張慧明 楚振升 呂丹 劉爽

(佳木斯大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154002;2體育學(xué)院)

肝癌是全球第五大致命癌癥〔1〕,死亡率高。肝癌可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類,原發(fā)性肝癌起源于肝臟的上皮或間葉組織;而繼發(fā)性肝癌較為少見〔2〕。其中,肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌,占原發(fā)性肝癌患者的70%～90%〔3〕。在中國,每年新增或死亡的HCC患者約占病例總數(shù)和死亡總數(shù)的50%〔4〕。目前肝癌的治療方法有外科手術(shù)及藥物治療,但由于癌細(xì)胞不受控制的增殖和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致癌癥迅速發(fā)展;且藥物通常存在一系列副作用,極易產(chǎn)生腫瘤耐藥性,在臨床應(yīng)用上受到極大的限制,目前肝癌患者的長期生存率仍然很低。其中,對于HCC,肺轉(zhuǎn)移是HCC患者生存率低的主要原因之一〔5〕。因此,迫切需要闡明HCC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制,確定新的治療靶點(diǎn)以改善臨床治療療效。

microRNA(miRNA)是重要的非編碼RNA,通過結(jié)合mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因,發(fā)揮信號傳遞的生物學(xué)功能〔6〕。miRNA在腫瘤生物學(xué)中的重要性已得到廣泛認(rèn)可,且由于其特異的分子病理學(xué)特征,miRNA表達(dá)譜已成功用于分類不同腫瘤或腫瘤發(fā)展的不同階段〔7〕。有研究指出,miR-320a-3p過表達(dá)可以通過下調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3表達(dá)來抑制肺纖維化中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程〔8〕。miR-320a可通過沉默糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(GMEB)1的表達(dá)促進(jìn)EMT表型改變,抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲〔9〕。可見,miR-320a能夠通過影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)而影響腫瘤的發(fā)展,但是目前的研究暫未揭示miR-320a-5p對HCC的轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移的影響。因此,本研究通過開展體外試驗(yàn)探究miR-320a-5p對HCC的影響及其機(jī)制,以期為HCC的臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)和治療策略。

1 材料與方法

1.1臨床樣本采集 HCC患者腫瘤組織(HCC組)和相鄰組織學(xué)正常的組織(對照組)購于上海芯超公司。所有研究程序經(jīng)佳木斯大學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理 人正常肝細(xì)胞lo2、肝癌細(xì)胞系HepG2、Hcclm3細(xì)胞均購自中科院干細(xì)胞庫。將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(以色列,Bi),1%青-鏈霉素(博士德有限公司)的完全RPMI1640(美國,Gibco)中,37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱(美國,西蒙公司)培養(yǎng)。按照lipo3000(美國,Thermo)轉(zhuǎn)染步驟,對HepG2和Hcclm3細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性mimics、miR-320a-5p mimics、陰性pcDNA3.1、pcDNA3.1-Twist,將細(xì)胞分為NC mimics組、miR-320a-5p組、NC mimics+NC組、miR-320a-5p+NC組、NC mimics+Twist組、miR-320a-5p+Twist組。

1.3qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測 采用TRizol法提取癌組織、各處理組細(xì)胞總RNA,NanoDrop檢測RNA的濃度及純度。按照隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA(美國,Thermo)。按照SYBR GREEN試劑盒(日本,TaKaRa)說明對miR-320a-5p和Twist mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。以U6和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參,實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析,計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列:miR-320a-5p正向引物:5′-AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA-3′,反向:5′-GCCCUCUCAACCCAGCUUUUUU-3′;Twist正向引物:5′-GTCTCCGTCGCTTTCAGACGAT-3′,反向:5′-ACA-CGGAGAAGGCGTAGCTGAG;U6正向引物:5′-CT-CGCTTCGGCAGCACA,反向:5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT;GAPDH正向引物:5′-TCCCATCACCAT CTTCCA,反向:5′-CATCACGCCACAGTTTTCC。

1.4CCK8法檢測 將處理后對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板中103個(gè)/孔,分別培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入CCK8溶液(1∶9),于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀測定波長570 nm處吸光度(OD)值。

1.5細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 使用0.25%胰酶消化細(xì)胞,用含0.35%瓊脂糖的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,以1×105個(gè)/孔的密度接種于含0.6%瓊脂糖的6孔板中,置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)肉眼可見集落形成,終止培養(yǎng),0.1%結(jié)晶紫溶液染色,用倒置顯微鏡拍照并統(tǒng)計(jì)集落數(shù)量。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測 基質(zhì)膠包被Transwell小室上室,并置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置約30 min。在Transwell小室上室加入100 μl待測細(xì)胞懸液,在小室下室中加入700 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。37 ℃,5% CO2培養(yǎng)12～24 h,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗小室3次,用1%戊二醛固定小室30 min,擦去基質(zhì)膠及未侵襲的細(xì)胞,0.1%結(jié)晶紫染色。用PBS洗凈,干燥后正置顯微鏡觀察,隨機(jī)觀察6～10個(gè)視野,記錄每個(gè)視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7劃痕實(shí)驗(yàn)檢測 將細(xì)胞接種到六孔板中,分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。用10 μl無菌槍頭垂直于橫線劃痕。用PBS洗滌去除懸浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片。添加新鮮的無血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,用倒置顯微鏡拍照,并采用ImageJ軟件計(jì)算劃痕面積。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 通過生信網(wǎng)站預(yù)測miR-320a-5p與Twist的結(jié)合位點(diǎn),將miR-320a-5p與Twist結(jié)合部位的序列及其突變體序列插入螢火蟲熒光素酶基因下游構(gòu)建表達(dá)載體(美國,Promega)。將miR-320a-5p mimics與pmirGLO-Twist-WT/MUT重組質(zhì)粒,對照組mimics NC與Twist的野生型或突變型重組質(zhì)粒,利用Lipo3000轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.9Western印跡檢測 使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定提取蛋白的濃度。取20 μg蛋白加1×上樣緩沖液煮沸變性,通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白分離,且將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h后,加入一抗,4 ℃過夜孵育。次日洗膜3次,加入二抗,在溫室中孵育1 h。再洗膜3次后,加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影蛋白,置于凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像,采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度水平。以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GRAPHPAD9.0軟件進(jìn)行方差分析、獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-320a-5p mRNA在HCC組織及細(xì)胞中表達(dá)比較 在細(xì)胞中,與對照組miR-320a-5p表達(dá)水平(1.00±0.00)比較,HCC組細(xì)胞系HepG2、Hcclm3中miR-320a-5p表達(dá)水平(分別為0.28±0.12、0.62±0.06)顯著降低(均P<0.05),且在HepG2細(xì)胞中表達(dá)低,在Hcclm3中表達(dá)高。在組織中,與對照組(5.88±1.31)相比,HCC組miR-320a-5p mRNA表達(dá)水平顯著降低(4.61±1.00,P<0.001)。由此可知,miR-320a-5p可能參與了HCC的進(jìn)展。

2.2miR-320a-5p抑制HCC細(xì)胞增殖 與NC mimics組比較,miR-320a-5p組HepG2及Hcclm3細(xì)胞miR-320a-5p mRNA表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。CCK8和細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-320a-5p過表達(dá)后HCC細(xì)胞HepG2增殖能力在48 h顯著降低(P<0.05),HepG2及Hcclm3細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01),見表1、表2、圖1。

圖1 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力(結(jié)晶紫染色)

表1 兩組不同時(shí)間HCC細(xì)胞增殖能力

表2 兩組HCC細(xì)胞活力、遷移率、侵襲個(gè)數(shù)、miR-320a-5p mRNA及Twist表達(dá)比較

2.3miR-320a-5p抑制HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和EMT 在HepG2、Hcclm3細(xì)胞中,與NC mimics組比較,miR-320a-5p組細(xì)胞的侵襲、遷移能力顯著降低(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。見表2、圖2。Western印跡結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-320a-5p后,HepG2和Hcclm3細(xì)胞中E-鈣黏蛋白(cadherin)表達(dá)顯著升高,波形蛋白(Vimentin)表達(dá)水平顯著降低(P<0.001,P<0.01,P<0.05),見圖3、表3。以上數(shù)據(jù)表明miR-320a-5p參與抑制HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和EMT形成。

圖2 miR-320a-5p抑制HCC細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色,×100)、遷移(×100)

圖3 Western印跡檢測各組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 Western印跡檢測各組目的蛋白表達(dá)

2.4miR-320a-5p靶向Twist 通過生信網(wǎng)站預(yù)測可知,miR-320a-5p與Twist間存在互作序列(圖4)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HepG2、Hcclm3細(xì)胞中miR-320a-5p mimics可以顯著降低Twist的熒光素酶活性(P<0.001),證實(shí)miR-320a-5p可以靶向結(jié)合Twist,見表4。與對照組(3.66±1.15)比較,HCC組中Twist mRNA表達(dá)顯著升高(4.81±0.94,P<0.001)。在HepG2、Hcclm3細(xì)胞中,與NC mimics組比較,過表達(dá)miR-320a-5p后細(xì)胞中Twist表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。見表2。Pearson相關(guān)性分析證實(shí)miR-320a-5p和Twist在HCC中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.621 3,P=0.005 9)。見圖5。上述結(jié)果表明,Twist是miR-320a-5p的靶向基因。

圖4 miR-320a-5p與Twist的結(jié)合位點(diǎn)

圖5 miR-320a-5p和Twist在肝癌細(xì)胞中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

表4 HCC細(xì)胞相對熒光素酶活性

2.5miR-320a-5p通過靶向Twist抑制HCC的進(jìn)展 與NC mimics+NC組比較,NC mimics+Twist組細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力顯著升高(P<0.05,P<0.001)。與miR-320a-5p+NC組比較,miR-320a-5p+Twist組細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力顯著升高(P<0.01,P<0.05)。與NC mimics+Twist組比較,miR-320a-5p+Twist組細(xì)胞侵襲、遷移及24 h增殖能力顯著降低(P<0.001)。見表5、表6、圖6。以上結(jié)果說明,miR-320a-5p過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Twist對HCC細(xì)胞惡性生物學(xué)活動(dòng)的促進(jìn)作用。

圖6 miR-320a-5p逆轉(zhuǎn)Twist在HCC細(xì)胞的促腫瘤作用(結(jié)晶紫染色,×100)

表5 4組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較

表6 CCK8法檢測不同處理組HepG2細(xì)胞增殖

3 討 論

肝癌是最常見的侵襲性癌癥之一,其中HCC是最常見的原發(fā)性肝癌。雖然目前手術(shù)切除、化學(xué)療法和放射能夠被用于治療HCC患者,但由于HCC具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移性質(zhì),患者在術(shù)后往往會出現(xiàn)復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移或生存差的情況〔10〕。因此,迫切需要揭示HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,以開發(fā)新穎、有效的HCC治療策略。

miRNA作為癌癥中基因表達(dá)必不可少的表觀遺傳調(diào)控因子,通過與mRNA 3′-UTR結(jié)合導(dǎo)致mRNA降解或翻譯受阻〔11〕,在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮復(fù)雜多樣的功能。以HCC為例,Lu等〔12〕發(fā)現(xiàn),miR-124能夠通過靶向轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,進(jìn)而抑制HCC的生長;Hua等〔13〕發(fā)現(xiàn),miR-142-3p能夠靶向乳酸脫氫酶(LDHA)抑制糖酵解,從而抑制HCC細(xì)胞的增殖;Lin等〔14〕研究表明miR-122可以通過直接靶向內(nèi)源性凋亡調(diào)節(jié)因子B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-w的3′-UTR結(jié)合位點(diǎn),降低Bcl-w的mRNA和蛋白水平,抑制癌細(xì)胞活力,活化含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(caspase)-3而促進(jìn)凋亡。而正如前言所述,miR-320a-5p同樣被確定為在許多癌癥中能夠抑制腫瘤〔15〕,發(fā)揮不同功能角色,但目前在HCC中的作用及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。因此,本研究提示,miR-320a-5p與HCC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-320a-5p能夠顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞活力、遷移能力、侵襲能力和EMT形成。其中,EMT對于腫瘤轉(zhuǎn)移是必不可少的重要機(jī)制,具體表現(xiàn)為上皮細(xì)胞形狀顯著改變,獲得運(yùn)動(dòng)及浸潤能力及間充質(zhì)表型。目前認(rèn)為,EMT發(fā)生的主要標(biāo)志是E-cadherin表達(dá)降低、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)升高,引起腫瘤細(xì)胞的黏附分子結(jié)構(gòu)功能異常,腫瘤細(xì)胞間的黏附能力下降,運(yùn)動(dòng)能力增加,腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生浸潤或轉(zhuǎn)移。這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。這些數(shù)據(jù)共同證實(shí)miR-320a-5p能夠抑制HCC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及EMT形成,進(jìn)而抑制HCC體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移。

Twist是twist家族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子1,是EMT關(guān)鍵的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子,通過上皮表型相關(guān)基因和上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞表型相關(guān)基因來調(diào)控EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄〔16〕,參與促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖、轉(zhuǎn)移,具有抗凋亡作用,并與癌癥干細(xì)胞表型相關(guān)〔17〕。Grzegrzolka等〔18〕指出,Twist在乳腺癌高表達(dá),激活EMT趨勢,是原位乳腺癌發(fā)展為侵襲性形式的關(guān)鍵。而在HCC方面,Meng等〔19〕指出,Twist通過Circular RNA-Cul2上調(diào)Vimentin,促進(jìn)HCC的EMT趨勢,說明Twist是介導(dǎo)EMT進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。本研究發(fā)現(xiàn),Twist在HCC中上調(diào),提高HCC的EMT趨勢。通過生物信息學(xué)預(yù)測分析和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到,miR-320a-5p可靶向Twist蛋白,且二者表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)趨勢。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn),Twist會促進(jìn)HCC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移,而miR-320a-5p能夠逆轉(zhuǎn)Twist對腫瘤的促進(jìn)作用。由此可知,miR-320a-5p通過靶向Twist抑制HCC的轉(zhuǎn)移和EMT。

致謝:黑龍江省北藥與功能食品優(yōu)勢特色學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目、佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供資助!