dá)(HE染色,×400)

表2 各組肺組織 caspase-3平均光密度及蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡率比較

2.4Western印跡檢測各組肺組織中caspase-3蛋白的表達(dá) 辛伐他汀組肺組織中caspase-3蛋白表達(dá)較COPD組顯著減少(P<0.05),且兩組均較對照組顯著增多(P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 Western印跡檢測caspase-3在各組肺組織的表達(dá)

2.5流式細(xì)胞儀檢測各組肺組織細(xì)胞凋亡率 COPD組和辛伐他汀組肺組織早期細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增加(P<0.05),而辛伐他汀組肺組織早期細(xì)胞凋亡率較COPD組顯著降低(P<0.05)。見表2、圖4。

3 討 論

COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今尚未完全清楚,除了肺部的慢性炎癥、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激等起重要作用外〔2～5〕,研究表明,細(xì)胞凋亡也可參與COPD的發(fā)生和發(fā)展過程,在COPD的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位〔6,7〕。臨床研究發(fā)現(xiàn),COPD急性加重可能與細(xì)胞凋亡增加有關(guān),吸煙及慢性缺氧時可促進(jìn)肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡增加,同時機(jī)體氧化/抗氧化失衡也與細(xì)胞凋亡相關(guān)〔8〕。COPD患者體內(nèi)同時存在著肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肺內(nèi)炎性細(xì)胞凋亡異常,肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡異常引起COPD 患者肺實(shí)質(zhì)破壞增加,從而導(dǎo)致肺內(nèi)血管結(jié)構(gòu)重建,而炎性細(xì)胞凋亡異常引起炎細(xì)胞的肺內(nèi)異常浸潤并釋放炎性介質(zhì)引起免疫損傷〔9〕。有動物研究發(fā)現(xiàn),通過降低 COPD 小鼠的細(xì)胞凋亡率,能明顯提高免疫能力,縮短恢復(fù)期〔10〕。

caspase是細(xì)胞凋亡的核心,不同的刺激誘發(fā)凋亡過程激活的 caspase 不盡相同,但 caspase-3是caspase 級聯(lián)反應(yīng)的最終效應(yīng)子,是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。動物實(shí)驗(yàn)表明,COPD大鼠模型細(xì)胞凋亡率和caspase-3表達(dá)均明顯升高〔11〕,在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)COPD患者支氣管肺泡灌洗液的細(xì)胞凋亡指數(shù)及caspase-3的表達(dá)明顯高于健康志愿者〔12〕,由此推測caspase-3 在 COPD細(xì)胞增殖和凋亡的失衡中發(fā)揮著重要作用,最終導(dǎo)致 COPD 的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)論一致。

我們前期研究發(fā)現(xiàn),辛伐他汀可以減輕COPD大鼠肺組織及全身炎癥反應(yīng),降低肺組織氧化應(yīng)激損傷,改善COPD發(fā)生發(fā)展及預(yù)后〔13,14〕。辛伐他汀應(yīng)用于臨床治療COPD急性加重期患者也能夠減輕炎癥反應(yīng),提高氧分壓及改善患者肺功能〔15〕。本研究結(jié)果表明,辛伐他汀能夠通過減少 caspase-3蛋白表達(dá),減輕 COPD 大鼠肺組織細(xì)胞凋亡,為辛伐他汀在COPD的應(yīng)用進(jìn)一步提供了理論依據(jù)。